Summary
Bu protokol, erken metastatik hastalığı tespit etmek ve makrometazelere sonraki ilerlemeyi tahmin etmek için meme kanseri kemik metastazlarının sıçan modelinde manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve pozitron emisyon tomografisinden (PET/BT) elde edilen görüntüleme parametrelerinin bir kombinasyonunu kullanmak üzere bir makine öğrenme algoritması yetiştirmek üzere tasarlanmıştır.
Abstract
Makine öğrenimi (ML) algoritmaları, bileşenlerini aşan bir doğrulukla sınıflandırma veya regresyon görevlerini gerçekleştirmek için farklı özelliklerin bir modele entegrasyonuna izin verir. Bu protokol, herhangi bir anormallik standart görüntüleme yöntemleri ile gözlemlenebilir önce bir sıçan modelinde meme kanseri kemik makrometazes büyümesini tahmin etmek için bir ML algoritması gelişimini açıklar. Böyle bir algoritma evreleme muayeneleri sırasında düzenli olarak kaçırılan erken metastatik hastalıkların (mikrometastaz) saptanması kolaylaşabilir.
Uygulanan metastaz modeli bölgeye özgüdür, yani sıçanlar sadece sağ arka ayaklarında metastaz gelişir. Modelin tümör alma oranı %60-%80 arasındadır, makrometazonlar manyetik rezonans görüntülemede (MRG) ve pozitron emisyon tomografisinde (PET/BT) indüksiyondan 30 gün sonra hayvanların bir alt kümesinde görünür hale gelirken, hayvanların ikinci bir alt kümesitümör büyüme göstermez.
Daha erken bir zaman noktasında edinilen görüntü incelemelerinden başlayarak, bu protokol MRG ile saptanan doku vasküvasomunu, PET/BT ile glukoz metabolizmasını gösteren özelliklerin çıkarılmasını ve makrometastatik hastalığın tahmini için en uygun özelliklerin belirlenmesini açıklamaktadır. Bu özellikler daha sonra iki gruptan biri olarak hayvanları sınıflandırmak için bir model ortalama nöral ağ (avNNet) içine beslenir: metastaz gelişecek ve diğer herhangi bir tümör geliştirmek olmaz. Protokol ayrıca, genel doğruluk, duyarlılık, özgüllük, negatif/pozitif tahmin değerleri, olasılık oranları ve bir alıcı çalışma karakteristiğinin geliştirilmesi gibi standart tanıparametrelerinin hesaplanmasını da açıklar. Önerilen protokolün bir avantajı esnekliğidir, çünkü sınırsız sayıda özellik içeren ayarlanabilir kombinasyonlarla farklı ML algoritmaları bir bolluğu eğitmek için kolayca adapte edilebilir. Ayrıca, onkoloji, enfeksiyon ve inflamasyon farklı sorunları analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Bu protokolün amacı, MRI ve PET/CT'den çeşitli fonksiyonel görüntüleme parametrelerini model ortalamasılı bir sinir ağı (avNNet) ML algoritmasına entegre etmektir. Bu algoritma erken bir zaman diliminde meme kanseri kemik metastazları bir sıçan modelinde makrometazazların büyümesini tahmin, kemik içinde makroskopik değişiklikler henüz görünür değildir.
Makrometazların büyümesi öncesinde, yaygın olarak mikrometastatik hastalık olarak adlandırılan, yaygın olarak adlandırılan tümör hücrelerinin bir kemik iliği invazyonu oluşur1,2. Bu ilk invazyon metastatik hastalıkta erken bir adım olarak kabul edilebilir, ancak genellikle konvansiyonel evreleme muayeneleri sırasında cevapsız3,4. Mevcut görüntüleme yöntemleri tek başına kullanıldığında kemik iliği mikroinvazını tespit edemese de, vaskülarizasyon ve metabolik aktivite hakkında bilgi veren görüntüleme parametrelerinin bir kombinasyonunun daha iyi performans gösterdiği gösterilmiştir5. Bu tamamlayıcı fayda, farklı görüntüleme parametrelerinin ml algoritması olan bir avNNet'e birleştirilmesiyle elde edilir. Böyle bir avNNet herhangi bir görünür metastaz lar mevcut önce kemik makrometaztazoluşumunun güvenilir tahmin sağlar. Bu nedenle, görüntüleme biyobelirteçlerinin bir avNNet'e entegre edilmesi kemik iliği mikroinisti ve erken metastatik hastalık için bir taşıyıcı parametre görevi görebılabilir.
Protokolü geliştirmek için, çıplak sıçanlarda meme kanseri kemik metastazları daha önce açıklanan bir model kullanılmıştır6,7,8. Bu modelin avantajı site özgüllüğüdür, yani hayvanlar sadece sağ arka ayaklarında kemikli metastazlar geliştirirler. Ancak bu yaklaşımın tümör alma oranı %60-%80'dir, bu nedenle önemli sayıda hayvançalışma sırasında metastaz gelişmez. MRG ve PET/BT gibi görüntüleme yöntemleri kullanılarak metastaz varlığı enjeksiyon sonrası 30 günden (PI) saptanabilir. Daha önceki zaman noktalarında (örn. 10 PI) görüntüleme metastatik hastalık gelişecek hayvanlar la bu hastalık arasında ayrım yapmaz (Şekil 1).
