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Biology

Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/61232

Summary

Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.

Abstract

Les moustiques représentent un problème de santé publique important en tant que vecteurs de divers agents pathogènes. Pour les études qui nécessitent une évaluation des paramètres de condition physique des moustiques, en particulier la production d’œufs et les taux d’éclosion au niveau individuel, les méthodes conventionnelles ont imposé un fardeau substantiel aux chercheurs en raison de l’intensité de travail élevée et des exigences en matière d’espace de laboratoire. Décrit est une méthode simple utilisant 24 puits plaque de culture de tissus avec de l’agarose dans chaque puits et l’imagerie numérique de chaque puits pour déterminer le nombre d’œufs et les taux d’éclosion à un niveau individuel avec des besoins en temps et en espace considérablement réduits.

Introduction

La lutte contre les moustiques pour protéger les humains contre les agents pathogènes à transmission vectorielle est un objectif de santé publique important, principalement en raison du manque de vaccins efficaces pour la plupart des agents pathogènes transportés par les moustiques. De nombreuses études visent à réduire la condition physique des moustiques en conjonction avec une stratégie de réduction de la population applicable sur le terrain1,2,3. Cela comprend des études approfondies pour créer des moustiques transgéniques et / ou des lignes knockout CRISPR / Cas9. De telles approches de modification de la population nécessitent une évaluation détaillée des paramètres de condition physique individuels4. Les techniques de laboratoire conventionnelles pour évaluer la valeur adaptative des moustiques femelles comprennent le confinement individuel des moustiques femelles accouplé et nourris au sang dans des contenants de 100 mL5,des tubes coniques modifiés de 50 mL ou des tubes pour l’élevage de drosophiles modifiés en fournissant des surfaces humides en utilisant du coton humide et des disques en papier filtre pour la ponte (c.-à-d. les papiers d’œufs)1,2,6,7. De telles méthodes nécessitent un espace relativement grand (p. ex., 30 cm x 30 cm x 10 cm : L x L x H pour un accès à 100 tubes de drosophile) (figure 1)et la manipulation de papiers d’œufs individuels pour compter les œufs et les larves à couver, ce qui peut nécessiter beaucoup de main-d’œuvre. Ce manuscrit présente une méthode pour compter les œufs de moustiques et déterminer les taux d’éclosion en utilisant 24 plaques de puits et de l’agarose comme surface de ponte pour contourner ces problèmes8.

Simultanément, Ioshino et al.9 ont décrit une méthode détaillée utilisant des plaques de 12 et 24 puits pour effectuer le comptage des œufs obtenus à partir de femelles individuelles. Leur protocole représentait une amélioration significative par rapport aux méthodes conventionnelles en économisant du temps et de l’espace9. Cependant, le protocole qu’ils ont décrit continue d’utiliser du papier filtre humide comme surface pour la ponte, ce qui nécessite de déplier chaque papier individuel pour obtenir des comptes, car les œufs se trouvent souvent sous ou dans les plis. Leur protocole n’incluait pas non plus l’utilisation de technologies d’imagerie ou d’une méthode de comptage larvaire.

Présenté est une méthode améliorée pour effectuer des essais de condition physique pour le nombre d’œufs (c.-à-d. fécondité) et le taux d’éclosion (c.-à-d. fertilité) en utilisant l’agarose comme surface de ponte dans un format de plaque de culture tissulaire de 24 puits pour Ae. aegypti qui ovipose sur les surfaces humides. Ces plaques ont été nommées plaques « EAgaL », de Egg, Agarose et Larva. Ces plaques de 24 puits fournissent aux moustiques individuels une surface minimale pour pondre des œufs, simplifiant ainsi et réduisant considérablement le temps et les efforts nécessaires pour compter et maintenir les œufs et les larves écloses pendant quelques jours. La plaque EAgaL utilise de l’agarose translucide pour la surface de ponte, ce qui élimine la nécessité de manipuler des papiers d’œufs et de trouver les œufs et les larves lorsqu’ils éclosent; photographier chaque puits permet d’établir un enregistrement archivé à long terme des résultats et de séparer le processus de comptage dans le temps et dans l’espace du processus d’élevage et de manutention, où le temps est souvent limité.

