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Biology

Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)

Published: May 4, 2021 doi: 10.3791/61232

Summary

Descrito es un método de ahorro de tiempo y espacio para contar los huevos y determinar las tasas de eclosión de mosquitos individuales utilizando 24 placas de cultivo de tejido de pozos, lo que puede aumentar sustancialmente la escala y la velocidad de los ensayos de fecundidad y fertilidad.

Abstract

Los mosquitos representan un importante problema de salud pública como vectores de diversos patógenos. Para aquellos estudios que requieren una evaluación de los parámetros de aptitud de los mosquitos, en particular la producción de huevos y las tasas de eclosión a nivel individual, los métodos convencionales han puesto una carga sustancial en los investigadores debido a la alta intensidad de mano de obra y los requisitos de espacio de laboratorio. Descrito es un método simple que utiliza la placa de cultivo de tejido de 24 pozos con agarosa en cada pozo y la proyección de imagen digital de cada pozo para determinar números del huevo y índices de la eclosión en un nivel individual con requisitos substancialmente reducidos del tiempo y del espacio.

Introduction

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El control de los mosquitos para proteger a los seres humanos de los patógenos transmitidos por vectores es un objetivo importante de salud pública, principalmente debido a la falta de vacunas efectivas para la mayoría de los patógenos transportados por los mosquitos. Muchos estudios tienen como objetivo reducir la aptitud de los mosquitos junto con una estrategia de reducción de la población aplicable en el campo1,2,3. Esto incluye amplios estudios para crear mosquitos transgénicos y/o líneas de knockout CRISPR/Cas9. Estos enfoques de modificación de la población requieren una evaluación detallada de los parámetros individuales de aptitud4. Las técnicas de laboratorio convencionales para evaluar la aptitud de los mosquitos hembra incluyen la contención individual de mosquitos hembra apareados y alimentados con sangre en contenedores de 100 mL5,tubos cónicos modificados de 50 mL, o tubos para la cría de Drosophila modificados mediante el suministro de superficies húmedas utilizando discos húmedos de algodón y papel de filtro para la oviposición (es decir, papeles de huevo)1,2,6,7. Tales métodos requieren un espacio relativamente grande (por ejemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para hasta 100 tubos de Drosophila) (Figura 1),y la manipulación de papeles de huevo individuales para contar huevos y larvas de eclosión, que pueden ser intensivos en mano de obra. Este manuscrito presenta un método para contar los huevos de mosquitos y determinar las tasas de eclosión utilizando 24 placas de pozos y agarosa como superficie de oviposición para evitar estos problemas8.

Simultáneamente, Ioshino et al.9 describieron un método detallado utilizando placas de 12 y 24 pozos para realizar el conteo de huevos obtenidos de hembras individuales. Su protocolo representó una mejora significativa de los métodos convencionales en el ahorro de tiempo y espacio9. Sin embargo, el protocolo que describieron continúa utilizando papel de filtro húmedo como superficie para la oviposición, lo que requiere desplegar cada papel individual para obtener recuentos, ya que los huevos a menudo se encuentran debajo o en pliegues. Su protocolo tampoco incluyó el uso de tecnologías de imágenes o un método para el conteo de larvas.

Se presenta un método mejorado para realizar ensayos de aptitud para el número de huevos (es decir, fecundidad) y la tasa de eclosión (es decir, fertilidad) utilizando agarosa como superficie de oviposición en un formato de placa de cultivo de tejido de 24 pozos para Ae. aegypti que oviposita en superficies húmedas. Estas placas fueron nombradas placas "EAgaL", de Egg, Agarose, y Larva. Estas placas de 24 pozos proporcionan a los mosquitos individuales una superficie mínima para poner huevos, simplificando y reduciendo drásticamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para contar y mantener los huevos y las larvas eclosionadas durante unos días. La placa EAgaL utiliza agarosa translúcida para la superficie de oviposición, lo que elimina la necesidad de manipular papeles de huevo y encontrar los huevos y larvas cuando eclosionan; fotografiar cada pozo establece un registro archivado a largo plazo de los resultados y separa el proceso de conteo tanto en tiempo como en espacio del proceso de cría / manipulación, donde el tiempo a menudo es limitado.

