Summary
Beschrieben wird eine zeit- und platzsparende Methode zur Zählung von Eiern und zur Bestimmung der Brutraten einzelner Mücken anhand von 24 Brunnengewebekulturplatten, die den Umfang und die Geschwindigkeit von Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests erheblich erhöhen können.
Abstract
Mücken stellen ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit als Vektoren verschiedener Krankheitserreger dar. Für Studien, die eine Bewertung der Mückenfitnessparameter, insbesondere der Eiproduktion und der Schraffurraten auf individueller Ebene, erfordern, haben herkömmliche Methoden die Forscher aufgrund der hohen Arbeitsintensität und des Laborraumbedarfs erheblich belastet. Beschrieben wird eine einfache Methode mit 24 Brunnengewebe-Kulturplatte mit Agarose in jedem Brunnen und digitale Bildgebung von jedem Brunnen, um Eizahlen und Schraffurraten auf individueller Ebene mit erheblich reduziertem Zeit- und Platzbedarf zu bestimmen.
Introduction
Die Bekämpfung von Stechmücken zum Schutz des Menschen vor vektorübertragenen Krankheitserregern ist ein wichtiges Ziel für die öffentliche Gesundheit, vor allem aufgrund des Mangels an wirksamen Impfstoffen für die meisten Von Mücken übertragenen Krankheitserreger. Viele Studien zielen darauf ab, die Mückenfitness in Verbindung mit einer feldtauglichen Bevölkerungsreduktionsstrategie1,2,3zureduzieren. Dazu gehören umfangreiche Studien zur Herstellung transgener Mücken und/oder CRISPR/Cas9-Knockout-Linien. Solche Ansätze zur Bevölkerungsmodifikation erfordern eine detaillierte Bewertung der einzelnen Fitnessparameter4. Herkömmliche Labortechniken zur Beurteilung der Tauglichkeit weiblicher Mücken umfassen die individuelle Eindämmung von gepaarten, blutgefütterten weiblichen Mücken in 100 ml Behältern5, modifizierte 50 ml konische Schläuche oder Röhren für die Drosophila-Aufzucht modifiziert durch bereitstellung feuchter Oberflächen mit feuchter Baumwolle und Filterpapierscheiben für die Eioposition (d.h. Eipapiere)1,2,6,7. Solche Methoden erfordern einen relativ großen Raum (z.B. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H für bis zu 100 Drosophila-Röhren) (Abbildung 1) und die Manipulation einzelner Eipapiere zum Zählen von Eiern und Brutlarven, die arbeitsintensiv sein können. Dieses Manuskript stellt eine Methode zur Zählung von Mückeneiern und zur Bestimmung der Schraffurraten anhand von 24 Brunnenplatten und Agarose als Eileiteroberfläche dar, um diese Probleme zu umgehen8.
Gleichzeitig beschrieben Ioshino et al.9 eine detaillierte Methode mit 12 und 24 Brunnenplatten zur Durchführung von Eizählungen, die von einzelnen Weibchen erhalten wurden. Ihr Protokoll stellte eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden bei der Einsparung von Zeit und Platz9dar. Das von ihnen beschriebene Protokoll verwendet jedoch weiterhin nasses Filterpapier als Oberfläche für die Eileiterung, die das Entfalten jedes einzelnen Papiers erfordert, um Zählungen zu erhalten, da Eier oft unter oder in Falten gefunden werden. Ihr Protokoll enthielt auch nicht den Einsatz von Bildgebungstechnologien oder eine Methode zur Larvenzählung.