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Protocol

1. Préparation des assiettes

  1. Forez des trous dans 24 couvercles de plaques de culture tissulaire de puits (4−6 trous par puits) à l’aide d’une foreuse domestique avec un trépan d’environ 1,6 mm (1/16 in)(figure 2).
    REMARQUE: Ces trous empêchent la condensation de l’eau de l’agarose de s’accumuler sur le couvercle, où les moustiques peuvent pondre des œufs. La taille standard de la femelle Ae. aegypti (souche « Liverpool ») est d’environ 3,11 mm d’envergure. Il est recommandé de réduire la taille des trous lors de l’utilisation de moustiques plus petits pour éviter de s’échapper de la plaque.
  2. La veille de l’expérience de ponte, lavez et rincez soigneusement les plaques et faites-les tremper dans de l’eau de Javel à 1−5 % pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Rincez abondamment sous de l’eau déionisée courante et séchez-les.
    REMARQUE: Ce processus réduit le risque de champignons et de bactéries se développant sur l’agarose.
  3. Faire fondre l’agarose à 2 % dans de l’eau désionisée et ajouter immédiatement 500 μL de l’agarose fondue à chaque puits des 24 plaques de puits à l’aide d’une pipette de 1 000 μL(figure 3A,B). Lorsque l’agarose commence à refroidir et à obstruer la pointe de la pipette, réchauffez l’agarose et utilisez une nouvelle pointe de pipette.
    REMARQUE: Évitez de toucher les parois du puits avec la pointe de la pipette, car cela peut laisser un morceau d’agarose sur le mur où une femelle peut pondre des œufs, ce qui complique le processus d’imagerie et de comptage.
  4. Avant utilisation, sécher toute condensation sur les parois du puits pendant la nuit sur un banc de laboratoire(figure 3C,D).
    REMARQUE : La chronologie de l’analyse sur plaque EAgaL, de l’alimentation sanguine à l’imagerie larvaire, est illustrée à la figure 4,qui concerne les moustiques des colonies(Ae. aegypti « Liverpool » élevé sous 14 h de lumière : 10 h cycle de lumière foncé, 27 °C, humidité relative de 80 %, 500 larves dans un plateau de 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm avec 2 L d’eau), dans des conditions insecticides. Il est recommandé que chaque laboratoire teste la plaque EAgaL avec les moustiques utilisés, en particulier lors de l’utilisation de différentes souches, de différentes espèces de moustiques, ainsi que de différents protocoles d’élevage.

2. Alimentation des moustiques

REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser des moustiques élevés dans des conditions uniformes pour tous les groupes de traitement et les groupes témoins, car la nutrition larvaire a un impact sur les paramètres de condition physique des moustiques10,11. Larves arrière dans des conditions peu fréquentées avec suffisamment de nourriture. Laissez les moustiques femelles s’enfermer en présence de mâles afin que l’accouplement soit assuré et mûrissent pendant au moins 3 jours.

  1. Retirer toute source d’eau et/ou de sucre des moustiques femelles au moins 16 h avant l’alimentation par le sang afin d’améliorer l’alimentation par le sang.
  2. Chauffer un circulateur d’eau pour l’alimentation artificielle à 37 °C et nourrir les moustiques femelles à l’aide de sang vertébré placé dans des mangeoires artificielles pendant 15 à 30 minutes(figure 5A).
  3. Anesthésier les moustiques avec du CO2 ou sur de la glace, les transférer dans un plat en verre sur la glace et sélectionner ceux qui sont engorgés de sang (Figure 5B) dans un récipient fourni avec 30% d’eau de saccharose pendant plus de 72 h, lorsque les femelles terminent l’excrétion et le développement des œufs.
    REMARQUE: Si les femelles reçoivent une concentration plus faible d’eau saccharose, retirez l’eau saccharose et toute surface humide après 48 h pour empêcher les femelles de ponte.