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Protocol

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1. Preparación de placas

  1. Perforar agujeros en 24 tapas de placas de cultivo de tejido de pozos (4−6 agujeros por pozo) utilizando un taladro doméstico con una broca de ~ 1,6 mm (1/16 pulgadas) (Figura 2).
    NOTA: Estos agujeros evitan que la condensación de agua de la agarosa se acumule en la tapa, donde los mosquitos pueden poner huevos. El tamaño estándar de la hembra Ae. aegypti ("cepa Liverpool") es de ~ 3,11 mm de envergadura. Se recomienda reducir el tamaño de los agujeros cuando se usan mosquitos más pequeños para evitar el escape de la placa.
  2. El día anterior al experimento de oviposición, lave y enjuague bien las placas y remojelas en lejía al 1−5% durante 30−60 min a temperatura ambiente. Enjuague bien con agua desionizada corriente y séquelos.
    NOTA: Este proceso reduce la posibilidad de que los hongos y bacterias crezcan en la agarosa.
  3. Derretir la agarosa al 2% en agua desionizada y añadir inmediatamente 500 μL de la agarosa fundida a cada pozo de las 24 placas de pozo utilizando una pipeta de 1.000 μL(Figura 3A,B). Cuando la agarosa comience a enfriarse y obstruir la punta de la pipeta, recaliente la agarosa y use una nueva punta de pipeta.
    NOTA: Evite tocar las paredes del pozo con la punta de la pipeta porque puede dejar un pedazo de agarosa en la pared donde una hembra puede poner huevos, complicando el proceso de imagen y conteo.
  4. Antes de su uso, seque cualquier condensación en las paredes del pozo durante la noche en un banco de laboratorio(Figura 3C,D).
    NOTA: La línea de tiempo del ensayo de la placa EAgaL desde la alimentación de la sangre hasta las imágenes larvarias se representa en la Figura 4,que es para mosquitos de colonia(Ae. aegypti "Liverpool" criado bajo 14 h luz: 10 h ciclo de luz oscura, 27 ° C, 80% de humedad relativa, 500 larvas en una bandeja de 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm con 2 L de agua), en condiciones insectarias. Se recomienda que cada laboratorio pruebe la placa EAgaL con los mosquitos que se utilizan, especialmente cuando se utilizan diferentes cepas, diferentes especies de mosquitos, así como diferentes protocolos de cría.

2. Alimentación de mosquitos

NOTA: Es fundamental utilizar mosquitos criados en condiciones uniformes para todos los grupos de tratamiento y grupos de control, ya que la nutrición larvaria tiene un impacto en los parámetros de aptitud de los mosquitos10,11. Larvas traseras en condiciones de poca gente con suficiente alimento. Deje que los mosquitos hembra se cierren en presencia de machos para que se asegure el apareamiento y maduren durante al menos 3 días.

  1. Retire cualquier fuente de agua y / o azúcar de los mosquitos hembra por lo menos 16 h antes de la alimentación con sangre con el fin de mejorar la alimentación de sangre.
  2. Calentar un circulador de agua para alimentación artificial a 37 °C y alimentar a mosquitos hembras utilizando sangre de vertebrados colocada en comederos artificiales durante 15−30 min (Figura 5A).
  3. Anestesiar a los mosquitos conCO2 o sobre hielo, transferirlos a un plato de cristal sobre hielo, y seleccionar los que están llenos de sangre (Figura 5B) en un recipiente provisto de 30% de agua de sacarosa durante más de 72 h, cuando las hembras terminan la excreción y el desarrollo del huevo.
    NOTA: Si a las hembras se les proporciona una concentración más baja de agua de sacarosa, retire el agua de sacarosa y cualquier superficie húmeda después de 48 h para evitar que las hembras se ospositen.