Aşağıdaki protokolde açıklandığı gibi, 10. Sinir Ağları yapay düğümleri farklı katmanlar içinde birleştirir. Çalışma protokolünde, kemik iliği kan akımı ve metabolik aktivite için fonksiyonel görüntüleme parametreleri alt tabakayı temsil ederken, malignite tahmini üst tabakayı temsil eder. Ek bir ara katman, hem üst hem de alt katmana bağlı gizli düğümler içerir. Farklı düğümler arasındaki bağlantıların gücü yüksek doğruluk la ilgili sınıflandırma görevi gerçekleştirmek için ağın eğitimi sırasında güncelleştirilir9. Böyle bir sinir ağının doğruluğu daha da çeşitli modellerin çıkışları ortalama tarafından artırılabilir, bir avNNet sonuçlanan10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm bakım ve deneysel işlemler hayvan koruma ulusal ve bölgesel mevzuata uygun olarak gerçekleştirildi ve tüm hayvan prosedürleri Franconia, Almanya Devlet Hükümeti tarafından onaylandı (referans numarası 55.2 DMS-2532-2-228).
1. Çıplak sıçanların sağ arka bacağında meme kanseri kemik metastazlarının indüksiyonu
NOT: Çıplak sıçanlarda meme kanseri kemik metastazlarının indüksiyonunun ayrıntılı bir açıklaması6,8. En ilgili adımlar aşağıda sunulmuştur.
- RPMI-1640 kültür MDA-MB-231 insan meme kanseri hücreleri, ile takviye 10% fetal baldır serumu (FCS). Hücreleri standart koşullarda (37 °C, %5 CO2)koruyun ve hücreleri haftada 2-3 kez iletin.
- Fosfat tamponlu salinde (PBS) 2 mM EDTA ile yakın konflufluent MDA-MB-231 hücrelerini yıkayın ve hücreleri %0,25 tripsin ile ayırın. Hücre konsantrasyonunu Neubauer'in odasıyla belirleyin ve 200 μL RPMI-1640'ta 1.5 x 105 hücre/200 μL konsantrasyonla yeniden askıya alın.
- 6-8 haftalık çıplak sıçanları kullanın ve patojensiz, kontrollü koşullarda (21 °C ± 2 °C oda sıcaklığında, %60 nem ve 12 saat açık-koyu ritim) altında tutun. Otoklavlı yem ve su reklamı libitum sunun.
- Ameliyatı yapmadan önce, subkutan bir analjezik ilaç (örneğin, Carprofen 4 mg/kg) enjekte edin. Bir izofluran (1-1.5 vol. %)/oksijen karışımı 2 L/dk akış hızında olan fareleri anestezik.
- Ameliyat için, 16x büyütme ile bir işletim mikroskop kullanın.
- Farenin sağ inguinal bölgesinde 2-3 cm kesim yapın. Femoral arter (FA), yüzeysel epigastrik arter (SEA), inen geniküler arter (DGA), popliteal arter (PA) ve safenöz arter (SA) dahil olmak üzere sağ inguinal bölgedeki tüm arterleri diseksiyon. FA iki çıkarılabilir klips yerleştirin: BIR SEA başına proksimal ve DGA başına başka doğrudan proksimal.
- SEA'nin distal kısmını sıvılaştırın. SEA'nin duvarından bir kesik yapın ve SEA'ye 0,3 mm çapında bir iğne yerleştirin. Adım 1.2'den hücre süspansiyonu içeren bir şırınga iğneye bağlayın. Distal klibi FA'dan çıkarın ve bunun yerine SA'yı kırpın.
- MDA-MB-231 hücre süspansiyonuna 1.2 (1.5 x 105 hücre/200 μL) adımdan yavaşça enjekte edin. İğneyi çıkarın, SEA'yi sıvılaştırın ve arter klipslerini çıkarın. Cerrahi klipsler kullanarak yarakapatın ve anestezi son. Tümör boyutunu ve ağrı herhangi bir kanıt değerlendirmek için günlük hayvanları izleyin.
2. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG)
NOT: MRI prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen Bäuerle ve ark.11'ebakın.
- Özel bir deneysel tarayıcı (Malzeme Tablosunabakın) veya uygun bir hayvan bobini ile bir insan MR sistemi kullanarak MRI 10 gün PI gerçekleştirin.
- Yukarıda açıklandığı gibi bir izofluran (1-1.5 vol. %)/oksijen karışımı ile sıçan anestezi. Farenin kuyruk damarına bir kateter yerleştirin ve kuyruğuna bantlayın. Kontrast maddeyi içeren bir şırınga bağlayın (yaklaşık 0,5 mL'de 0,1 mmol/kg Gd-DTPA).
- Anestezili fareyi MR sistemine yerleştirin. Sağ arka bacağın distal femur ve proksimal tibiasını anatomik bir dizide bulun (örn. T2 ağırlıklı turbo spin yankı dizisi; TR = 8.654 ms; TE = 37 ms; matris 320 x 272; FOV = 65 mm x 55 mm; dilim kalınlığı = 1 mm; tcan süresi 11:24 dk).