3. Ponte

  1. Environ 1 h avant de transférer les moustiques dans les plaques, ajoutez 2−3 gouttes (~80−120 μL) d’eau dans chaque puits de plaque à l’aide d’une pipette de transfert.
  2. Au moins 72 h après l’alimentation par le sang, éliminez les moustiques atteints de CO2 ou sur la glace, transférez-les dans un plat en verre sur la glace et placez individuellement chaque moustique sur un couvercle inversé de la plaque de 24 puits sur la glace(figure 6A).
    NOTA : Cette procédure a été appliquée à partir de Ioshino et coll.9.
  3. Une fois que les 24 moustiques ont été placés, couvrez le couvercle d’un fond de plaque inversé(figure 6B),fixez le couvercle et la plaque avec un nouvel élastique frais et placez-le dans une chambre environnementale (ou une salle d’élevage)(figure 6C)jusqu’à ce que les moustiques récupèrent (~10−15 min) et tournez la plaque vers le haut(figure 6D).
  4. Laissez les moustiques femelles ponder pendant 24−48 h et enlevez les femelles en les libérant des plaques dans une grande cage.
    REMARQUE: S’il est important de garder une trace sur les femelles individuelles, anesthésiez-les en refroidissant les assiettes et retirez-les individuellement sur la glace. Une ponte retardée et des excrétions sombres qui nuisent au comptage des œufs ont été observées lorsque les femelles ont été transférées dans les plaques plus tôt que 72 h après la farine de sang (PBM) (figure 7D).

4. Comptage des œufs

  1. Vérifiez chaque puits de la plaque de 24 puits, car parfois les moustiques pondent des œufs sur la paroi des puits et à la marge de la surface de l’agarose / plastique, où ils sont difficiles à résoudre sur les photos. À l’aide d’un pinceau humide, déplacez les œufs pondus sur le mur et le bord de l’agarose vers la surface plane de l’agarose afin que tous les œufs soient dans un plan uniforme et ne se chevauchent pas.
    REMARQUE: Le bord de l’agarose est généralement hors du plan focal de la caméra en raison de la tension superficielle de la solution d’agarose.
  2. À l’aide d’une pince, retirez les jambes, les ailes et les autres particules cassées dans les puits qui peuvent interférer avec l’imagerie des œufs (Figure 7C).
  3. Insérez du papier blanc sous la plaque pour augmenter le contraste avec les œufs de moustiques foncés avant l’imagerie à l’aide d’un illuminateur de stéréomicroscope(Figure 7A).
  4. Prenez une image de chaque puits à l’aide d’un appareil photo numérique compact en mode microscope, ce qui permet à l’utilisateur de se concentrer sur des objets aussi proches que 1 cm. Cette capacité permet de placer la caméra directement sur la plaque pour imager les œufs sans trépied ni support(Figure 7A). Pour distinguer les œufs individuels pondus en touffes, utilisez le mode fin ou super-fin pour capturer des images haute résolution afin que les détails en gros plan puissent être vus.
    Remarque : Effacez la carte mémoire de l’appareil photo avant utilisation pour éviter toute confusion entre les nouvelles et les anciennes images.
  5. Après avoir photographié chaque puits d’une plaque, prenez une image de la plaque entière avec une étiquette d’ordre d’imagerie pour distinguer chaque plaque plus tard(Figure 7E).
  6. Ajouter une fine couche d’environ 5 gouttes d’eau (~200 μL) avec une pipette de transfert à chaque puits pour empêcher son bouchon d’agarose et les œufs de sécher et pour induire le développement et l’éclosion de l’embryon. Faites attention aux niveaux d’eau pendant les premières heures et vérifiez tous les jours, car il peut y avoir une perte d’eau due à l’absorption par l’agarose ou à l’évaporation. Ajouter de l’eau lorsque son niveau est trop bas pour que les larves éclosent.
    NOTA : L’évaporation de l’eau se produit de façon non uniforme à l’intérieur d’une plaque et à l’intérieur d’une pile de plaques. Il a été observé que le séchage se produit dans l’ordre suivant: 1) les puits d’angle (A1, A6, D1, D6) sèchent le plus rapidement; suivi de 2) puits au bord extérieur de la plaque (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); et le dernier 3) puits à l’intérieur. Lorsque les plaques sont empilées, la plaque supérieure sèche le plus rapidement.
  7. Transférez les images sur un ordinateur avec ImageJ (Fidji) et renommez les fichiers pour faciliter l’organisation, tels que « [ID de plaque]_[ID de puits] .jpg »(Figure 8A,B).
  8. Créer un fichier de feuille de calcul pour consigner le nombre d’œufs (c.-à-d. la fécondité) et le nombre de larves et calculer le taux d’éclosion (c.-à-d. la fertilité)(figure 9E).
  9. Ouvrez les images avec ImageJ (Fidji)12 et utilisez l’outil "multi-point" pour marquer chaque œuf(Figure 9A−C); zoom avant ou zoom arrière à l’aide de la touche "+" ou "" pour compter les œufs en touffes. Après avoir marqué tous les œufs, double-cliquez sur l’icône multi-points pour afficher le nombre de repères(Figure 9D). Enregistrez les résultats dans une feuille de calcul.