3. Oviposición

  1. Aproximadamente 1 h antes de transferir los mosquitos a las placas, agregue 2−3 gotas (~80−120 μL) de agua en cada pozo de placa usando una pipeta de transferencia.
  2. Al menos 72 h después de la alimentación de sangre, derribar mosquitos conCO2 o en hielo, transferirlos a un plato de vidrio sobre hielo, y colocar individualmente cada mosquito en una tapa invertida de la placa de 24 pozos sobre hielo (Figura 6A).
    NOTA: Este procedimiento se ha aplicado desde Ioshino et al.9.
  3. Una vez que se hayan colocado los 24 mosquitos, cubra la tapa con un fondo de placa invertida (Figura 6B), asegure la tapa y la placa con una banda elástica nueva y fresca y colóque la placa en una cámara ambiental (o sala de cría) (Figura 6C) hasta que los mosquitos se recuperen (~ 10−15 min) y gire la placa hacia arriba (Figura 6D).
  4. Permita que los mosquitos hembras se ovipositen durante 24−48 h y elimine a las hembras liberándolas de las placas en una jaula grande.
    NOTA: Si es importante realizar un seguimiento de las hembras individuales, anestesiarlas enfriando las placas y retírelas individualmente sobre hielo. Se observó retraso en la oviposición y excreciones oscuras que interfieren con el conteo de óvulos cuando las hembras fueron transferidas a los platos antes de 72 h después de la harina de sangre (PBM) (Figura 7D).

4. Conteo de huevos

  1. Revise cada pozo de la placa de 24 pozos, ya que a veces los mosquitos ponen huevos en la pared de los pozos y en el margen de la superficie de agarosa / plástico, donde son difíciles de resolver en fotografías. Con un pincel húmedo, mueva los huevos puestos en la pared y el borde de la agarosa a la superficie plana de la agarosa para que todos los huevos estén en un plano uniforme y no se superpongan entre sí.
    NOTA: El borde de la agarosa está típicamente fuera del plano focal de la cámara debido a la tensión superficial de la solución de agarosa.
  2. Usando fórceps, retire las patas rotas, las alas y otras partículas en los pozos que puedan interferir con los huevos de imágenes (Figura 7C).
  3. Inserte papel blanco debajo de la placa para aumentar el contraste con los huevos de mosquito oscuros antes de tomar imágenes utilizando un iluminador estereomicroscopio (Figura 7A).
  4. Tome una imagen de cada pozo utilizando una cámara digital compacta en modo microscopio, que permite al usuario enfocar objetos tan cercanos como 1 cm. Esta capacidad permite que la cámara se coloque directamente en la placa para obtener imágenes de huevos sin un trípode o un soporte (Figura 7A). Para distinguir los huevos individuales puestos en grupos, utilice el modo fino o súper fino para capturar imágenes de alta resolución para que se puedan ver los detalles del primer plano.
    NOTA: Borre la tarjeta de memoria de la cámara antes de usarla para evitar confusiones entre imágenes nuevas y antiguas.
  5. Después de fotografiar cada pozo de una placa, tome una imagen de toda la placa con una etiqueta de orden de imagen para distinguir cada placa más adelante (Figura 7E).
  6. Agregue una capa delgada ~ 5 gotas de agua (~ 200 μL) con una pipeta de transferencia a cada pozo para evitar que su tapón de agarosa y los huevos se sequen e inducir el desarrollo del embrión y la eclosión. Preste atención a los niveles de agua durante las primeras horas y verifique todos los días, porque puede haber pérdida de agua debido a la absorción por la agarosa o evaporación. Agregue agua cuando su nivel sea demasiado bajo para que las larvas eclosionen.
    NOTA: La evaporación del agua se produce de manera no uniforme tanto dentro de una placa como dentro de una pila de placas. Se ha observado que el secado se produce en el siguiente orden: 1) los pozos de esquina (A1, A6, D1, D6) se secan más rápido; seguido de 2) pozos en el borde exterior de la placa (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); y los últimos 3) pozos en su interior. Cuando las placas se apilan, la placa superior se seca más rápido.
  7. Transfiera las imágenes a una computadora con ImageJ (Fiji) y cambie el nombre de los archivos para facilitar la organización, como "[id. de placa]_[id. de pozo] .jpg" (Figura 8A,B).
  8. Cree un archivo de hoja de cálculo para registrar los números de huevos (es decir, la fecundidad) y los números de larvas y calcular la tasa de eclosión (es decir, la fertilidad) (Figura 9E).
  9. Abra las imágenes con ImageJ (Fiji)12 y use la herramienta "multipunto" para marcar cada huevo (Figura 9A−C); zoom-in o zoom-out usando la tecla "+" o "" para contar los huevos en grupos. Después de marcar todos los huevos, haga doble clic en el icono multipunto para que aparezca el número de marcas (Figura 9D). Registre los resultados en una hoja de cálculo.