- Sağ arka bacağın distal femur ve proksimal tibiasını kaplayan dilimleri belirleyin ve DCE-MRI dizisini başlatın (örn. hızlı düşük açılı atış sırası; TR = 3.9 ms; TE = 0.88 ms; matris = 256 x 216; FOV = 65 x 54 mm2; dilim kalınlığı = 1 mm; 8 dilim; 100 zaman puanı; tcan süresi = 8:25 dk). 30 s sonra, 10 s bir süre içinde kontrast madde enjekte başlar.
NOT: MR II incelemesi için toplam süre hayvan başına yaklaşık 20 dakikadır.
3. Pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)
NOT: PET prosedürlerinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfenCheng'eal. 12 adresinden bakınız.
- Özel bir deneysel tarayıcı kullanarak PET/CT görüntüleme10 gün PI gerçekleştirin (bkz.
- Görüntülemeden önce hayvanları oruç tutun. Adım 2.2'de açıklandığı gibi sıçan anestezi ve yukarıda açıklandığı gibi kuyruk damarına bir kateter takın.
- Enjekte 6 MBq 18F-Fluorodeoxyglucose(18F-FDG) kuyruk damariçine ve izleyici düzgün dağıtmak için izin ~ 30 dk bekleyin.
- CT kazanım (tüp gerilimi = 80 kV, tüp akımı = 500°A, isotropik çözünürlük = 48,9 μm, süre = 10 dk) gerçekleştirin.
- Statik bir PET kazanımı gerçekleştirin (alt/üst ayrımcı seviye = 350/650 keV; zamanlama penceresi = 3.438 ns; süre = 15 dk).
4. Alternatif görüntüleme stratejileri
- Arka bacaktaki MDA-MB-231 hücrelerinin erken değerlendirilmesi için, biyolüminesans için1,5 x 10 5 etiketli hücre /200 μL (yani, luciferin ifade eden hücreler, MDA-MB-231-LUC13)veya floresan görüntüleme (örn. yeşil veya kırmızı floresan proteini ifade eden hücreler, MDA-MB-231-G/RFP13). Tümör hücresi aşısı sonrası intraosseöz MDA-MB-231 hücrelerini saptamak için preklinik optik görüntüleme için sistemi kullanın14.
- MRI7ile karşılaştırılabilir vaskülarizasyon morfolojik ve fonksiyonel parametreleri türetmek için mikrokabarcıklar intravenöz enjeksiyon sonra özel bir tarayıcı kullanarak deneysel ultrason gerçekleştirin.
5. MR Analizi
- DCE Plugin16'ya sahip bir DICOM görüntüleyici15 kullanın ve üst menüdeki "Import" düğmesine tıklayarak, 2.4 adımdan MR görüntülerini içeren DICOM klasörünü seçerek ve üst menüde "4D Viewer" düğmesine tıklayarak DCE sırasını 4D modunda yükleyin.
- Bu merkez görüntüleri daha kararlı sonuçlar sağladığından, tercihen 8 görüntüden oluşan diziden 4 veya 5 görüntü numaralarını kullanarak, sağ arka bacağın proksimal tibial şaft kemik iliği içinde, 1,5 mm2hedef boyutuna sahip dairesel 2 boyutlu bir ilgi bölgesi (ROI) yerleştirin.
- Üst menüden DCE eklentisini başlatın, " ÇizimTürü" alanında "Göreli Geliştirme" seçeneğini belirleyin ve bu sayıları ilgili alanlara yazarak 1 ile 5 arasında değişen zaman aralığını tanımlayın. İlgili düğmeyle analizleri .txt dosyası olarak dışa aktarın ve dosya adı olarak "DCEraw.txt"i seçin.
- RStudio17'yi açın ve "Dosya "menüsünden sağlanan DCE-Script.R dosyasını "Open File" seçeneğini seçerek yükleyin. Menüden "Kodu", sonra "Run Region" ve ardından " Tümünü Çalıştır " seçeneğini seçerek tüm komut dosyasınıçalıştırın. Çıktıyı "ImagingFeatures.xlsx" (Şekil 2)adlı şablon dosyasına kopyalayın.
- DICOM görüntüleyicide, normalleştirme amacıyla kas DCE ölçümlerini elde etmek için hayvanın arka kasının içine ikinci bir yatırım getirisi yerleştirin ve 5.2-5.4 adımlarını tekrarlayın. "ImagingFeatures.xlsx" elektronik tablosunda, ilgili kemik ölçümleri normalleştirme amacıyla ilgili kas ölçümlerine göre otomatik olarak bölünür.
- Tüm hayvanlar için 5.1-5.5 adımlarını tekrarlayın ve elektronik tabloyu tamamlayın.
6. PET/CT analizi
- PET/CT analiz yazılımını açın ve 3.FileManual import Ct.img.hd ve pet.img.hdr dosyalarını işaretleyin. "Aç" seçeneğini tıklatın ve "Tümünü Al"ıseçin.
- "Genel çözümleme" seçeneğini seçerek veri kümelerini açın, ardından "Ok" seçeneğini belirleyin.
- "ROI Quantification" seçeneğini belirleyin, ardından "Oluştur", ardından "Şablondan bir YG oluştur" seçeneğini belirleyin. Sağ arka bacağın proksimal tibial şaft kemik iliği içine yaklaşık 4 mm x 6 mm 2 boyutlu bir yatırım getirisi yerleştirin.
