Summary
Açıklanan, yumurtaları saymak ve 24 kuyu doku kültürü plakası kullanarak bireysel sivrisineklerin kuluçka oranlarını belirlemek için zaman ve yerden tasarruf sağlayan bir yöntemdir, bu da doğurganlık ve doğurganlık testlerinin ölçeğini ve hızını önemli ölçüde artırabilir.
Abstract
Sivrisinekler, çeşitli patojenlerin vektörleri olarak önemli bir halk sağlığı sorununu temsil eder. Sivrisinek fitness parametrelerinin, özellikle yumurta üretimi ve kuluçka oranlarının bireysel düzeyde değerlendirilmesini gerektiren çalışmalar için, geleneksel yöntemler yüksek iş yoğunluğu ve laboratuvar alanı gereksinimleri nedeniyle araştırmacılara önemli bir yük yüklemektedir. Açıklanan, yumurta sayılarını ve kuluçka oranlarını önemli ölçüde azaltılmış zaman ve alan gereksinimleri ile bireysel düzeyde belirlemek için her kuyuda agarose ve her kuyunun dijital görüntülemesine sahip 24 kuyu doku kültürü plakası kullanan basit bir yöntemdir.
Introduction
İnsanları vektör kaynaklı patojenlerden korumak için sivrisineklerin kontrolü, esas olarak sivrisinekler tarafından taşınan patojenlerin çoğu için etkili aşıların bulunmaması nedeniyle önemli bir halk sağlığı hedefidir. Birçok çalışma, sahada uygulanabilir bir nüfus azaltma stratejisi 1 ,2,3ile birlikte sivrisinek kondisyonlarını azaltmayı amaçlamaktadır. Bu, transgenik sivrisinekler ve / veya CRISPR / Cas9 nakavt hatları oluşturmak için kapsamlı çalışmaları içerir. Bu tür popülasyon modifikasyon yaklaşımları, bireysel fitness parametrelerinin ayrıntılı bir değerlendirmesini gerektirir4. Dişi sivrisineklerin kondisyonunu değerlendirmek için geleneksel laboratuvar teknikleri, 100 mL kaplarda çift, kanla beslenen dişi sivrisineklerin5,modifiye edilmiş 50 mL konik tüplerde veya yumurtlama için nemli pamuk ve filtre kağıt diskleri kullanılarak nemli yüzeyler sağlanarak modifiye edilen Drosophila yetiştirme tüplerinin (yani yumurta kağıtları)1,2,6,7.'ninayrı ayrı muhafazasını içerir. Bu tür yöntemler nispeten geniş bir alan gerektirir (örneğin, 30 cm x 30 cm x 10 cm: 100 Drosophila tüpü için W x L x H) (Şekil 1) ve tek tek yumurta kağıtlarının, emek yoğun olabilecek yumurta ve kuluçka larvalarını saymak için manipülasyonu. Bu makale, sivrisinek yumurtalarını saymak ve bu sorunları atlatmak için bir yumurtlama yüzeyi olarak 24 kuyu plakası ve agarose kullanarak yumurtadan çıkma oranlarını belirlemek için bir yöntem sunar8.
Aynı anda, Ioshino ve ark.9, bireysel dişilerden elde edilen yumurta sayımını gerçekleştirmek için 12 ve 24 kuyu plakaları kullanarak ayrıntılı bir yöntem tanımladı. Protokolleri, zaman ve mekandan tasarruf9'dageleneksel yöntemlerden önemli bir gelişmeyi temsil etti. Bununla birlikte, tarif ettikleri protokol, ıslak filtre kağıdını yumurtlama için bir yüzey olarak kullanmaya devam eder, bu da yumurtalar genellikle altında veya kıvrımlarda bulunduğundan, sayımları almak için her bir kağıdın açılmasını gerektirir. Protokolleri ayrıca görüntüleme teknolojilerinin kullanımını veya larva sayımı için bir yöntemi içermede değildi.