Präsentiert wird eine verbesserte Methode zur Durchführung von Fitness-Assays für Eizahl (d.h. Fruchtbarkeit) und Schraffurrate (d.h. Fruchtbarkeit) mit Agarose als Ovipositionsoberfläche in einem 24-Well-Gewebe-Kultur-Plattenformat für Ae. aegypti, das auf feuchten Oberflächen oviposit. Diese Platten wurden "EAgaL" Platten genannt, von Egg, Agarose, und Larva. Diese 24 Brunnenplatten bieten einzelnen Mücken eine minimale Oberfläche zum Legen von Eiern, wodurch die Zeit und der Aufwand für die Zählung und Pflege von Eiern und geschlüpften Larven für einige Tage vereinfacht und drastisch reduziert werden. Die EAgaL-Platte verwendet transluzente Agarose für die Eileiteroberfläche, die den Umgang mit Eipapieren und das Auffinden der Eier und Larven beim Schlüpfen überflüssig macht; Das Fotografieren jedes Brunnens erstellt eine langfristig archivierte Aufzeichnung der Ergebnisse und trennt den Zählprozess sowohl zeitlich als auch räumsfrei vom Aufzucht-/Handlingprozess, bei dem die Zeit oft begrenzt ist.
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Protocol
1. Plattenvorbereitung
- Bohren Sie Löcher in 24 Brunnengewebekulturplattendeckel (4 x 6 Löcher pro Bohrloch) mit einem Haushaltsbohrer mit einem Bit von 1,6 mm (1/16 in)(Abbildung 2).
HINWEIS: Diese Löcher verhindern, dass sich Wasserkondensation aus Agarose auf dem Deckel ansammelt, wo Mücken Eier legen können. Die Standardgröße der weiblichen Ae. aegypti ("Liverpool"-Sorte) beträgt eine Spannweite von 3,11 mm. Es wird empfohlen, die Größe der Löcher zu reduzieren, wenn kleinere Mücken verwendet werden, um ein Ausweichen aus der Platte zu vermeiden. - Am Tag vor dem Eileiterexperiment die Platten gründlich waschen und abspülen und bei Raumtemperatur in 1 bis 5% Bleichmittel einweichen. Unter laufendem entionisiertem Wasser gründlich abspülen und trocknen.
HINWEIS: Dieser Prozess verringert die Wahrscheinlichkeit, dass Pilze und Bakterien auf Agarose wachsen. - Schmelzen Sie Agarose bei 2% in entionisiertem Wasser und fügen Sie sofort 500 l der geschmolzenen Agarose zu jedem Brunnen der 24 Brunnenplatten mit einer 1.000 l Pipette hinzu (Abbildung 3A,B). Wenn die Agarose zu kühlen beginnt und die Pipettenspitze verstopft, erhitzen Sie die Agarose und verwenden Sie eine neue Pipettenspitze.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Wände des Brunnens mit der Pipettenspitze zu berühren, da es ein Stück Agarose an der Wand hinterlassen kann, wo ein Weibchen Eier legen kann, was den Bildgebungs- und Zählprozess erschwert. - Trocknen Sie vor dem Gebrauch über Nacht auf einer Laborbank kondensieren Sie die Kondensation an den Brunnenwänden aus (Abbildung 3C,D).
ANMERKUNG: Die Zeitleiste des EAgaL-Platten-Assays von der Blutfütterung bis zur Larvenbildgebung ist in Abbildung 4dargestellt, die für Koloniemücken (Ae. aegypti "Liverpool" unter 14 h Licht: 10 h dunkles Lichtzyklus, 27 °C, 80% relative Luftfeuchtigkeit, 500 Larven in einem 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm Tablett mit 2 L Wasser) unter insektenbedingter Bedingungen ist. Es wird empfohlen, dass jedes Labor die EAgaL-Platte mit den verwendeten Mücken testet, insbesondere bei Verwendung verschiedener Stämme, verschiedener Mückenarten sowie verschiedener Aufzuchtprotokolle.
2. Mückenfütterung
HINWEIS: Es ist wichtig, Mücken zu verwenden, die unter einheitlichen Bedingungen für alle Behandlungsgruppen und Kontrollgruppen aufgezogen werden, da die Larvenernährung Auswirkungen auf die Fitnessparameter von Mücken10,11hat. Hintere Larven unter nicht überfüllten Bedingungen mit ausreichend Nahrung. Lassen Sie weibliche Mücken in Gegenwart von Männchen ausschließen, so dass die Paarung gewährleistet ist, und reifen für mindestens 3 Tage.
- Entfernen Sie alle Wasser- und/oder Zuckerquellen von den weiblichen Mücken mindestens 16 h vor der Blutfütterung, um die Blutfütterung zu verbessern.
