Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)
Summary
Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.
Abstract
Les moustiques représentent un problème de santé publique important en tant que vecteurs de divers agents pathogènes. Pour les études qui nécessitent une évaluation des paramètres de condition physique des moustiques, en particulier la production d’œufs et les taux d’éclosion au niveau individuel, les méthodes conventionnelles ont imposé un fardeau substantiel aux chercheurs en raison de l’intensité de travail élevée et des exigences en matière d’espace de laboratoire. Décrit est une méthode simple utilisant 24 puits plaque de culture de tissus avec de l’agarose dans chaque puits et l’imagerie numérique de chaque puits pour déterminer le nombre d’œufs et les taux d’éclosion à un niveau individuel avec des besoins en temps et en espace considérablement réduits.
Introduction
La lutte contre les moustiques pour protéger les humains contre les agents pathogènes à transmission vectorielle est un objectif de santé publique important, principalement en raison du manque de vaccins efficaces pour la plupart des agents pathogènes transportés par les moustiques. De nombreuses études visent à réduire la condition physique des moustiques en conjonction avec une stratégie de réduction de la population applicable sur le terrain1,2,3. Cela comprend des études approfondies pour créer des moustiques transgéniques et / ou des lignes knockout CRISPR / Cas9. De telles approches de modification de la population nécessitent une évaluation détaillée des paramètres de condition physique individuels4. Les techniques de laboratoire conventionnelles pour évaluer la valeur adaptative des moustiques femelles comprennent le confinement individuel des moustiques femelles accouplé et nourris au sang dans des contenants de 100 mL5,des tubes coniques modifiés de 50 mL ou des tubes pour l’élevage de drosophiles modifiés en fournissant des surfaces humides en utilisant du coton humide et des disques en papier filtre pour la ponte (c.-à-d. les papiers d’œufs)1,2,6,7. De telles méthodes nécessitent un espace relativement grand (p. ex., 30 cm x 30 cm x 10 cm : L x L x H pour un accès à 100 tubes de drosophile) (figure 1)et la manipulation de papiers d’œufs individuels pour compter les œufs et les larves à couver, ce qui peut nécessiter beaucoup de main-d’œuvre. Ce manuscrit présente une méthode pour compter les œufs de moustiques et déterminer les taux d’éclosion en utilisant 24 plaques de puits et de l’agarose comme surface de ponte pour contourner ces problèmes8.
Simultanément, Ioshino et al.9 ont décrit une méthode détaillée utilisant des plaques de 12 et 24 puits pour effectuer le comptage des œufs obtenus à partir de femelles individuelles. Leur protocole représentait une amélioration significative par rapport aux méthodes conventionnelles en économisant du temps et de l’espace9. Cependant, le protocole qu’ils ont décrit continue d’utiliser du papier filtre humide comme surface pour la ponte, ce qui nécessite de déplier chaque papier individuel pour obtenir des comptes, car les œufs se trouvent souvent sous ou dans les plis. Leur protocole n’incluait pas non plus l’utilisation de technologies d’imagerie ou d’une méthode de comptage larvaire.
Présenté est une méthode améliorée pour effectuer des essais de condition physique pour le nombre d’œufs (c.-à-d. fécondité) et le taux d’éclosion (c.-à-d. fertilité) en utilisant l’agarose comme surface de ponte dans un format de plaque de culture tissulaire de 24 puits pour Ae. aegypti qui ovipose sur les surfaces humides. Ces plaques ont été nommées plaques « EAgaL », de Egg, Agarose et Larva. Ces plaques de 24 puits fournissent aux moustiques individuels une surface minimale pour pondre des œufs, simplifiant ainsi et réduisant considérablement le temps et les efforts nécessaires pour compter et maintenir les œufs et les larves écloses pendant quelques jours. La plaque EAgaL utilise de l’agarose translucide pour la surface de ponte, ce qui élimine la nécessité de manipuler des papiers d’œufs et de trouver les œufs et les larves lorsqu’ils éclosent; photographier chaque puits permet d’établir un enregistrement archivé à long terme des résultats et de séparer le processus de comptage dans le temps et dans l’espace du processus d’élevage et de manutention, où le temps est souvent limité.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plaque EAgaL réduit considérablement le travail, le temps et l’espace pour effectuer des tests individuels de fécondité et de fertilité dans Aedes aegypti par rapport à la méthode FT. La comparaison préliminaire entre la méthode FT et la plaque EAgaL a donné lieu à des temps plus courts pour toutes les étapes (la technique d’imagerie a été appliquée à la méthode FT)(tableau 1). À titre de référence, une estimation des coûts de démarrage et par essai (une pla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le programme de subventions pour la recherche sur les maladies à vecteurs d’insectes de Texas A&M Agrilife pour son financement. Nous remercions également les membres du laboratoire Adelman pour leur aide dans le développement de cette méthode et leurs suggestions lors de la rédaction du manuscrit, ainsi que les membres du laboratoire Kevin Myles. Nous remercions également les réviseurs et les éditeurs pour leur aide afin d’améliorer ce manuscrit.
Materials
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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