- "ROI (Hedef 1 bindirme)" seçeneğini belirleyin ve Bq/mL'deki ortalama, minimum ve maksimum değerleri yazın.
- Maksimum standart alım değerini (SUVmax):Maksimum değeri (Bq/mL) enjekte edilen aktiviteye bölün ve sonucu gram cinsinden hayvanın ağırlığıyla çarpın. Sonucu elektronik tabloya girin (Şekil 2).
7. Tümör alma oranının belirlenmesi
- Sağ arka bacakta tümör büyümesini teşhis etmek için, yukarıda açıklandığı gibi, 30 PI gününde MR ve PET/BT görüntülemesini tekrarlayın.
NOT: Tümörler 30 pi gününde açıkça görülebilen ve T2w-hiperintense lezyonlar ve MRG'de net kontrast geliştirmesi ile PET/BT'de açıkça yüksek bir SUVmax ile birlikte görünür olacaktır. Önceki deneylere göre hayvanların %60-80'inde sağ arka bacağında metastaz gelişecektir. - Ek bir "Tümör" sütunu ekleyerek elektronik tabloyu tamamlayın ve metastaz sunan her hayvan için "1" ve görünür tümör yükü olmayan her hayvan için "0" girin(Şekil 2). Elektronik tabloyu İndirme klasöründe "ImagingFeatures.xlsx" olarak kaydedin.
8. Özellik seçimi
- Gelecekteki tümör büyümesini tahmin etmek için en uygun özellikleri belirlemek için, elektronik tabloyu açık kaynak veri görselleştirme, makine öğrenimi ve veri madenciliği araç seti18'eaktarın.
- Veri menüsünden Dosya alt yordamını sağdaki çalışma alanına çizin ve çift tıklatın. "Klasör" simgesine tıklayarak ve "ImagingFeatures.xlsx" dosyasını seçerek elektronik tabloyu yükleyin. "Export" çalışma sayfasını seçin ve hedef niteliğini "Tümör" değişkenine atayın. Hayvan sayısına "Atla" işlevini atayın (Şekil 3).
- Veri menüsünden "Rank" alt yordamını çalışma alanına çizin ve aralarında bir çizgi çizerek "Dosya" ve "Sıralama" alt yordamlarını bağlayın.
- "Rank" alt yordamını simgesine çift tıklayarak açın ve "Bilgi Edinme" algoritmasını seçin19.
- Edinilen beş parametreden, daha fazla analiz için ilk üç 'ü kullanın (SUVmax,PE ve AUC).
Not: Bu parametreler metabolik aktiviteyi (SUVmax)ve doku vaskülarizasyonu (PE ve AUC) yansıtır.
9. ML analizi
- RStudio 3.4.117'yi açın ve verilen TrainModel.R-Script'i "Dosya" menüsünden yükleyin.
- Gerekli kitaplıkları yükleyin (bu sadece bir kez yapılmalıdır) yazarak: install.packages(c("caret", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.EZR", "ggplot2"))
- Gerekli kitaplıkları yüklemek ve İndirilenler klasörünü çalışma dizini olarak ayarlamak için TrainModel.R Script içindeki 3-5 satırlarını seçin.
- Menüiçinde "Kodu" tuşuna basarak seçili kodu çalıştırın ve ardından "Seçili Satırı Çalıştır"ıçalıştırın..
10. Bir avNNet ML algoritması eğitimi
- AvNNet algoritmasını eğitmek için TrainModel.R-Script'ten 8-39 satırlarını seçin (bkz. adım 9.1).
- Menüiçinde "Kodu" tuşuna basarak seçili kodu çalıştırın ve ardından "Seçili Satırı Çalıştır"ıçalıştırın..
11. ML algoritmasının sonuçlarının analizi
- Tanısal doğruluk (duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif tahmin değerleri ve olasılık oranları) standart parametrelerini değerlendirmek için TrainModel.R-Script'ten 41-50 satırlarını seçin.
- Menüiçinde "Kodu" tuşuna basarak seçili kodu çalıştırın ve ardından "Seçili Satırı Çalıştır"ıçalıştırın..
12. Son modelin Alıcı Çalışma Özelliği (ROC) eğrisini kurucu parametrelerinIN ROC eğrileri ile karşılaştırması
- Modelin ROC eğrisini kurucu parametrelerinin ROC eğrileriyle karşılaştırmak için DeLong testlerini gerçekleştirmek için TrainModel.R-Script'ten 52-62 satırlarını seçin (bkz. adım 9.1).
- Menüiçinde "Kodu" tuşuna basarak seçili kodu çalıştırın ve ardından "Seçili Satırı Çalıştır"ıçalıştırın..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıçanlar MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin cerrahi ve enjeksiyonu ile hızlı bir şekilde iyileşti ve daha sonra 10 ve 30 PI günlerinde MR ve PET/BT görüntülemeye tabi tutuldular(Şekil 1). Bir sıçanın sağ proksimal tibia temsili DCE analizi Şekil 2Asunulmaktadır. DCE ham ölçümleri "Export" butonunu seçerek ve dosya adı olarak "DCEraw.txt" seçilerek kaydedildi.