5. Evaluación de la fertilidad

NOTA: En 2 días, las larvas del primer estadio pueden comenzar a eclose en los pozos. Espere de 3 a 5 días más antes de tomar imágenes/contar para asegurarse de que todos los huevos viables eclosionen.

  1. Prepare los alimentos larvales mezclando 1/16 cucharada (~ 168 mg) de alimentos para peces molidos (es decir, una dieta normal de larvas de mosquitos) en 20 mL de agua y esperando a que se asienten partículas sólidas grandes (Figura 10A−D). Comience a agregar alimento (el sobrenadante) a los pozos que contienen larvas eclosionadas tan pronto como aparecen, porque no sobreviven por mucho tiempo sin comida.
    NOTA: El exceso de adición de partículas de alimentos puede interferir con las imágenes y el recuento de larvas eclosionadas.
  2. Aproximadamente 5-8 días después de la adición de agua a los pozos, enfríe la placa cubriendo con hielo triturado durante 15-20 minutos para anestesiar las larvas.
  3. Tome imágenes de cada pozo mientras mantiene las placas en el hielo como se hizo con los huevos. Para las imágenes larvales, proporcione un fondo oscuro insertando un material negro debajo de la placa para ayudar a mejorar el contraste. Después de fotografiar cada pozo de una placa, tome una imagen de toda la placa con una etiqueta de orden de imagen para distinguir cada placa más adelante.
    NOTA: Las imágenes se toman mientras las placas están en el hielo porque el movimiento larval puede comprometer el conteo. Las placas son reutilizables; congelar y eliminar los mosquitos y la agarosa para limpiar para el próximo uso. La placa EAgaL no es adecuada para la cría de larvas en estadios avanzados.
  4. Abra imágenes con ImageJ (Fiji) y use la herramienta "multipunto" para contar haciendo clic en cada larva. Durante el período de 3 a 5 días, algunas larvas pueden haberse mudado, especialmente en pozos con un bajo número de larvas. Por lo tanto, al contar, excluya las cutículas de la vertiente (es decir, exuviae), que parecen larvas de cabeza solamente con un poco de cuerpo, o larvas encogidas (Figura 10E). Registre los resultados en la hoja de cálculo.

6. Realizar análisis

  1. Después de haber recopilado todos los datos necesarios para el análisis de fecundidad y fertilidad, realice el análisis estadístico apropiado y cree gráficos utilizando el software preferido.

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Representative Results

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Los mosquitos fueron inyectados con dsRNA apuntando a un transportador de hierro candidato (FeT) o gen de control (EGFP), alimentados con sangre, y medidos para la fecundidad y la producción de fertilidad utilizando el método de la placa EAgaL, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.

Los mosquitos en los que la expresión de FeT fue silenciada después de la inyección de dsRNA exhibieron una reducción significativa tanto en el número de huevos como en la tasa de eclosión (Figura 11AC). Todos los mosquitos del control y del tratamiento fueron colocados en las placas de EAgaL después de 72 h PBM. Los mosquitos silenciados por FeT también exhibieron excreción retardada y huevos pequeños y de color claro(Figura 12A,B). Los resultados de ejemplo también se pueden encontrar en Tsujimoto et al.8.