Sunulan yumurta sayısı (yani, doğurganlık) ve yumurtadan çıkma oranı (yani doğurganlık) için uygunluk testlerini yapmak için geliştirilmiş bir yöntemdir, agarose'un nemli yüzeylerde ovipoz yapan Ae. aegypti için 24 kuyu doku kültürü plakası formatında bir yumurtlama yüzeyi olarak kullanılması. Bu plakalar E gg, Agarose ve Larva'dan "EAgaL"plakaları olarak adlandırıldı. Bu 24 kuyu plakası, bireysel sivrisineklere yumurta bırakmak için minimum bir yüzey sağlar, böylece yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları birkaç gün boyunca saymak ve sürdürmek için gereken zamanı ve çabayı basitleştirir ve büyük ölçüde azaltır. EAgaL plakası, yumurta kağıtlarını taşıma ve yumurtadan çıktığında yumurta ve larvaları bulma ihtiyacını ortadan kaldırır; her kuyunun fotoğraflandırılması, sonuçların uzun süreli arşivlenmiş bir kaydını oluşturur ve hem zaman hem de mekandaki sayım işlemini, zamanın genellikle sınırlı olduğu yetiştirme / taşıma işleminden ayırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plaka hazırlama
- ~1,6 mm (1/16 giriş) uçlu bir ev matkabı kullanarak 24 kuyu doku kültürü plaka kapağında (kuyu başına 4−6 delik) delikler açın (Şekil 2).
NOT: Bu delikler, sivrisineklerin yumurta bırakabileceği kapakta birikmesi için agarosedan su yoğuşmasını önler. Dişi Ae. aegypti'nin ("Liverpool" suşu) standart boyutu ~ 3.11 mm kanat açıklığıdır. Plakadan kaçmamak için daha küçük sivrisinekler kullanırken deliklerin boyutunun azaltılması önerilir. - Yumurtlama deneyinden bir gün önce plakaları iyice yıkayın ve durulayın ve oda sıcaklığında 30−60 dakika boyunca% 1−5 çamaşır suyuna batırın. Akan deiyonize suyun altında iyice durulayın ve kurutun.
NOT: Bu işlem agarose üzerinde mantar ve bakteri büyüme şansını azaltır. - İyonize suda % 2 oranında agaroz eritin ve hemen 1.000 μL pipet kullanarak 24 kuyu plakasının her kuyusuna 500 μL erimiş agarose ekleyin (Şekil 3A,B). Agarose soğumaya ve pipet ucunu tıkamaya başladığında, agarose'yi yeniden ısıtın ve yeni bir pipet ucu kullanın.
NOT: Kuyunun duvarlarına pipet ucuyla dokunmaktan kaçının, çünkü duvarda bir dişinin yumurta bırakabileceği bir agarose parçası bırakabilir, görüntüleme ve sayım işlemini zorlaştırabilir. - Kullanmadan önce, kuyu duvarlarındaki yoğuşmaları bir laboratuvar tezgahında bir gecede kurutun(Şekil 3C,D).
NOT: EAgaL plaka tahlilinin kan beslemeden larva görüntülemeye kadar zaman çizelgesi Şekil 4'te tasvir edilir, bu da koloni sivrisinekleri içindir(Ae. aegypti "Liverpool" 14 saat ışık altında yetiştirilen:10 h karanlık ışık döngüsü, 27 °C, 80% bağıl nem, 500 larva 49.5 cm x 29.2 cm x 9.5 cm tepside 2 L su ile), böcek koşulları altında. Her laboratuvarın EAgaL plakasını, özellikle farklı suşlar, farklı sivrisinek türleri ve farklı yetiştirme protokolleri kullanırken kullanılan sivrisineklerle test ettiği önerilir.
2. Sivrisinek besleme
NOT: Tüm tedavi grupları ve kontrol grupları için tek tip koşullar altında yetiştirilen sivrisineklerin kullanılması önemlidir, çünkü larva beslenmesi sivrisinek fitness parametreleri üzerinde bir etkiye sahiptir10,11. Yeterli yiyecek ile kalabalık olmayan koşullar altında arka larvalar. Dişi sivrisineklerin erkeklerin varlığında ekskose olmasına izin verin, böylece çiftleşme sağlanır ve en az 3 gün olgunlaşır.