Dinamik parametreler, AUC, PE ve washout sonraki hesaplamalar ilgili komut dosyası ile RStudio yapıldı. DCE ölçümlerinin çıktısının "İndirilmeler" klasöründe "DCEraw.txt" olarak kaydedilmesi gerekiyordu, böylece komut dosyası şekil 2B'detasvir edildiği gibi veri tablosu sağlamak için ek yapılandırmalar olmadan doğrudan çalıştırılabiliyordu. Bu veriler sağlanan elektronik tabloya(Şekil 2C)kopyalanmıştır. Benzer şekilde, kas dokusu için DCE parametreleri belirlendi ve elektronik tabloya aktarıldı (Şekil 2D,E). Bu değerler kemik ölçümlerinin kas ölçüleri ile bölünmesi ile normalleştirildi; bu elektronik tablo içinde otomatik olarak gerçekleştirildi. PET/CT'den hesaplanan SUVmaksimum değerleri daha sonra tabloya aktarıldı (Şekil 2F).
30 PI gününde tüm hayvanlar metastaz geliştirip geliştirmediklerini belirlemek için değerlendirildi ve tablo pozitif tümör yükünü "1" ve sağlıklı hayvanlar ise "0" olarak kodlayarak elektronik tablonun en sağ sütununda(Şekil 2C)tamamlandı.
Elektronik tablo açık kaynak veri görselleştirme, makine öğrenme ve veri madenciliği araç içine ithal edildi ve özellik sıralaması suvmaxortaya , PE, ve AUC metastatik hastalık tahmini için ilk üç özellikleri olarak(Şekil 3). Bu parametreler metabolik aktiviteyi (SUVmax)ve doku vaskülarizasyonu (PE ve AUC) yansıtır.
TrainModel.R Script'in çalıştırıldığı hesap tablosu otomatik olarak alındı ve bir avNNet hesapladı. Optimal hiperparametre kombinasyonu belirlendi (Şekil 4A) ve son model optimal hiperparametre kombinasyonu kullanılarak hesaplandı (Şekil 4B). Daha sonra, standart tanı parametreleri kümesi(Şekil 4C)hesaplandı ve modelin ROC eğrisi çizildi (Şekil 4D).
Olumlu sonuç Şekil 4B–D'degösterilmiştir. Modelin ROC eğrisinin üç bileşeninin ROC eğrisi ile karşılaştırılması (yani, AUC, PE ve SUVmax)modelin üç bileşeninin tümünden (P = 0.01 AUC için, p = 0.003 PE ve p = 0.007maxSUV için) önemli ölçüde daha iyi performans gösterdiğini ortaya koymuştur. Seçilen üç parametrenin avNNet ile birleşimi daha duyarlıydı ve böylece makroskopik hastalığın genel doğruluk oranı %85,7 (%95 güven aralığı = %67,3-%96,0) ile tahmin edildi. Bu sonuçlar 28 numunenin analizinden elde edildi. Hayvan sayısı artırılarak güven aralıkları daha da daraltılabilir.
Burada açıklandığı gibi olumsuz sonuçlar elde edilebilir. Doğruluk ölçümleri, belirli makine öğrenimi algoritmaları türlerine ve veri ön işleme adımlarına son derece duyarlıydı. Özellikle nöral ağlar, giriş verileri normalleştirildiğinde daha iyi performans gösterme eğilimindeydi. Bu protokol bölüm 10 "BoxCox" fonksiyonu (satır 22 ve 36 verilen TrainModel.R-Script içinde) elde edilmiştir. Normalleştirme den kaçınmak ve farklı bir algoritma kullanarak (örneğin, bir sinir ağı ortalama değil), "nnet" (satır 21 ve 35 sağlanan TrainModel.R-Script içinde) değiştirerek, ROC eğrisi altında 0.594 bir alan sonuçlandı(Ek Şekil 1). Böyle bir model üç bileşenini önemli ölçüde daha iyi performans gösteremedi (tüm p > 0.15).
Komut dosyası RStudio 3.4.1 ve caret paket sürümü 6.0-84 için optimize edilmiş olduğundan, farklı yazılım sürümleri kullanarak farklı sonuçlar verebilir. Bu el yazmasında kullanılan yazılım sürümleri ile sağlanan komut dosyaları çalıştırıldaştırılacak benzer sonuçlar verecektir. Ancak, okuyucular komut dosyasını değiştirmeyi, ek değişkenler eklemeyi, belge klasörlerini veya dosya adlarını değiştirmeyi veya makine öğrenimi algoritmalarını daha ayrıntılı olarak değiştirmeyi hedefliyorsa, kodun ilgili ayarlamaları gerekir. Bu gibi durumlarda, caret paketinin kılavuzu derinlemesine açıklamalar sunar20.