Figure 1
Figura 1: Tubos de mosca comúnmente utilizados para ensayos de fecundidad/fertilidad de mosquitos. (A) Un solo tubo con algodón húmedo y papel de filtro circular con tapa de esponja. (B)100 tubos en un rack (~30 cm x 30 cm). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Perforación de agujeros en una tapa de 24 pozos de placa de cultivo de tejido. (A) Perforación en proceso. (B)Una tapa con agujeros que evitan la condensación. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aplicación de agarosa (2% en agua) en los pozos. (A) Aplicar agarosa utilizando una pipeta de 1.000 μL. Tenga en cuenta que la punta no está tocando la pared del pozo. (B) Una placa que contiene agarosa en la parte inferior. (C) Pared de un pozo justo después de la agarosa solidificada. Tenga en cuenta la condensación en la pared. (D) Pared de un pozo cuando la condensación se evaporó. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Línea de tiempo desde la alimentación con sangre (día 0) hasta las imágenes larvarias (día 10-13). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Alimentación artificial de sangre y selección de hembras engorged. (A) Alimentación con sangre mediante alimentador artificial. (B) Selección de hembras engordadas sobre hielo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Transferencia de hembras a placa EAgaL. (A) Transferir hembras anestesiadas a una tapa de placa invertida sobre hielo. (B) Luego coloque cuidadosamente la placa invertida que contiene agarosa en la tapa invertida y (C) retire la placa con tapa unida del hielo y manténgala en una posición invertida hasta que las hembras se hayan recuperado de la anestesia. d,e) Gire la placa que contiene hembras a la posición ascendente. Tenga en cuenta que la tapa y la parte inferior de la placa están sostenidas por una banda elástica y que la parte inferior está etiquetada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Imágenes de cada pozo después de que las hembras fueron removidas. (A)Cámara digital en la parte superior de una placa de 24 pozos que contiene huevos para la obtención de imágenes. (B) Imagen típica de un pozo. (C) Un pozo que contiene una pierna, que debe ser removida. (D) Imagen de muestra de un pozo en el que se había colocado una hembra a 48 h PBM. Tenga en cuenta las marcas de excreción oscuras, que pueden complicar el conteo de huevos (flechas). (E) Placa entera que muestra una etiqueta de orden de imagen preparada después de la imagen de todos los pozos de la placa. Esto ayuda a reconocer los pozos durante el análisis. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Cambiar el nombre de las imágenes para una mejor organización. (A)Imágenes de pozos individuales que contienen huevos, incluida una etiqueta de orden de imagen con los nombres asignados automáticamente por la cámara. (B) Las mismas imágenes renombradas con formato plateID_wellID.jpg. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Conteo de huevos usando el software "Fiji" (ImageJ2). (A) Captura de pantalla del software de Fiji que muestra la herramienta "multipunto" resaltada (cuadrado turquesa). (B) Una imagen bien con Fiji cuenta marcas en los huevos. (C)El zoom ayuda a contar grupos de huevos más grandes. (D) Al hacer doble clic en el icono de la herramienta "multipunto" en la ventana principal se muestra el recuento (círculo rojo). (E) Un ejemplo de una hoja de cálculo con fórmula de cálculo de tasa de sombreado. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Preparación de la dieta larvaria y un pozo que contiene larvas y exuvias. (A) Alimento para peces molido. (B) 20 mL de agua en una taza. (C) Mezcla de alimento y agua para peces de tierra. (D)Comida/agua asentado durante 15 min. Tome el sobrenadante de esta mezcla como alimento larval. (E)Pozo con larvas mudas; las exuvias representativas se indican con flechas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Contar los datos de un experimento de silenciamiento de genes. Los mosquitos inyectados con dsRNA contra el transportador de hierro supuesto (FeT) exhibieron la reducción significativa de(A)número del huevo,(B)número larval, y(C)tarifa de la eclosión en comparación con el control (EGFP). Las barras muestran la media ± SD.  Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Imágenes representativas de los pozos que muestran fenotipos adicionales en mosquitos silenciados por genes. El dsFeT demostró la excreción retrasada (marcas marrones oscuras) y los huevos pequeños, ligeramente coloreados. Se muestran dos pozos representativos para cada tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Pies EAgaL
(1) Preparación 20 min 29.0 seg 3 min 49,3 segundos
(2) F_in 3 min 55.0 seg 1 min 56,0 seg
3) F_out/E_img 43 min 44,3 segundos 15 min 28,3 seg.
(4) L_img 38 min 03,5 seg. 9 min 30,5 segundos