- Erhitzen Sie einen Wasserzirkulator für die künstliche Fütterung bei 37 °C und füttern Sie weibliche Mücken mit Wirbeltierblut, das in künstlichen Feedern für 15 bis 30 min platziert wird (Abbildung 5A).
- Mücken mit CO2 oder auf Eis anästheisieren, auf Eis in eine Glasschale übertragen und mit Blut engorged (Abbildung 5B) in einen Behälter mit 30% Saccharosewasser für mehr als 72 h, wenn Weibchen die Ausscheidung und Eientwicklung beenden.
HINWEIS: Wenn die Weibchen mit einer geringeren Konzentration von Saccharosewasser versorgt sind, entfernen Sie das Saccharosewasser und alle nassen Oberflächen nach 48 h, um zu verhindern, dass die Weibchen sich ovipositieren.
3. Oviposition
- Etwa 1 h vor der Übertragung von Mücken auf die Platten, fügen Sie 2-3 Tropfen (80 x 120 L) Wasser in jede Platte brunnen mit einer Transferpipette.
- Mindestens 72 h nach der Blutfütterung, Knockdown-Mücken mit CO2 oder auf Eis, übertragen Sie sie auf eine Glasschale auf Eis, und legen Sie jede Mücke einzeln auf einen umgekehrten Deckel der 24 Brunnenplatte auf Eis(Abbildung 6A).
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von Ioshino et al.9angewendet. - Sobald alle 24 Mücken platziert sind, bedecken Sie den Deckel mit einem umgekehrten Plattenboden (Abbildung 6B), sichern Sie den Deckel und die Platte mit einem frischen, neuen Gummiband und legen Sie sie in eine Umweltkammer (oder Aufzuchtraum)(Abbildung 6C), bis sich die Mücken erholen (10 €15 min) und drehen Sie die Platte nach rechts (Abbildung 6D).
- Lassen Sie die weiblichen Mücken für 24-48 h oviposit und entfernen Weibchen, indem Sie sie von den Platten in einen großen Käfig.
HINWEIS: Wenn es wichtig ist, den Überblick über einzelne Weibchen zu behalten, befeuchten Sie sie, indem Sie die Platten kühlen und einzeln auf Eis entfernen. Verzögerte Eizellen und dunkle Ausscheidungen, die die Eizählung stören, wurden beobachtet, wenn Weibchen vor 72 h nach der Blutmahlzeit (PBM) auf die Teller übertragen wurden (Abbildung 7D).
4. Eierzählung
- Überprüfen Sie jeden Brunnen der 24 Brunnenplatte, da manchmal Mücken Eier an der Wand von Brunnen und am Rand der Agarose/Kunststoffoberfläche legen, wo sie schwer in Fotografien zu lösen sind. Mit einem nassen Pinsel die an der Wand und am Rand der Agarose gelegten Eier auf die flache Oberfläche der Agarose bewegen, so dass sich alle Eier in einer einheitlichen Ebene befinden und sich nicht überlappen.
HINWEIS: Die Kante der Agarose ist aufgrund der Oberflächenspannung der Agaroselösung typischerweise atypisch aus der Fokusebene der Kamera. - Entfernen Sie mit Zangen alle gebrochenen Beine, Flügel und andere Partikel in den Brunnen, die bildgebende Eier stören können (Abbildung 7C).
- Legen Sie weißes Papier unter die Platte, um den Kontrast zu dunklen Mückeneiern vor der Bildgebung mit einem Stereomikroskop-Beleuchtungsgerät zu erhöhen (Abbildung 7A).
- Nehmen Sie ein Bild von jedem Brunnen mit einer kompakten Digitalkamera im Mikroskop-Modus, die es dem Benutzer ermöglicht, sich auf Objekte in der Nähe von 1 cm zu konzentrieren. Diese Funktion ermöglicht es, die Kamera direkt auf dem Teller zu platziert werden, um Eier ohne Stativ oder Ständer abzubilden (Abbildung 7A). Um einzelne In Klumpen gelegte Eier zu unterscheiden, verwenden Sie den feinen oder superfeinen Modus, um hochauflösende Bilder zu erfassen, so dass Nahaufnahmen sichtbar werden können.