Şekil 1: Temsilci MR ve PET/CT görüntüleri. Çalışma boyunca metastaz geliştirmemiş bir hayvanın sağ arka bacağının MR ve PET/CT görüntüleri (10. günden ve 30 PI'den görüntülerle en sol iki sütun) ve 10 gün ile 30 PI günü arasında metastaz gelişen bir hayvan (oklarla işaretlenmiş iki sağ sütun, metastaz). T2w görüntülerinde metastazların yüksek sinyal yoğunluğuna (üst sıra), eğrinin altındaki artan alantarafından gösterilen kontrast geliştirmesini (AUC; ikinci sıra) ve PET/CT'deki (SUVmax; üçüncü sıra) artırılmış maksimum standart alım değerine dikkat edin. 30 PI gününde metastazlı hayvan ile kemik metastazı gelişmemiş hayvan arasında 10 inci gün (birinci ve üçüncü sütun) elde edilen görüntülerde gözle görülür bir fark olmadığını unutmayın. Bu rakam Ellmann ve ark.5'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görüntüleme özelliklerinin değerlendirilmesi ve bir elektronik tabloya derlenmesi. (A) proksimal tibia kemik iliği dinamik kontrast geliştirme bir DCE eklentisi16kullanılarak bir freeware DICOM görüntüleyici15 ile analiz edildi. İlgili ölçümler kaydedildi ve (B) rstudio17sağlanan DCE-Script.R-dosyası ile daha fazla analiz edildi. (C) Çıktı bir elektronik tabloya kopyalandı (şablon için ek malzemeye bakın). (D) Aynı şekilde, komşu kas dokusu için DCE ölçümü yapıldı, RStudio (E) kullanılarak analiz edildi ve daha sonra elektronik tabloya kopyalandı. Veriler, kemik ölçümlerinin sonuçlarıkas ölçümlerinin sonuçlarına(C; somon gölgeli hücreler) bölünerek normalleştirildi. (F) PET/CT ölçümleri satıcının yazılımı ile gerçekleştirilmiştir. Maksimum standart alım değeri, ilgili ölçümün enjekte edilen aktiviteye bölünmesi ve hayvanın vücut ağırlığıyla çarpılması yla hesaplanmıştır. Sonuç daha sonra elektronik tabloya kopyalandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Özellik sıralaması. Edinilen görüntüleme özelliklerinin sıralaması açık kaynak veri görselleştirme, makine öğrenimi ve veri madenciliği araç kiti18 içinde elektronik tabloyu "Dosya"-alt yordamı üzerinden ithal ederek ve "Rank"-subroutine ile analiz ederek gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsilci RStudio çıktısı. Makine öğrenme algoritması verilen TrainModel.R-Script dosyası ile RStudio17 kullanılarak geliştirilmiştir. (A) Model ortalaması nöral ağ için farklı hiperparametre kombinasyonları arasında bir ızgara arama optimum olarak üç nöron ve 0.0005 bir çürüme boyutu ortaya. (B) Bu hiperparametre kombinasyonu kullanılarak, tam bir ağ eğitildi ve çapraz doğrulanmış, genel doğruluk %85.7'ye ulaştı. (C) Duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif tahmin değerleri ve olasılık oranları dahil olmak üzere tanısal doğruluğun standart parametreleri bir karışıklık matrisinden hesaplanmıştır. (D) Çapraz doğrulanmış modelin temsili ROC çizimi 0,917 eğrisi (AUC) altında bir alan ortaya çıkardı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Negatif sonuç. ML algoritmasının ortalama olmadan bir Sinir Ağı'na değiştirilmesi ve giriş parametrelerinin normalleştirilmesinden kaçınması, ROC eğrisinin eğrisi altındaki alanın 0,917 'den(Şekil 4D)0,594'e düşmesine yol açtı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil 2: Alternatif özellik sıralaması. Şekil 3'tegösterilen standart yöntemin aksine, sıralamada önemi de yer alan rasgele bir değişken ("Rastgele"; mavi ile vurgulanmış) da sunulmuştur. Bu yaklaşım değişkenlerin uygulanan seçim doğruladı SUVmax, PE, ve AUC. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ML algoritmaları, birkaç tahmine dayalı özelliği birleştirilmiş modele entegre etmek ve tek başına kullanıldığında ayrı bileşenlerinin kini aşan bir doğruluk elde etmek için kullanılan güçlü araçlardır. Yine de, gerçek sonuç birkaç kritik adıma bağlıdır. Farklı ML algoritmaları farklı sonuçlar verdiğiiçin kullanılan ML algoritması ilk olarak çok önemli bir faktördür. Bu protokolde kullanılan algoritma bir avNNet, ancak diğer umut verici algoritmalar Extreme Gradient Boosting21 veya Random Forests içerir. RStudio için caret paketi20 farklı algoritmalar (şu anda >175) bir bolluk sağlar ve önerilen protokol sadece kod tek satırları değiştirerek bir algoritma diğerine geçiş açısından son derece esnektir (örneğin, yöntem = "avNNet" yöntemi ="rf" olarak değiştirme) ve ilgili ML algoritması TunedGrid ayarları adapte. Ayrıntılar için, caret github deposu22bakın. Fernández-Delgado ve ark.23 tarafından farklı algoritmalara ve farklı sınıflandırma sorunlarına göre performanslarına mükemmel bir bakış yayınlandı ve diğer deneyler için bir başlangıç noktası olabilir.