Tabla 1: Requisitos de tiempo para completar el método del tubo de mosca (FT) en comparación con el método de placa EAgaL. (1) Preparación: Tiempo necesario para colocar algodón, verter agua e insertar el disco de papel de filtro en los tubos de cría de Drosophila (FT) en comparación con el vertido de agarosa en pozos de placa de 24 pozos (EAgaL). (2) F_in: Tiempo necesario para colocar mosquitos individuales en tubos de cría (FT) o pozos de la placa de 24 pozos (EAgaL). (3) F_out/E_img: Tiempo requerido para liberar mosquitos en una jaula más grande, eliminar, desplegar papel de huevo e imagen de los huevos en el papel (FT) o liberar mosquitos en una jaula más grande e imagen de cada pozo de la placa de 24 pozos (EAgaL). (4)L_img: Tiempo requerido para tomar imágenes de larvas eclosionadas en un recipiente pequeño (FT) o en cada pozo de la placa de 24 pozos (EAgaL) después de la anestesia fría. Un total de 24 tubos fueron utilizados para ft.

Costos a granel
Placa EAgaL Tubos de mosca
artículo precio cantidad artículo precio cantidad
Placas de 24 pozos US$ 45,61 Caso de 50 Cromatografía hojas de papel US$ 103,63 46 × 57 centímetros 100 Hojas/PK
agarosa US$ 250,97 500 gramos Estantes de tubos fly + tubos US$ 68,45 5 bandejas de 100
Olympus TG-6 US$ 375,00 Enchufes de tubo de mosca US$ 66,10 Caso de 200
Bolas de algodón US$ 104,27 Caso de 2000
Total de inicio US$ 671,58 Total de inicio US$ 342,45
Costo unitario (una placa de 24 pozos o 24 tubos)
Placa EAgaL Tubos de mosca
artículo precio nota artículo precio nota
una placa de 24 pozos US$ 0,91 precio a granel/50 Cromatografía hojas de papel US$ 0,16 641,7 juegos de 24 tubos por valor(2)
Agarosa por placa US$ 0,15 500g= 1667 placas(1) Estantes de tubos fly + tubos US$ 3,29 (precio a granel/500) × 24
Enchufes de tubo de mosca US$ 7,93 (precio a granel/200) × 24
Bolas de algodón US$ 1,25 (precio a granel/2000) × 24
Total de unidades US$ 1,06 Total de unidades US$ 12,63

Tabla 2: Comparación de costos entre la placa EAgaL y FT. Arriba: Costos a granel para el inicio (suponiendo que un taladro y una broca pueden ser proporcionados por un investigador). Abajo: Costos estimados para una placa de 24 pozos (placa EAgaL) y 24 FT.(1)Suponiendo que una placa requiere un poco más que lo suficiente para una placa de 24 pozos (12mL), 15 mL de 2% = 0.3 g de agarosa por placa, un total de 500 g de agarosa puede hacer 1,667 placas. (2) Una hoja de papel puede hacer 154 discos de ~ 38 mm de diámetro. Con 100 hojas, se pueden hacer 641.7 (15,400/24) conjuntos de 24 tubos.

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Discussion

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La placa EAgaL reduce drásticamente el trabajo de parto, el tiempo y el espacio para realizar ensayos individuales de fecundidad y fertilidad en Aedes aegypti en comparación con el método FT. La comparación preliminar entre el método de FT y la placa de EAgaL resultó en tiempos más cortos para todos los pasos (se aplicó la técnica de imagen al método de FT) (Tabla 1). Como referencia, en la Tabla 2 se proporciona una estimación de los costos de inicio y por ensayo (una placa EAgaL de 24 pozos frente a 24FTs).

Hay algunos puntos a tener en cuenta al utilizar las placas EAgaL. Una preocupación inicial era que los mosquitos colocados en un espacio tan pequeño pueden no poner todos los huevos debido al movimiento limitado. Para determinar si este era el caso, los mosquitos fueron transferidos colectivamente a una jaula más grande con una taza de oviposición forrada con una toalla de papel con agua durante 48 h adicionales después de que pasaron 48 h en las placas de EAgaL. De hecho, los mosquitos ponen huevos adicionales, pero el número promedio de huevos por hembra fue de solo 2,1, lo que no resulta en ninguna diferencia en el resultado de ningún análisis estadístico en la mayoría, si no en todos, los casos. Estos números provienen de más de 500 mosquitos analizados (datos no mostrados). Sin embargo, esto puede ser únicamente para la cepa de mosquito Ae. aegypti "Liverpool" con las condiciones descritas. Es posible que cada laboratorio necesite probar si este es el caso de sus mosquitos y condiciones.