HINWEIS: Löschen Sie die Speicherkarte der Kamera vor der Verwendung, um Verwechslungen zwischen neuen und alten Bildern zu vermeiden. - Nachdem Sie jeden Brunnen einer Platte fotografiert haben, nehmen Sie ein Bild der gesamten Platte mit einem bildgebenden Auftragsetikett auf, um jede Platte später zu unterscheiden(Abbildung 7E).
- Fügen Sie jedem Brunnen eine dünne Schicht von 5 Tropfen Wasser (ca. 200 L) mit einer Transferpipette hinzu, um zu verhindern, dass ihr Agarose-Stecker und die Eier trocknen, und um die Entwicklung und Dasbrüchierung des Embryos zu induzieren. Achten Sie auf die Wasserstände für die ersten Stunden und überprüfen Sie jeden Tag, da es Wasserverlust durch Absorption durch die Agarose oder Verdunstung geben kann. Fügen Sie Wasser hinzu, wenn der Pegel zu niedrig ist, damit die Larven schlüpfen können.
HINWEIS: Die Verdunstung von Wasser erfolgt ungleichmäßig sowohl innerhalb einer Platte als auch innerhalb eines Plattenstapels. Es wurde beobachtet, dass die Trocknung in der folgenden Reihenfolge erfolgt: 1) Eckbrunnen (A1, A6, D1, D6) trocknen am schnellsten; gefolgt von 2) Brunnen am äußeren Rand der Platte (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); und letzten 3) Brunnen im Inneren. Wenn Platten gestapelt werden, trocknet die obere Platte am schnellsten. - Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer mit ImageJ (Fidschi) und benennen Sie die Dateien für eine einfachere Organisation um, z. B. "[Platten-ID]_[well ID].jpg" (Abbildung 8A,B).
- Erstellen Sie eine Tabellenkalkulationsdatei, um Eierzahlen (d. h. Fruchtbarkeit) und Larvenzahlen aufzuzeichnen und die Schraffurrate (d. h. Fruchtbarkeit) zu berechnen (Abbildung 9E).
- Öffnen Sie die Bilder mit ImageJ (Fiji)12 und verwenden Sie das "Multi-Point"-Tool, um jedes Ei zu markieren (Abbildung 9A-C); Zoom-in oder Zoom-out mit "+" oder "-" Taste, um die Eier in Klumpen zu zählen. Nachdem Sie alle Eier markiert haben, doppelklicken Sie auf das Mehrpunktsymbol, um die Anzahl der Markierungen(Abbildung 9D)anzuzeigen. Zeichnen Sie die Ergebnisse in einer Kalkulationstabelle auf.
5. Fertilitätsbewertung
HINWEIS: In 2 Tagen können die ersten Instar-Larven beginnen, sich in den Brunnen zu schließen. Warten Sie noch 3 bis 5 Tage, bevor Sie sich bildgeben/zählen, um sicherzustellen, dass alle lebensfähigen Eier schlüpfen.
- Bereiten Sie Larvenfutter vor, indem Sie 1/16 Esslöffel (ca. 168 mg) gemahlener Fischfutter (d. h. normale Mückenlarvendiät) in 20 ml Wasser mischen und darauf warten, dass sich große feste Partikel absetzen(Abbildung 10A-D). Beginnen Sie, Nahrung (der Überstand) zu den Brunnen hinzuzufügen, die geschlüpfte Larven enthalten, sobald sie erscheinen, weil sie nicht lange ohne Nahrung überleben.
HINWEIS: Eine übermäßige Zugabe von Lebensmittelpartikeln kann die Bildgebung und das Zählen von geschlüpften Larven beeinträchtigen. - Etwa 5–8 Tage nach Zugabe von Wasser in die Brunnen, kühlen Sie die Platte durch Bedecken mit zerkleinertem Eis für 15-20 min, um Larven zu besanten.