5. Évaluation de la fécondité

REMARQUE : Dans 2 jours, les larves du premier stade peuvent commencer à s’écloser dans les puits. Attendez 3 à 5 jours de plus avant l’imagerie ou le comptage pour vous assurer que tous les œufs viables éclosent.

  1. Préparer la nourriture larvaire en mélangeant 1/16 cuillère à soupe (~168 mg) de nourriture pour poissons de fond (c.-à-d. régime larvaire normal des moustiques) dans 20 mL d’eau et en attendant que de grosses particules solides se déposent(figure 10A−D). Commencez à ajouter de la nourriture (le surnageant) aux puits qui contiennent des larves écloses dès qu’elles apparaissent, car elles ne survivent pas longtemps sans nourriture.
    NOTA : L’ajout excessif de particules alimentaires peut nuire à l’imagerie et au comptage des larves écloses.
  2. Environ 5 à 8 jours après l’ajout d’eau aux puits, refroidir la plaque en recouvrant de glace concassée pendant 15 à 20 minutes pour anesthésier les larves.
  3. Prenez des images de chaque puits tout en gardant les assiettes sur la glace comme cela a été fait avec les œufs. Pour les images larvaires, fournissez un arrière-plan sombre en insérant un matériau noir sous la plaque pour aider à améliorer le contraste. Après avoir photographié chaque puits d’une plaque, prenez une image de la plaque entière avec une étiquette d’ordre d’imagerie pour distinguer chaque plaque plus tard.
    NOTA : Les images sont prises pendant que les plaques sont sur la glace parce que le mouvement des larves peut compromettre le comptage. Les plaques sont réutilisables; congeler et enlever les moustiques et l’agarose pour les nettoyer en cas d’utilisation prochaine. La plaque EAgaL ne convient pas à l’élevage des larves à des stades avancés.
  4. Ouvrez les images avec ImageJ (Fidji) et utilisez l’outil "multi-points" pour compter en cliquant sur chaque larve. Au cours de la période de 3 à 5 jours, certaines larves peuvent avoir mué, en particulier dans les puits où le nombre de larves est faible. Par conséquent, lors du comptage, exclure les cuticules excrétées (c.-à-d. les exuviae), qui ressemblent à des larves à tête seule avec un peu de corps, ou à des larves rétrécies (figure 10E). Enregistrez les résultats dans la feuille de calcul.

6. Effectuer une analyse

  1. Après avoir recueilli toutes les données nécessaires à l’analyse de la fécondité et de la fertilité, effectuer une analyse statistique appropriée et créer des graphiques à l’aide du logiciel préféré.

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Representative Results

Les moustiques ont reçu une injection d’ARNdb ciblant un transporteur de fer candidat (FeT) ou un gène témoin (EGFP), nourris dans le sang, et mesurés pour la fécondité et la fertilité à l’aide de la méthode de la plaque EAgaL, suivant la procédure décrite ci-dessus.

Les moustiques chez lesquels l’expression de feT a été réduite au silence après l’injection d’ARNdb ont montré une réduction significative du nombre d’œufs et du taux d’éclosion(figure 11AC). Tous les moustiques de contrôle et de traitement ont été placés dans les plaques d’EAgaL après PBM de 72 h. Les moustiques silencieux au FeT présentaient également une excrétion retardée et des œufs de petite taille et de couleur claire(figure 12A,B). Des exemples de résultats peuvent également être trouvés dans Tsujimoto et al.8.