- Kan beslemeyi arttırmak için kan beslemeden en az 16 saat önce dişi sivrisineklerden herhangi bir su ve/ veya şeker kaynağını çıkarın.
- Yapay beslenme için bir su sirkülatörünü 37 °C'de ısıtın ve yapay besleyicilere yerleştirilen omurgalı kanı kullanarak dişi sivrisinekleri 15−30 dk boyunca besleyin (Şekil 5A).
- Sivrisinekleri CO2 veya buz üzerinde uyuşturun, buz üzerinde bir cam tabağa aktarın ve kanla kaplanmış olanları seçin (Şekil 5B) dişiler atılımı ve yumurta gelişimini bitirdiğinde 72 saatten fazla% 30 sakkaroz suyu ile sağlanan bir kaba.
NOT: Dişilere daha düşük bir sakkaroz suyu konsantrasyonu sağlanırsa, dişilerin ovipositing yapmasını önlemek için sakkaroz suyunu ve ıslak yüzeyleri 48 saat sonra çıkarın.
3. Yumurtlama
- Sivrisinekleri plakalara aktarmadan yaklaşık 1 saat önce, bir transfer pipet kullanarak her tabağa 2−3 damla (~80−120 μL) su ekleyin.
- Kan beslemeden sonra en az 72 saat, CO2 veya buz üzerinde nakavt sivrisinekleri, buz üzerinde bir cam tabağa aktarın ve her sivrisinekleri ayrı ayrı buz üzerindeki 24 kuyu plakasının ters kapağına yerleştirin (Şekil 6A).
NOT: Bu prosedür Ioshino ve ark.9'danuygulanmıştır. - 24 sivrisinek de yerleştirildikten sonra, kapağı ters bir plaka tabanıyla kapatın (Şekil 6B), kapağı ve plakayı taze, yeni bir lastik bantla sabitleyin ve sivrisinekler iyileşene (~10−15 dk) ve plakayı sağ tarafa çevirene kadar bir çevre odasına (veya yetiştirme odasına) yerleştirin (Şekil 6C).
- Dişi sivrisineklerin 24−48 saat boyunca ovipoz yapmasına izin verin ve dişileri plakalardan büyük bir kafese bırakarak çıkarın.
NOT: Tek tek kadınları takip etmek önemliyse, plakaları soğutarak uyuşturun ve buz üzerinde ayrı ayrı çıkarın. Dişiler 72 saat kan unu sonrası (PBM) daha erken tabaklara aktarıldığında yumurta sayımını engelleyen gecikmiş yumurtlama ve koyu atılımlar gözlenmiştir(Şekil 7D).
4. Yumurta sayımı
- 24 kuyu plakasının her kuyuyu kontrol edin, çünkü bazen sivrisinekler kuyuların duvarına ve fotoğraflarda çözülmesi zor olan agarose / plastik yüzeyin kenar boşluğuna yumurta bırakırlar. Islak bir boya fırçası kullanarak, agarose duvarına ve kenarına bırakılan yumurtaları agarozun düz yüzeyine taşıyın, böylece tüm yumurtalar düzgün bir düzlemdedir ve birbirleriyle örtüşmez.
NOT: Agarose çözeltisinin yüzey gerilimi nedeniyle agarose'un kenarı genellikle kameranın odak düzleminin dışındadır. - Forseps kullanarak, kuyulardaki yumurtaları görüntülemeye engel olabilecek kırık bacakları, kanatları ve diğer parçacıkları çıkarın (Şekil 7C).
- Stereomikroskop aydınlatıcı kullanarak görüntülemeden önce koyu sivrisinek yumurtaları ile kontrastı artırmak için plakanın altına beyaz kağıt yerleştirin (Şekil 7A).