Bir diğer önemli faktör ml algoritması dahil ilgili özelliklerin seçimidir. Bu protokol, mevcut özellikleri azalan sırada sıralamak ve avNNet'i eğitmek için en alakalı olanları kullanmak için filtre yöntemi olan "Bilgi Edinme"19'unkullanımını önerir. Filtre yöntemleri yalnızca tahmin etmek için değişkenle korelasyon gibi genel varsayımlara dayanır, bu nedenle araştırmacılar24,25kullanılan sınıflandırıcıdan bağımsız olarak özellikleri önceden seçmelidir. Bu tür yöntemler özellikle hesaplama süresinde etkilidir ve aşırı yakışmaya dayanıklıdır. Ancak, alakasız özelliklerden ayıran kesme kullanıcı tarafından tanımlanır, bu da onu biraz rasgele hale getirir. Önerilen protokol için, en iyi% 75 bilgi kazanç ile özellikleri kullanılmıştır, SUVmaxkarşılık , PE, ve AUC. Ancak bu seçim, hedefle ilişkisi olmayan rastgele bir değişkenin eklenmesi, bilgi kazancının hesaplanması ve daha sonra gerçek özelliklerin bilgi kazancıyla karşılaştırılması yla sistematik olarak güçlendirilebilir(Ek Şekil 2). Bu biraz daha sofistike bir yaklaşım ayrıca en alakalı olarak yukarıda belirtilen üç özelliklerin seçimi doğruladı. Bununla birlikte, özellik çıkarma ve sarıcı yöntemleri gibi belirli bir sınıflandırma algoritmasına göre özellikleri seçen diğer yaklaşımlarla birlikte birkaç farklı filtre yöntemi de vardır. Farklı özellik seçimi yaklaşımları farklı sonuçlar verebilir.
ML algoritmasının genelleştirilebilirliğini sağlamak ve aşırı montajı daha da önlemek için önerilen protokol, leave-one-out çapraz doğrulama (LOOCV) uygular. Ancak en iyi yaklaşım, bir alt kümeyi tüm veri kümesinden rasgele kaldırmak ve bunu bir sınama kümesi olarak ele almaktır. ML algoritması daha sonra test kümesinin sonucunu tahmin etmek için verilerin geri kalanı (yani, eğitim kümesi) üzerinde eğitilir. Ancak, bu yaklaşım yeterince büyük bir veri kümesi gerekir. Daha küçük örneklem boyutları için LOOCV uygulaması yaygındır, çünkü bir modelin gerçek genelleme yeteneğinin neredeyse tarafsız bir tahminini sağlar26. LOOCV'de ilk veri noktası veri kümesinden kaldırılır ve avNNet korunan verilerle eğitilir. Daha sonra, önceden tandirilen veri noktasının sonucu tahmin edilir ve kaydedilir. Bu işlem tüm veri noktaları için yinelenir, böylece sonunda her sonuç algoritmayı eğitmek için kullanılmayan verilerle tahmin edilir. Diğer doğrulama yaklaşımları x-fold çapraz doğrulamaları (en sık 10 kat) içerir ve kod içindeki ilgili trenKontrol parametresini yöntem="CV" olarak değiştirerek kolayca uygulanabilir.
Bir kantitatif bakış açısı, tıbbi görüntüler genellikle çok temel bir şekilde değerlendirilir, büyük ölçüde boyut ve potansiyel olarak şüpheli lezyonlar veya alanların şekli ölçümleri güvenerek27,28. Ancak, Tıpta Dijital Görüntüleme ve İletişim (DICOM) standardının avantajı, radyomik olarak adlandırılan birçok özelliğin çıkarılmasına olanak sağlamasıdır. "Radyomik" terimi başlangıçta büyük miktarda görüntü nün yüksek iş letme özelliği olarak tanımlanmıştır29, ancak daha sonra görüntülerin daha yüksek boyutlu verilere dönüştürülmesini içerecek şekilde genişletilmiştir30. Ancak, yüksek boyutlu veriler esas olarakneden 30yerine korelasyonları tanımlamak için kullanılır. Bu protokolde tanımlanan özellikler, boyut ve şekil gibi klasik radyolojik özellikler ile vaskülarizasyon ve metabolik aktivitenin genel kabul görmüş parametrelerini andırdıkları için radyomikler arasında yer almaktadır. Bu disemine tümör hücrelerinin mikroinansi yandal ilişki sunuyor. Kullanıcı tarafından istenirse, radyomik özelliklerin çıkarılması farklı yazılım paketleri ile yapılabilir31.
Sağlanan protokol sınırlı sayıda özellikle sınırlı değildir. Böylece, büyük radyomik veri setleri ile kullanılabilir. Ancak, özellik seçimi yukarıda belirtilen sorunu büyüyen veri setleri ile giderek daha önemli hale gelir. Sunulan protokol, onkoloji, enfeksiyon veya inflamasyon alanlarından farklı çalışma ortamlarına da aktarılabilir32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler. Fon layıcıların çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; verilerin toplanması, analiz için veya yorumlaşımında; el yazmasının yazımında veya sonuçları yayınlama kararında.