Figure 1
Figure 1 : Tubes à mouches couramment utilisés pour les essais de fécondité et de fertilité des moustiques. (A) Un seul tube avec du coton humide et du papier filtre circulaire avec bouchon éponge. (B) 100 tubes dans un rack (~30 cm x 30 cm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Percer des trous dans un couvercle de 24 plaques de culture tissulaire de puits. (A) Forage en cours. (B) Un couvercle avec des trous qui empêchent la condensation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Application d’agarose (2 % dans l’eau) dans les puits. (A) Application d’agarose à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Notez que la pointe ne touche pas la paroi du puits. (B) Une plaque contenant de l’agarose sur le fond. (C) Paroi d’un puits juste après solidifier l’agarose. Notez la condensation sur le mur. (D) Paroi d’un puits lorsque la condensation s’est évaporée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Chronologie de l’alimentation par le sang (jour 0) à l’imagerie larvaire (jour 10−13). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Ill. 5 : Alimentation par sang artificiel et sélection des femelles engorgées. (A) Alimentation par le sang à l’aide d’une mangeoire artificielle. (B) Sélection des femelles engorgeées sur la glace. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Transfert des femelles sur la plaque EAgaL. (A) Transférer les femelles anesthésiées dans un couvercle de plaque inversé sur de la glace. (B) Ensuite, placez soigneusement la plaque contenant de l’agarose inversée sur le couvercle inversé et (C) retirez la plaque avec le couvercle attaché de la glace et maintenez-la en position inversée jusqu’à ce que les femelles aient récupéré de l’anesthésie. (D,E) Tournez la plaque contenant la femelle vers le haut. Notez que le couvercle et la partie inférieure de la plaque sont maintenus par un élastique et que la partie inférieure est étiquetée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Imagerie de chaque puits après le retrait des femelles. (A) Appareil photo numérique au-dessus d’une plaque de 24 puits contenant des œufs pour l’imagerie. (B) Image typique d’un puits. (C) Un puits contenant une jambe, qui doit être enlevée. (D) Exemple d’image d’un puits dans lequel une femelle avait été placée à 48 h PBM. Notez les marques d’excrétion sombres, ce qui peut compliquer le comptage des œufs (flèches). (E) Plaque entière montrant une étiquette d’ordre d’imagerie préparée à la suite de l’imagerie de tous les puits de la plaque. Cela permet de reconnaître les puits pendant l’analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Renommer les images pour une meilleure organisation. (A) Images de puits individuels contenant des œufs, y compris une étiquette de commande d’images avec les noms automatiquement attribués par la caméra. (B) Les mêmes images renommées avec plateID_wellID.jpg format. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Comptage des œufs à l’aide du logiciel « Fidji » (ImageJ2). (A) Capture d’écran du logiciel Fidji montrant l’outil "multi-point" mis en évidence (carré turquoise). (B) Une image de puits avec des marques de comptage Fidji sur les œufs. (C) Le zoom avant aide à compter les grands groupes d’œufs. (D) Double-cliquer sur l’icône del’outil " multi-point" dans la fenêtre principale montre le nombre (cercle rouge). (E) Exemple de tableur avec formule de calcul du taux d’éclosion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Ill. 10 : Préparation du régime alimentaire larvaire et puits contenant des larves et des exuviae. (A) Aliments de poisson de fond. (B) 20 mL d’eau dans une tasse. (C) Mélange d’aliments et d’eau pour poissons de fond. (D) Nourriture/eau réglée pendant 15 min. Prenez le surnageant de ce mélange comme nourriture larvaire. (E) Bien avec des larves muées; les exuviae représentatives sont indiquées par des flèches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : Données de comptage provenant d’une expérience de silençage génique. Les moustiques injectés avec l’ARNdb contre le transporteur putatif de fer (FeT) ont montré la réduction significative du nombre d’oeufs(A),(B)nombre larvaire, et(C)taux d’éclosion par rapport au contrôle (EGFP). Les barres montrent la moyenne ± SD.  Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 12
Figure 12 : Images représentatives des puits montrant des phénotypes supplémentaires chez les moustiques réduits au silence par les gènes. dsFeT a montré l’excrétion retardée (marques brun foncé) et les petits, légèrement colorés oeufs. Deux puits représentatifs pour chaque traitement sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Ft EAgaL
(1) Préparation 20 min 29,0 s 3 min 49,3 s
(2) F_in 3 min 55,0 s 1 min 56,0 s
(3) F_out/E_img 43 min 44,3 s 15 min 28,3 s
(4) L_img 38 min 03,5 s 9 min 30,5 s