- Nehmen Sie Bilder von jedem Brunnen, während Die Teller auf Eis zu halten, wie mit den Eiern getan wurde. Für Larvenbilder, bieten einen dunklen Hintergrund durch Einfügen eines schwarzen Materials unter der Platte, um den Kontrast zu verbessern. Nachdem Sie jeden Brunnen einer Platte fotografiert haben, nehmen Sie ein Bild der gesamten Platte mit einem bildgebenden Auftragsetikett auf, um die einzelnen Platten später zu unterscheiden.
HINWEIS: Bilder werden aufgenommen, während die Platten auf Eis sind, weil die Larvenbewegung die Zählung beeinträchtigen kann. Die Platten sind wiederverwendbar; die Mücken und Agarose einfrieren und entfernen, um sie für den nächsten Gebrauch zu reinigen. Die EAgaL-Platte eignet sich nicht für die Aufzucht von Larven in fortgeschrittene Stadien. - Öffnen Sie Bilder mit ImageJ (Fidschi) und verwenden Sie das "Multi-Point"-Tool, um zu zählen, indem Sie auf jede Larve klicken. Während des Zeitraums von 3 bis 5 Tagen können einige Larven geschmolzen sein, vor allem in Brunnen mit geringer Anzahl von Larven. Daher, beim Zählen, schließen Sie die Schuppen-Kinekulen (d.h. Exuviae), die wie Kopf-nur Larven mit ein wenig Körper aussehen, oder geschrumpfte Larven (Abbildung 10E). Zeichnen Sie die Ergebnisse in der Kalkulationstabelle auf.
6. Analyse durchführen
- Nachdem alle notwendigen Daten für die Fecundity- und Fruchtbarkeitsanalyse gesammelt wurden, führen Sie geeignete statistische Analysen durch und erstellen Sie Diagramme mit bevorzugter Software.
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Representative Results
Mücken wurden mit dsRNA injiziert, die auf einen Kandidateneisentransporter (FeT) oder ein Kontrollgen (EGFP) abzielten, das mit Blut gefüttert wurde, und nach dem oben beschriebenen Verfahren auf Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeitsleistung gemessen.
Mücken, bei denen die FeT-Expression nach der dsRNA-Injektion zum Schweigen gebracht wurde, zeigten eine signifikante Verringerung sowohl der Eizahl als auch der Schraffurrate (Abbildung 11A- C). Alle Kontroll- und Behandlungsmücken wurden nach 72 h PBM in die EAgaL-Platten gelegt. FeT-stille Mücken zeigten auch verzögerte Ausscheidung und kleine und helle Eier (Abbildung 12A,B). Beispielergebnisse finden Sie auch in Tsujimoto et al.8.
Abbildung 1: Fliegenröhren, die häufig für Mücken-Fecundity-/Fruchtbarkeitstests verwendet werden. (A) Ein einzelnes Rohr mit feuchter Baumwolle und kreisförmigem Filterpapier mit Schwammkappe. (B) 100 Rohre in einem Gestell (ca. 30 cm x 30 cm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bohren von Löchern in einem Deckel von 24 Brunnengewebe Kulturplatte. (A) Bohren in Bearbeitung. (B) Ein Deckel mit Löchern, die Kondensation verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auftragen von Agarose (2% in Wasser) in die Brunnen. (A) Auftragen von Agarose mit einer 1.000-L-Pipette. Beachten Sie, dass die Spitze nicht die Wand des Brunnens berührt. (B) Eine Platte mit Agarose auf der Unterseite. (C) Wand eines Brunnens rechts nach Agarose verfestigt. Beachten Sie die Kondensation an der Wand. (D) Wand eines Brunnens, wenn Kondensation verdampft ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zeitleiste von der Blutfütterung (Tag 0) bis zur Larvenbildgebung (Tag 10-13). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Künstliche Blutfütterung und Auswahl von verstrickten Weibchen. (A) Blutfütterung mit künstlichem Feeder. (B) Auswahl der verstrickten Weibchen auf Eis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Übertragung von Weibchen auf EAgaL-Platte. (A) Anästhesisierte Weibchen auf einen invertierten Plattendeckel auf Eis übertragen. (B) Legen Sie dann die invertierte Agarose-haltige Platte vorsichtig auf den invertierten Deckel und (C) entfernen Sie die Platte mit Deckel, der vom Eis befestigt ist, und halten Sie sie in umgekehrter Position, bis sich die Weibchen von der Anästhesie erholt haben. (D,E) Drehen Sie die weiblich