- Kullanıcının 1 cm'ye yakın nesnelere odaklanmasını sağlayan mikroskop modunda kompakt bir dijital kamera kullanarak her kuyunun bir görüntüsünü alın. Bu özellik, kameranın tripod veya stand olmadan yumurtaları görüntülemesi için doğrudan plakaya yerleştirilmesini sağlar (Şekil 7A). Kümeler halinde bırakılan yumurtaları ayırt etmek için, yakın çekim ayrıntıların görülebilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için ince veya süper ince modu kullanın.
NOT: Yeni ve eski görüntüler arasındaki karışıklığı önlemek için kullanmadan önce kameranın bellek kartını temizleyin. - Bir plakanın her kuyusunun fotoğrafını çektikten sonra, daha sonra her plakayı ayırt etmek için bir görüntüleme sırası etiketi ile tüm plakanın bir görüntüsünü alın (Şekil 7E).
- Agarose fişinin ve yumurtaların kurumasını önlemek ve embriyo gelişimini ve kuluçkalanmasını teşvik etmek için her kuyuya bir transfer pipet ile ince bir tabaka ~ 5 damla su (~ 200 μL) ekleyin. İlk birkaç saat su seviyelerine dikkat edin ve her gün kontrol edin, çünkü agarose veya buharlaşma tarafından emilimi nedeniyle su kaybı olabilir. Seviyesi larvaların yumurtadan çıkması için çok düşük olduğunda su ekleyin.
NOT: Suyun buharlaşması hem bir plaka içinde hem de bir plaka yığını içinde eşit olmayan bir şekilde gerçekleşir. Kurutmanın aşağıdaki sırayla gerçekleştiği görülmüştür: 1) köşe kuyuları (A1, A6, D1, D6) en hızlı kurur; ardından plakanın dış kenarındaki 2) kuyular (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); ve son 3) kuyular içinde. Plakalar istiflendiğinde, üst plaka en hızlı kurur. - Görüntüleri ImageJ (Fiji) içeren bir bilgisayara aktarın ve "[plaka kimliği]_[iyi kimlik].jpg" ( Şekil8A,B)gibi daha kolay organizasyon için dosyaları yeniden adlandırın.
- Yumurta numaralarını (yani doğurganlık) ve larva sayılarını kaydetmek ve tarama oranını (yani doğurganlık) hesaplamak için bir elektronik tablo dosyası oluşturun (Şekil 9E).
- Görüntüleri ImageJ (Fiji)12 ile açın ve her yumurtayı işaretlemek için "çok noktalı" aracını kullanın (Şekil 9A−C); yumurtaları kümeler halinde saymak için "+" veya "–" tuşunu kullanarak yakınlaştırma veya uzaklaştırma. Tüm yumurtaları işaretledikten sonra, işaret sayısını(Şekil 9D)getirmek için çok noktalı simgeyi çift tıklatın. Sonuçları bir elektronik tabloya kaydedin.
5. Doğurganlık değerlendirmesi
NOT: 2 gün içinde, ilk başlangıç larvaları kuyularda inclose olmaya başlayabilir. Tüm uygun yumurtaların yumurtadan çıktığından emin olmak için görüntülemeden/saymadan önce 3−5 gün daha bekleyin.
- 20 mL suda 1/16 yemek kaşığı (~168 mg) öğütülmüş balık yemi (yani normal sivrisinek larva diyeti) karıştırarak ve büyük katı parçacıkların yerleşmesini bekleyerek larva yiyecekleri hazırlayın (Şekil 10A−D). Yumurtadan çıkmış larvaları içeren kuyulara yiyecek (süpernatant) eklemeye başlayın, çünkü yiyeceksiz uzun süre hayatta kalamazlar.
NOT: Gıda parçacıklarının fazla eklenmesi, yumurtadan çıkmış larvaların görüntülenmesini ve sayımını engelleyebilir. - Kuyulara su ilave edildikten yaklaşık 5-8 gün sonra, larvaları uyuşturmak için 15−20 dakika boyunca ezilmiş buzla kaplayarak plakayı soğutun.