Tableau 1: Délais requis pour l’achèvement de la méthode du tube volant (FT) par rapport à la méthode de la plaque EAgaL. (1) Préparation : Temps nécessaire pour placer le coton, verser de l’eau et insérer un disque de papier filtre dans les tubes d’élevage de drosophiles (FT) par rapport au versement de l’agarose dans des puits de 24 puits (EAgaL). (2) F_in : Temps nécessaire pour placer des moustiques individuels dans des tubes d’élevage (FT) ou des puits de la plaque de 24 puits (EAgaL). (3)F_out/E_img : Temps nécessaire pour libérer le moustique dans une cage plus grande, enlever, déplier le papier d’œuf et imager les œufs sur le papier (FT) ou relâcher les moustiques dans une cage plus grande et imager chaque puits de la plaque de 24 puits (EAgaL). (4) L_img : Temps nécessaire pour imager les larves écloses dans un petit récipient (FT) ou dans chaque puits de la plaque de 24 puits (EAgaL) après anesthésie à froid. Un total de 24 tubes ont été utilisés pour FT.

Coûts en vrac
Plaque EAgaL Tubes volants
article prix quantité article prix quantité
Plaques de 24 puits 45,61 $US Cas de 50 Feuilles de papier de chromatographie 103,63 $US 46 × 57 cm 100 Feuilles/PK
Agarose 250,97 $US 500 grammes Racks à tubes volants + tubes 68,45 $US 5 plateaux de 100
Olympus TG-6 375,00 $US Bouchons de tube volant 66,10 $ Cas de 200
Boules de coton 104,27 $ Cas de 2000
Total de démarrage 671,58 $US Total de démarrage 342,45 $US
Coût unitaire (une plaque de 24 puits ou 24 tubes)
Plaque EAgaL Tubes volants
article prix note article prix note
une plaque de 24 puits 0,91 $ prix en vrac/50 Feuilles de papier de chromatographie 0,16 $ 641,7 séries de 24 tubes d’une valeur(2)
Agarose par assiette 0,15 $ 500g = 1667 plaques(1) Racks à tubes volants + tubes 3,29 $ (prix en vrac/500) × 24
Bouchons de tube volant 7,93 $ (prix en vrac/200) × 24
Boules de coton 1,25 $ (prix en vrac/2000) × 24
Total de l’unité 1,06 $ Total de l’unité 12,63 $US

Tableau 2 : Comparaison des coûts entre la plaque EAgaL et FT. Haut: Coûts en vrac pour le démarrage (en supposant qu’un foret et un foret peuvent être fournis par un chercheur). Bas: Coûts estimés pour une plaque de 24 puits (plaque EAgaL) et 24 FT. (1)En supposant qu’une plaque nécessite un peu plus que juste assez pour une plaque de 24 puits (12 ml), 15 mL de 2% = 0,3 g d’agarose par plaque, un total de 500 g d’agarose peut faire 1,667 plaques. (2) Une feuille de papier peut faire 154 de ~ 38 mm de disques de diamètre. Avec 100 feuilles, 641,7 (15 400/24) ensembles de 24 tubes peuvent être fabriqués.

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Discussion

La plaque EAgaL réduit considérablement le travail, le temps et l’espace pour effectuer des tests individuels de fécondité et de fertilité dans Aedes aegypti par rapport à la méthode FT. La comparaison préliminaire entre la méthode FT et la plaque EAgaL a donné lieu à des temps plus courts pour toutes les étapes (la technique d’imagerie a été appliquée à la méthode FT)(tableau 1). À titre de référence, une estimation des coûts de démarrage et par essai (une plaque EAgaL de 24 puits contre 24 PT) est fournie dans le tableau 2.