Para la obtención de imágenes, la única imagen de una cámara conectada a un estereomicroscopio no cubría todo un pozo, incluso con el aumento más bajo. Esto requería obtener múltiples imágenes por pozo y a su vez parchear las imágenes, o realizar un seguimiento de los huevos superpuestos en múltiples imágenes del mismo pozo. Ambos enfoques complicaron seriamente el análisis y aumentaron significativamente el trabajo involucrado. Además, debido a la naturaleza de un estereomicroscopio, el ángulo de la cámara siempre es ligeramente izquierdo o derecho desde el ángulo perpendicular, lo que hace que el bloque de pared lateral izquierdo o derecho sea una parte de la superficie de la agarosa.

La contaminación por microorganismos, especialmente hongos, puede ser un problema durante el ensayo. Aunque el blanqueamiento puede minimizar la contaminación antes de la oviposición, los hongos pueden estar presentes en el ambiente insectario y transportados por los propios mosquitos. En tales casos, mantener limpios los espacios insectarios puede reducir la incidencia. Es mejor que cada laboratorio pruebe una placa EAgaL para detectar cualquier problema potencial.

Tenga en cuenta que el método de placa EAgaL no fue diseñado para mantener los cultivos de mosquitos más allá de las primeras etapas larvarias. El número promedio de larvas por pozo fue típicamente superior a 60, y no es inusual tener más de 100 larvas por pozo. Esto crea condiciones de hacinamiento, que resultan en un retraso en el desarrollo, una menor tasa de pupación y adultos muy pequeños, lo que puede comprometer los estudios posteriores.

Actualmente este método sólo se ha probado con Ae. aegypti. Sin embargo, actualmente se está probando para ampliar su aplicación a otras especies de Aedes e incluso a otros géneros de mosquitos como Anopheles y Culex.

Debido a los requisitos de tiempo y espacio reducidos para el método de placas EAgaL, los ensayos de fecundidad y fertilidad se pueden escalar hasta un rendimiento semi-alto (es decir, 5-10 placas o más por experimento). Esta característica del método de la placa EAgaL puede ser extremadamente útil para evaluar los parámetros importantes de la aptitud de mosquitos para la prueba del insecticida, la evaluación de la esterilidad, la transgénesis, y los estudios de edición del gen.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de interés para este estudio.

Acknowledgments

Agradecemos a Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program por su financiamiento. También agradecemos a los miembros del laboratorio de Adelman por su ayuda en el desarrollo de este método y sugerencias al redactar el manuscrito, así como a los miembros del laboratorio de Kevin Myles. También agradecemos a los revisores y editores por su ayuda para mejorar este manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.6 mm Φ drill bit alternatively heated nails can be used
1000 μL pipette tips (long) Olympus plastics 24-165RL
24-well tissue culture plate Thermo Scientific 930186 clear, flat-bottom with ringed lid plates
Agarose VWR 0710-500G
Compact digital camera Olympus TG-5/TG-6
Computer (Windows, Mac or Linux)
Deionized water
Fiji (imageJ) software download from: https://fiji.sc/
Forceps Dumont sharp forceps may break mosquito's body
Glass Petri dishes VWR
Household bleach
Household electric drill
illuminator for stereomicroscope (gooseneck)
P-1000 pipette Gilson
paint brushes
Rubber bands
SD card to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better)
Spreadsheet software (Microsoft Excel) Microsoft Any spreadsheet software works
TetraMin fish food Tetra ground with coffee grinder, blender or morter & pestle
Transfer pipetts VWR 16011-188

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para <em>Aedes aegypti</em> utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)
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Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates). J. Vis. Exp. (171), e61232, doi:10.3791/61232 (2021).More

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates). J. Vis. Exp. (171), e61232, doi:10.3791/61232 (2021).

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