- Yumurtalarda olduğu gibi tabakları buzda tutarken her kuyunun görüntülerini alın. Larva görüntüleri için, kontrastı artırmaya yardımcı olmak için plakanın altına siyah bir malzeme ekleyerek karanlık bir arka plan sağlayın. Bir plakanın her kuyusunun fotoğrafını çektikten sonra, daha sonra her plakayı ayırt etmek için bir görüntüleme sırası etiketiyle tüm plakanın bir görüntüsünü alın.
NOT: Larva hareketi sayımı tehlikeye atabileceğinden, plakalar buz üzerindeyken görüntüler alınır. Plakalar yeniden kullanılabilir; bir sonraki kullanım için temizlemek için sivrisinekleri ve agarose'ları dondurun ve çıkarın. EAgaL plakası larvaları ileri aşamalara yetiştirmek için uygun değildir. - ImageJ (Fiji) ile görüntüleri açın ve her larvaya tıklayarak saymak için "çok noktalı" aracını kullanın. 3−5 günlük süre boyunca bazı larvalar, özellikle düşük sayıda larvaya sahip kuyularda erimiş olabilir. Bu nedenle, sayarken, biraz vücuda sahip sadece kafaya benzeyen döken kütikülleri (yani exuviae) veya küçülmüş larvaları hariç tutun (Şekil 10E). Sonuçları elektronik tabloya kaydedin.
6. Analiz yapın
- Doğurganlık ve doğurganlık analizi için gerekli tüm verileri topladıktan sonra, uygun istatistiksel analizleri yapmak ve tercih edilen yazılımı kullanarak grafikler oluşturmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sivrisineklere, yukarıda açıklanan prosedürü izleyerek, bir aday demir taşıyıcı (FeT) veya kontrol geni (EGFP) hedef alan dsRNA enjekte edildi ve EAgaL plaka yöntemi kullanılarak doğurganlık ve doğurganlık çıktısı için ölçüldü.
DSRNA enjeksiyonundan sonra FeT ekspresyonuna sessiz kalınan sivrisinekler hem yumurta sayısında hem de kuluçka oranında önemli bir azalma gösterdi (Şekil 11A−C). Tüm kontrol ve tedavi sivrisinekleri 72 saat PBM'den sonra EAgaL plakalarına yerleştirildi. FeT susturuculu sivrisinekler de gecikmiş atılım ve küçük ve açık renkli yumurtalar sergiledi (Şekil 12A,B). Örnek sonuçlar Tsujimoto ve ark.8'de de bulunabilir.
Şekil 1: Sivrisinek doğurganlığı/doğurganlık tahlilleri için yaygın olarak kullanılan sinek tüpleri. (A) Nemli pamuklu tek bir tüp ve sünger kapaklı dairesel filtre kağıdı. (B) Bir rafta 100 tüp (~30 cm x 30 cm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 24 kuyu doku kültürü plakasının kapağında delikler açmak. (A) Delme işlemi devam eden. (B) Yoğuşmayı önleyen delikli bir kapak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kuyulara agarose (suda% 2) uygulanması. (A) 1.000 μL pipet kullanarak agarose uygulamak. Ucun kuyunun duvarına değmediğini unutmayın. (B) Altta agarose içeren bir plaka. (C) Agarose katılaştıktan hemen sonra bir kuyunun duvarı. Duvardaki yoğuşmalara dikkat edin. (D) Yoğuşma buharlaştığında bir kuyunun duvarı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kan beslemeden (0. gün) larva görüntülemeye (gün 10−13) kadar zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yapay kan besleme ve engorged kadın seçimi. (A) Yapay besleyici kullanarak kan besleme. (B) Buz üzerinde engorged kadın seçimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Dişilerin EAgaL plakasına transferi. (A) Uyuşturulmuş dişileri buz üzerindeki ters bir plaka kapağına aktarın. (B) Daha sonra ters agarose içeren plakayı ters kapağın üzerine dikkatlice yerleştirin ve (C) plakayı buzdan kapak takılı olarak çıkarın ve dişiler anesteziden iyileşene kadar ters pozisyonda tutun. (D,E) Dişi içeren plakayı yukarı doğru çevirin. Plakanın kapak ve alt kısmının lastik bantla tutulduğunu ve alt kısmının etiketlendiğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Dişiler çıkarıldıktan sonra her kuyunun görüntülenmesi. (A) Görüntüleme için yumurta içeren 24 kuyu plakasının üstünde dijital kamera. (B) Bir kuyunun tipik görüntüsü. (C) Çıkarılması gereken bacak içeren bir kuyu. (D) Bir dişinin 48 saat PBM'ye yerleştirilmiş bir kuyunun örnek görüntüsü. Yumurta sayımını zorlaştırabilecek koyu atılım işaretlerine dikkat edin (oklar). (E) Plakanın tüm kuyularının görüntülenmesini takiben hazırlanan bir görüntüleme sırası etiketini gösteren tüm plaka. Bu, analiz sırasında kuyuların tanınmasına yardımcı olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Daha iyi organizasyon için görüntüleri yeniden adlandırma. (A) Kamera tarafından otomatik olarak atanan adlara sahip bir görüntü sırası etiketi de dahil olmak üzere yumurta içeren kuyuların görüntüleri. (B) Aynı görüntüler plateID_wellID.jpg biçimle yeniden adlandırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: "Fiji" (ImageJ2) yazılımı kullanarak yumurtaları sayma. (A) " çoknoktalı" aracının vurgulanmış (turkuaz kare) olduğunu gösteren Fiji yazılımının ekran görüntüsü. (B) Yumurtalarda Fiji sayım işaretleri ile iyi bir görüntü. (C) Yakınlaştırma, daha büyük yumurta gruplarını sayarken yardımcı olur. (D) Ana penceredeki "çok noktalı" araç simgesini çift tıklatmak sayıyı (kırmızı daire) gösterir. (E) Tarama hızı hesaplama formülüne sahip bir elektronik tablo örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Larva diyet hazırlığı ve larva ve exuviae içeren bir kuyu. (A) Öğütülmüş balık yemi. (B) Bir bardakta 20 mL su. (C) Öğütülmüş balık yemi ve su karışımı. (D) Gıda / su 15 dakika için yerleşti. Bu karışımın üst kısmını larva yemi olarak alın. (E) Erimiş larvalarla iyi; temsili exuviae oklarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Gen susturma deneyinden gelen verileri sayın. Putatif demir taşıyıcıya (FeT) karşı dsRNA enjekte edilen sivrisinekler, kontrole (EGFP) kıyasla(A) yumurta sayısı, (B) larva sayısı ve (C) kapak oranında önemli bir azalma gösterdi. Barlar SD ± anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: Gen susturucu sivrisineklerde ek fenotipler gösteren kuyuların temsili görüntüleri. dsFeT gecikmiş atılım (koyu kahverengi işaretler) ve küçük, açık renkli yumurtalar gösterdi. Her tedavi için iki temsili kuyu gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ft | EAgal | |
| (1) Hazırlık | 20 dk 29,0 sn | 3 dk 49,3 sn |
| (2) F_in | 3 dk 55,0 sn | 1 dk 56,0 sn |
| (3) F_out/E_img | 43 dk 44,3 sn | 15 dk 28,3 sn |
| (4) L_img | 38 dk 03,5 sn | 9 dk 30,5 sn |
Tablo 1: EAgaL plaka yöntemine kıyasla sinek tüpü yönteminin (FT) tamamlanması için zaman gereksinimleri. (1) Hazırlık: Pamuk yerleştirmek, su dökmek ve Filtre kağıt diskini Drosophila yetiştirme tüplerine (FT) yerleştirmek ve agarose'un 24 kuyu plakası (EAgaL) kuyularına dökülmesine karşı zaman gerekir. (2) F_in: Tek tek sivrisinekleri yetiştirme tüplerine (FT) veya 24 kuyu plakasının (EAgaL) kuyularına yerleştirmek için gereken süre. (3) F_out/ E_img: Sivrisinekleri daha büyük bir kafese bırakmak, yumurta kağıdını çıkarmak, açılmak ve yumurtaları kağıda (FT) çekmek veya sivrisinekleri daha büyük bir kafeste serbest bırakmak ve 24 kuyu plakasının (EAgaL) her kuyusunu görüntülemek için gereken süre. (4) L_img: Soğuk anesteziden sonra küçük bir kapta (FT) veya 24 kuyu plakasının (EAgaL) her kuyusunda yumurtadan çıkan larvaları görüntülemek için gereken süre. FT için toplam 24 tüp kullanıldı.