Il y a quelques points à considérer lors de l’utilisation des plaques EAgaL. Une préoccupation initiale était que les moustiques placés dans un si petit espace peuvent ne pas pondre tous les œufs en raison de leurs mouvements limités. Pour déterminer si c’était le cas, les moustiques ont été transférés collectivement dans une cage plus grande avec une tasse de ponte doublée d’une serviette en papier avec de l’eau pendant 48 h supplémentaires après avoir passé 48 h dans les plaques EAgaL. Les moustiques ont en effet pondu des œufs supplémentaires, mais le nombre moyen d’œufs par femelle n’était que de 2,1, ce qui n’entraîne aucune différence dans le résultat d’une analyse statistique dans la plupart des cas, sinon tous. Ces chiffres proviennent de plus de 500 moustiques testés (données non présentées). Cependant, cela peut être uniquement pour la souche de moustique Ae. aegypti « Liverpool » avec les conditions décrites. Chaque laboratoire peut avoir besoin de tester si c’est le cas pour ses moustiques et ses conditions.

Pour l’imagerie, l’image unique d’une caméra fixée à un stéréomicroscope ne couvrait pas un puits entier, même au grossissement le plus bas. Cela nécessitait d’obtenir plusieurs images par puits et, à son tour, de corriger les images, ou de garder une trace des œufs qui se chevauchaient dans plusieurs images du même puits. Les deux approches ont sévèrement compliqué l’analyse et ont augmenté de manière significative le travail impliqué. De plus, en raison de la nature d’un stéréomicroscope, l’angle de la caméra est toujours légèrement à gauche ou à droite de l’angle perpendiculaire, ce qui fait du bloc de paroi du côté gauche ou droit une partie de la surface de l’agarose.

La contamination par des micro-organismes, en particulier des champignons, peut être un problème pendant le test. Bien que le blanchiment puisse minimiser la contamination avant la ponte, des champignons peuvent être présents dans l’environnement insecticide et transportés par les moustiques eux-mêmes. Dans de tels cas, garder les espaces insecticides propres peut réduire l’incidence. Il est préférable pour chaque laboratoire de tester une plaque EAgaL pour détecter tout problème potentiel.

Il est à noter que la méthode de la plaque EAgaL n’a pas été conçue pour maintenir les cultures de moustiques au-delà des premiers stades larvaires. Le nombre moyen de larves par puits était généralement supérieur à 60, et il n’est pas rare d’avoir plus de 100 larves par puits. Cela crée des conditions surpeuplées, ce qui entraîne un retard de développement, un taux de nymphose plus faible et de très petits adultes, ce qui peut compromettre les études en aval.

Actuellement, cette méthode n’a été testée qu’avec Ae. aegypti. Cependant, il est actuellement testé pour étendre son application à d’autres espèces d’Aedes et même à d’autres genres de moustiques tels que Anopheles et Culex.

En raison des exigences réduites en matière de temps et d’espace pour la méthode des plaques EAgaL, les essais de fécondité et de fertilité peuvent être mis à l’échelle jusqu’à un débit semi-élevé (c.-à-d. 5 à 10 plaques ou plus par expérience). Cette caractéristique de la méthode de plaque EAgaL peut être extrêmement utile pour évaluer les paramètres importants de forme physique des moustiques pour les tests insecticides, l’évaluation de la stérilité, la transgénèse et les études d’édition de gènes.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts pour cette étude.

Acknowledgments

Nous remercions le programme de subventions pour la recherche sur les maladies à vecteurs d’insectes de Texas A&M Agrilife pour son financement. Nous remercions également les membres du laboratoire Adelman pour leur aide dans le développement de cette méthode et leurs suggestions lors de la rédaction du manuscrit, ainsi que les membres du laboratoire Kevin Myles. Nous remercions également les réviseurs et les éditeurs pour leur aide afin d’améliorer ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.6 mm Φ drill bit alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long) Olympus plastics 24-165RL
24-well tissue culture plate Thermo Scientific 930186 clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose VWR 0710-500G
Compact digital camera Olympus TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software download from: https://fiji.sc/
Forceps Dumont sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
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References

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Biologie Numéro 171 Aedes aegypti moustique forme physique nombre d’œufs taux d’éclosion fécondité fertilité gain de temps gain de place
Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour <em>Aedes aegypti</em> à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)
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Tsujimoto, H., Adelman, Z. N.More

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates). J. Vis. Exp. (171), e61232, doi:10.3791/61232 (2021).

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