enthaltende Platte in die Aufwärtsposition. Beachten Sie, dass Deckel und unterer Teil der Platte durch ein Gummiband gehalten werden und dass der untere Teil beschriftet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Bildgebung jedes Brunnens nach dem Entfernen von Weibchen. (A) Digitalkamera auf einer eihaltigen 24-Well-Platte zur Bildgebung. (B) Typisches Bild eines Brunnens. (C) Ein Brunnen, der ein Bein enthält, das entfernt werden muss. (D) Beispielbild eines Brunnens, in dem ein Weibchen bei 48 h PBM platziert worden war. Beachten Sie die dunklen Ausscheidungsmarkierungen, die die Eizählung (Pfeile) erschweren können. (E) Ganze Platte mit einem bildgebenden Auftragsetikett, das nach der Abbildung aller Brunnen der Platte erstellt wurde. Dies hilft, Brunnen während der Analyse zu erkennen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Umbenennen der Bilder für eine bessere Organisation. (A) Bilder von einzelnen eihaltigen Brunnen mit einem Bildauftragsetikett mit den von der Kamera automatisch zugewiesenen Namen. (B) Dieselben Bilder werden mit plateID_wellID.jpg Format umbenannt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Zählen von Eiern mit der Software "Fiji" (ImageJ2). (A) Screenshot der Fidschi-Software, die das "Multi-Point" Tool hervorgehoben (türkises Quadrat). (B) Ein gut bildweises Bild mit Fidschi-Zählmarken auf den Eiern. (C) Das Zoomen hilft beim Zählen größerer Eiergruppen. (D) Doppelklick auf das" Multi-Point" Werkzeugsymbol im Hauptfenster zeigt die Anzahl (roter Kreis). (E) Ein Beispiel für eine Kalkulationstabelle mit Berechnungsformel für Schraffurraten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Larval-Diät-Präparat und ein Brunnen, der Larven und Exuvia enthält. (A) Gemahlenes Fischfutter. (B) 20 ml Wasser in einer Tasse. (C) Mischung aus gemahlenem Fischfutter und Wasser. (D) Nahrung/Wasser für 15 min abgesetzt. Nehmen Sie Überstand dieser Mischung als Larvenfutter. (E) Gut mit geschmolzenen Larven; repräsentative Exuviae werden durch Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 11: Zählen Sie Daten aus einem Gen-Silencing-Experiment. Stechmücken, die mit dsRNA gegen den vermeintlichen Eisentransporter (FeT) injiziert wurden, wiesen eine signifikante Verringerung der (A) Eizahl, (B) Larvenzahl und (C) Schraffurrate im Vergleich zur Kontrolle (EGFP) auf. Balken zeigen bedeuten ± SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 12: Repräsentative Bilder der Brunnen, die zusätzliche Phänotypen in genstillenden Mücken zeigen. dsFeT zeigte eine verzögerte Ausscheidung (dunkelbraune Flecken) und kleine, leicht gefärbte Eier. Für jede Behandlung werden zwei repräsentative Brunnen gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Ft | EAgaL | |
| (1) Vorbereitung | 20 min 29,0 sek. | 3 Min. 49,3 Sek. |
| (2) F_in | 3 min 55.0 sec | 1 min 56,0 sek. |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44,3 sek. | 15 Min. 28,3 Sek. |
| (4) L_img | 38 Min. 03,5 Sek. | 9 Min. 30,5 Sek. |
Tabelle 1: Zeitbedarf für die Fertigstellung des Fliegenrohrverfahrens (FT) im Vergleich zur EAgaL-Plattenmethode. (1) Vorbereitung: Zeit, die benötigt wird, um Baumwolle einzulegen, Wasser hineinzugießen und Filterpapierscheibe in Drosophila-Aufzuchtrohre (FT) einzufügen, anstatt Agarose in Brunnen von 24 Brunnenplatten (EAgaL) zu gießen. (2) F_in: Zeit, die benötigt wird, um einzelne Mücken in Aufzuchtröhrchen (FT) oder Brunnen der 24 Brunnenplatte (EAgaL) zu platzieren. (3) F_out/E_img: Zeit, die benötigt wird, um Mücken in einen größeren Käfig freizusetzen, Eipapier zu entfernen, zu entfalten und die Eier auf dem Papier (FT) abzubilden oder Mücken in einem größeren Käfig freizusetzen und jeden Brunnen der 24 Brunnenplatte (EAgaL) abzubilden. (4) L_img: Zeit, die benötigt wird, um Larven, die in einem kleinen Behälter (FT) oder jedem Brunnen der 24 Brunnenplatte (EAgaL) nach Kaltanästhesie geschlüpft sind, abzubilden. Insgesamt wurden 24 Röhren für FT verwendet.