| Toplu maliyetler | |||||
| EAgaL plaka | Sinek tüpleri | ||||
| madde | fiyat | miktar | madde | fiyat | miktar |
| 24 kuyulu tabaklar | $45.61 | 50'lik kasa | Kromatografi kağıt sayfaları | $103.63 | 46 × 57 cm 100 Yaprak/PK |
| Agarose | $250.97 | 500 gram | Sinek tüpü rafları + tüpler | $68.45 | 5 tepsi 100 |
| Olympus TG-6 | $375.00 | Sinek tüpü fişleri | $66.10 | 200'ler için vaka | |
| Pamuk topları | $104.27 | 2000 yılı davası | |||
| Başlangıç toplamı | $671,58 | Başlangıç toplamı | $342.45 | ||
| Birim maliyet (24 kuyu plakası veya 24 tüp) | |||||
| EAgaL plaka | Sinek tüpleri | ||||
| madde | fiyat | not | madde | fiyat | not |
| 24 kuyulu tabak | $0.91 | toplu fiyat/50 | Kromatografi kağıt sayfaları | $0.16 | 641.7 set 24 tüp değerinde(2) |
| Plaka başına agarose | $0.15 | 500g= 1667 plakalar(1) | Sinek tüpü rafları + tüpler | $3.29 | (toplu fiyat/500) × 24 |
| Sinek tüpü fişleri | $7.93 | (toplu fiyat/200) × 24 | |||
| Pamuk topları | $1.25 | (toplu fiyat/2000) × 24 | |||
| Birim toplamı | $1.06 | Birim toplamı | $12.63 | ||
Tablo 2: EAgaL plakası ile FT arasındaki maliyet karşılaştırması. Üst: Başlatma için toplu maliyetler (bir matkap ve matkap ucunun bir araştırmacı tarafından sağlanabileceğini varsayarsak). Alt: Bir 24 kuyu plakası (EAgaL plaka) ve 24 FT. (1) için tahmini maliyetler Bir plakanın 24 kuyu plakası (12mL), 15 mL% 2 = plaka başına 0.3 g agarose için biraz daha fazlasını gerektirdiğini varsayarsak, toplam 500 g agarose 1.667 plaka yapabilir. (2) Bir kağıt tabakası ~ 38 mm çapında disklerin 154'lerini yapabilir. 100 yaprak ile 641.7 (15.400/24) set 24 tüp yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAgaL plakası, FT yöntemine kıyasla Aedes aegypti'de bireysel doğurganlık ve doğurganlık tahlilleri yapmak için işgücünü, zamanı ve alanı büyük ölçüde azaltır. FT yöntemi ile EAgaL plakası arasındaki ön karşılaştırma, tüm adımlar için daha kısa sürelere neden oldu (FT yöntemine görüntüleme tekniği uygulandı) (Tablo 1). Referans olarak, tablo 2'debaşlangıç ve test başına (bir 24 kuyu EAgaL plakasına karşı 24 FT) maliyetlerin tahmini sağlanmaktadır.