| Massenkosten | |||||
| EAgaL Platte | Fliegenrohre | ||||
| Artikel | Preis | Menge | Artikel | Preis | Menge |
| 24-Well-Platten | $45.61 | Fall 50 | Chromatographie Papierbögen | $103.63 | 46 × 57 cm 100 Blatt/PK |
| Agarose | $250.97 | 500 Gramm | Fliegenrohrträger + Rohre | $68.45 | 5 Schalen zu 100 |
| Olympus TG-6 | $375.00 | Fly-Rohr-Stecker | $66.10 | Fall 200 | |
| Baumwollkugeln | $104.27 | Fall 2000 | |||
| Startup-Gesamtsumme | $671.58 | Startup-Gesamtsumme | $342.45 | ||
| Stückkosten (eine 24-Well-Platte oder 24 Röhren) | |||||
| EAgaL Platte | Fliegenrohre | ||||
| Artikel | Preis | Hinweis | Artikel | Preis | Hinweis |
| eine 24-Well-Platte | 0,91 $ | Massenpreis/50 | Chromatographie Papierbögen | 0,16 $ | 641,7 Sätze mit 24 Rohren im Wert(2) |
| Agarose pro Platte | 0,15 $ | 500g= 1667 Platten(1) | Fliegenrohrträger + Rohre | 3,29 $ | (Massenpreis/500) × 24 |
| Fly-Rohr-Stecker | 7,93 $ | (Massenpreis/200) × 24 | |||
| Baumwollkugeln | 1,25 $ | (Massenpreis/2000) × 24 | |||
| Einheit insgesamt | 1,06 $ | Einheit insgesamt | $12.63 | ||
Tabelle 2: Kostenvergleich zwischen EAgaL-Platte und FT. Oben: Massenkosten für den Start (vorausgesetzt, ein Bohrer und ein Bohrer können von einem Forscher zur Verfügung gestellt werden). Unten: Geschätzte Kosten für eine 24-Well-Platte (EAgaL-Platte) und 24 FT. (1) Vorausgesetzt, eine Platte benötigt etwas mehr als gerade genug für eine 24-Well-Platte (12ml), 15 ml von 2% = 0,3 g Agarose pro Platte, insgesamt 500 g Agarose können 1.667 Platten bilden. (2) Ein Blatt Papier kann 154 von Scheiben mit einem Durchmesser von 38 mm herstellen. Mit 100 Blatt können 641,7 (15.400/24) Sets mit 24 Rohren hergestellt werden.
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Discussion
Die EAgaL-Platte reduziert Arbeit, Zeit und Raum drastisch, um individuelle Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests in Aedes aegypti im Vergleich zur FT-Methode durchzuführen. Ein vorläufiger Vergleich zwischen der FT-Methode und der EAgaL-Platte führte zu kürzeren Zeiten für alle Schritte (imaging technique wurde auf die FT-Methode angewendet) (Tabelle 1). Als Referenz ist in Tabelle 2eine Schätzung der Anlauf- und Pro-Assay-Kosten (eine 24-Well-EAgaL-Platte gegenüber 24 FTs) angegeben.
Bei der Verwendung der EAgaL-Platten sind einige Punkte zu beachten. Eine erste Sorge war, dass Mücken, die auf so kleinem Raum platziert werden, aufgrund der begrenzten Bewegung nicht alle Eier legen dürfen. Um festzustellen, ob dies der Fall war, wurden die Mücken kollektiv in einen größeren Käfig mit einem Ovipositionsbecher mit einem Papiertuch mit Wasser für weitere 48 h gefüttert, nachdem sie 48 h in den EAgaL-Platten verbracht hatten. Die Stechmücken legten zwar zusätzliche Eier, aber die durchschnittliche Anzahl der Eier pro Weibchen betrug nur 2,1, was in den meisten, wenn nicht allen Fällen keinen Unterschied im Ergebnis einer statistischen Analyse ergibt. Diese Zahlen stammen von mehr als 500 getesteten Mücken (Daten nicht gezeigt). Dies kann jedoch nur für die Ae. aegypti "Liverpool" Mückenstamm mit den beschriebenen Bedingungen sein. Jedes Labor muss möglicherweise testen, ob dies für seine Mücken und Bedingungen der Fall ist.
Für die Bildgebung deckte das Einzelbild einer Kamera, die an einem Stereomikroskop befestigt war, auch bei der niedrigsten Vergrößerung keinen ganzen Brunnen ab. Dies erforderte das Erhalten mehrerer Bilder pro Brunnen und im Gegenzug Das Patchen der Bilder oder das Nachverfolgen von Eiern, die in mehreren Bildern desselben Brunnens überlappt waren. Beide Ansätze erschwerten die Analyse erheblich und erhöhten die Arbeit erheblich. Darüber hinaus ist der Kamerawinkel aufgrund der Beschaffenheit eines Stereomikroskops immer leicht links oder rechts vom senkrechten Winkel entfernt, wodurch die linke oder rechte Seitenwand einen Teil der Agarose-Oberfläche blockiert.
Die Kontamination durch Mikroorganismen, insbesondere Pilze, kann während des Testes ein Problem darstellen. Obwohl Das Bleichen die Kontamination vor der Eileiter minimieren kann, können Pilze in der insektenreichen Umgebung vorhanden sein und von den Mücken selbst getragen werden. In solchen Fällen kann die Reinigung von Insektenräumen die Inzidenz verringern. Es ist am besten für jedes Labor, eine EAgaL-Platte zu testen, um mögliche Probleme zu erkennen.
Beachten Sie, dass die EAgaL-Plattenmethode nicht entwickelt wurde, um Mückenkulturen über die frühen Larvenstadien hinaus zu erhalten. Die durchschnittliche Anzahl der Larven pro Brunnen war in der Regel über 60, und es ist nicht ungewöhnlich, mehr als 100 Larven pro Brunnen zu haben. Dies schafft überfüllte Bedingungen, die zu einer Verzögerung der Entwicklung, einer niedrigeren Verpfupationsrate und sehr kleinen Erwachsenen führen, was nachgelagerte Studien gefährden kann.
Derzeit wurde diese Methode nur mit Ae. aegyptigetestet. Jedoch, Es wird derzeit getestet, um seine Anwendung auf andere Arten von Aedes und sogar andere Gattungen von Mücken wie Anopheles und Culexzu erweitern.
Aufgrund des reduzierten Zeit- und Platzbedarfs für die EAgaL-Plattenmethode können die Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests auf einen halbhohen Durchsatz (d. h. 5–10 Platten oder mehr pro Experiment) skaliert werden. Diese Funktion der EAgaL-Plattenmethode kann äußerst nützlich sein, um die wichtigen Fitnessparameter von Stechmücken für Insektizidtests, Sterilitätsbewertungen, Transgenese und Gen-Editing-Studien zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte für diese Studie.
Acknowledgments
Wir danken Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program für die Finanzierung. Wir danken auch den Mitgliedern des Adelman-Labors für die Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode und Anregungen bei der Erstellung des Manuskripts sowie den Mitgliedern des Kevin Myles-Labors. Wir danken auch den Rezensenten und Redakteuren für ihre Hilfe, um dieses Manuskript besser zu machen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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