EAgaL plakalarını kullanırken göz önünde bulundurulacak birkaç nokta vardır. İlk endişe, bu kadar küçük bir alana yerleştirilen sivrisineklerin sınırlı hareket nedeniyle tüm yumurtaları bırakmayabileceğiydi. Bunun böyle olup olmadığını belirlemek için, sivrisinekler toplu olarak EAgaL plakalarında 48 saat geçirdikten sonra ek 48 saat boyunca su ile bir kağıt havlu ile kaplı bir yumurtlama kabı ile daha büyük bir kafese aktarıldı. Sivrisinekler gerçekten de ek yumurta bıraktılar, ancak dişi başına ortalama yumurta sayısı sadece 2.1 idi, bu da hepsi olmasa da çoğu durumda herhangi bir istatistiksel analizin sonucuna herhangi bir fark yaratmaz. Bu sayılar test edilen 500'den fazla sivrisinektendir (veriler gösterilmez). Bununla birlikte, bu sadece açıklanan koşullarla Ae. aegypti "Liverpool" sivrisinek türü için olabilir. Her laboratuvarın sivrisinekleri ve koşulları için bunun böyle olup olmadığını test etmesi gerekebilir.
Görüntüleme için, stereomikroskopa bağlı bir kameranın tek görüntüsü, en düşük büyütmede bile tüm kuyuyu kaplamadı. Bu, kuyu başına birden fazla görüntü elde etmeyi ve buna karşılık görüntüleri yamalamayı veya aynı kuyunun birden fazla görüntüsünde üst üste binen yumurtaları takip etmeyi gerektiriyordu. Her iki yaklaşım da analizi ciddi şekilde karmaşıklaştırdı ve ilgili emeği önemli ölçüde artırdı. Ayrıca, stereomikroskopun doğası gereği, kamera açısı her zaman dik açıdan hafifçe sola veya sağa doğrudur, bu da sol veya sağ yan duvarın agarose yüzeyinin bir parçası olmasını sağlar.
Mikroorganizmalar, özellikle mantarlar tarafından kontaminasyon, tahlil sırasında bir sorun olabilir. Beyazlatma yumurtlamadan önce kirlenmeyi en aza indirebilse de, mantarlar böcek ortamında bulunabilir ve sivrisineklerin kendileri tarafından taşınabilir. Bu gibi durumlarda, böcek alanlarını temiz tutmak insidansı azaltabilir. Olası sorunları tespit etmek için bir EAgaL plakasını test etmek her laboratuvar için en iyisidir.
EAgaL plaka yönteminin sivrisinek kültürlerini erken larva aşamalarının ötesinde korumak için tasarlanmadığını unutmayın. Kuyu başına ortalama larva sayısı tipik olarak 60'ın üzerindeydi ve kuyu başına 100'den fazla larvaya sahip olmak olağandışı değildir. Bu, gelişimde gecikmeye, daha düşük yavru oranına ve çok küçük yetişkinlere neden olan kalabalık koşullar yaratır ve bu da aşağı akış çalışmalarını tehlikeye atabilir.
Şu anda bu yöntem sadece Ae. aegyptiile test edilmiştir. Bununla birlikte, şu anda uygulamasını diğer Aedes türlerine ve hatta Anopheles ve Culexgibi diğer sivrisinek cinslerine genişletmek için test ediliyor.
EAgaL plaka yöntemi için daha az zaman ve alan gereksinimi nedeniyle, doğurganlık ve doğurganlık tahlilleri yarı yüksek verime (yani, deney başına 5-10 plaka veya daha fazla) kadar ölçeklendirilebilir. EAgaL plaka yönteminin bu özelliği, sivrisineklerin insektisit testi, sterilite değerlendirmesi, transgenez ve gen düzenleme çalışmaları için önemli fitness parametrelerini değerlendirmek için son derece yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışma için çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Texas A&M Agrilife Research Böcek Vektörlü Hastalıklar Hibe Programı'nın finansmanı için teşekkür ederiz. Ayrıca, el yazmasını hazırlarken bu yöntem ve önerilerin geliştirilmesine yardımcı olan Adelman laboratuvar üyelerine ve Kevin Myles laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Ayrıca, bu makalenin daha iyi hale getirmek için yardımcı olan hakemlere ve editörlere teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