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG, İşbirlikçi Araştırma Merkezi CRC 1181, alt proje Z02; Öncelikli Program μBone, projeler BA 4027/10-1 ve BO 3811), tarama cihazları için ek destek dahil (INST 410/77-1 FUGG ve INST 410/93-1 FUGG), ve Friedrich Alexander-Üniversitesi Erlangen-Nürnberg Gelişen Alanlar Girişimi (EFI) "Big Thera" tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Operating Microscope | Leica | NA | |
| ClinScan MR System | Bruker | NA | |
| DICOM Viewer | Horos | NA | www.horosproject.org |
| Excel: Spreadsheet | Microsoft | NA | |
| FCS | Sigma | F2442-500ML | |
| Gadovist | Bayer-Schering | NA | |
| Inveon PET/CT | Siemens | NA | |
| Inveon Research Workplace Software | Siemens Healthcare GmbH | NA | |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | NA | |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | American Type Culture Collection | N/A | |
| Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit. | Orange3, University of Ljubljana | NA | https://orange.biolab.si/ |
| RPMI-1640 | Invitrogen/ThermoFisher | 11875093 | |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7 | |
| Vevo 3100 | VisualSonics | NA |
References
- D'Oronzo, S., Brown, J., Coleman, R. The role of biomarkers in the management of bone-homing malignancies. Journal of Bone Oncology. 9, 1-9 (2017).
- Ellmann, S., Beck, M., Kuwert, T., Uder, M., Bäuerle, T. Multimodal imaging of bone metastases: From preclinical to clinical applications. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (4), 166-177 (2015).
- Braun, S., Pantel, K. Clinical significance of occult metastatic cells in bone marrow of breast cancer patients. The Oncologist. 6 (2), 125-132 (2001).
- Braun, S., Rosenberg, R., Thorban, S., Harbeck, N. Implications of occult metastatic cells for systemic cancer treatment in patients with breast or gastrointestinal cancer. Seminars in surgical oncology. 20 (4), 334-346 (2001).
- Ellmann, S., et al. Prediction of early metastatic disease in experimental breast cancer bone metastasis by combining PET/CT and MRI parameters to a Model-Averaged Neural Network. Bone. 120, 254-261 (2018).
- Bäuerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound. Journal of Visualized Experiments. (66), e4178 (2012).
- Merz, M., Komljenovic, D., Semmler, W., Bäuerle, T. Quantitative contrast-enhanced ultrasound for imaging antiangiogenic treatment response in experimental osteolytic breast cancer bone metastases. Investigative Radiology. 47 (7), 422-429 (2012).
- Bäuerle, T., et al. Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein. International Journal of Cancer. 115 (2), 177-186 (2005).
- Patel, J., Goyal, R. Applications of Artificial Neural Networks in Medical Science. Current Clinical Pharmacology. 2 (3), 217-226 (2008).
- Naftaly, U., Intrator, N., Horn, D. Optimal ensemble averaging of neural networks. Network: Computation in Neural Systems. 8 (3), 283-296 (1997).
- Bäuerle, T., Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W. Drug-induced vessel remodeling in bone metastases as assessed by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging and vessel size imaging: A longitudinal in vivo study. Clinical Cancer Research. 16 (12), 3215-3225 (2010).
- Cheng, C., et al. Evaluation of treatment response of cilengitide in an experimental model of breast cancer bone metastasis using dynamic PET with 18F-FDG. Hellenic Journal of Nuclear Medicine. 14 (1), 15-20 (2011).
- Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (6), 1256-1261 (2018).
- Sonntag, E., et al. In vivo proof-of-concept for two experimental antiviral drugs, both directed to cellular targets, using a murine cytomegalovirus model. Antiviral Research. 161, 63-69 (2019).
- Horos - Free DICOM Medical Image Viewer | Open-Source. , Available from: https://www.horosproject.org/ (2015).
- DCE Tool Plugin. , Available from: http://kyungs.bol.ucla.edu/software/DCE_tool/DCE_tool.html (2020).
- RStudio Team RStudio: Inteegrated Development for R. , Available from: https://rstudio.com (2015).
- Demšar, J., et al. Orange: Data Mining Toolbox in Python. Journal of Machine Learning Research. 14, 2349-2353 (2013).
- Saeys, Y., Inza, I., Larrañaga, P. A review of feature selection techniques in bioinformatics. Bioinformatics. 23 (19), 2507-2517 (2007).
- Kuhn, M. CRAN - Package caret. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/caret/index.html (2016).
- Chen, T., et al. CRAN: Package xgboost - Extreme Gradient Boosting. , Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/xgboost/ (2019).
- Available Models | The caret Package. , Available from: http://topepo.github.io/caret/available-models.html (2020).
- Fernández-Delgado, M., Cernadas, E., Barro, S., Amorim, D., Fernández-Delgado, A. Do we Need Hundreds of Classifiers to Solve Real World Classification Problems. Journal of Machine Learning Research. 15, 3133-3181 (2014).
- Hira, Z. M., Gillies, D. F. A Review of Feature Selection and Feature Extraction Methods Applied on Microarray Data. Advances in Bioinformatics. 2015, 198363 (2015).
- Sánchez-Maroño, N., Alonso-Betanzos, A., Tombilla-Sanromán, M. Filter methods for feature selection - A comparative study. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). 4881, 178-187 (2007).
- Cawley, G. C., Talbot, N. L. C. C. Fast exact leave-one-out cross-validation of sparse least-squares support vector machines. Neural Network. 17 (10), 1467-1475 (2004).
- Forghani, R., et al. Radiomics and Artificial Intelligence for Biomarker and Prediction Model Development in Oncology. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 995-1008 (2019).
- Jaffe, C. C. Measures of response: RECIST, WHO, and new alternatives. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 24 (20), 3245-3251 (2006).
- Lambin, P., et al. Radiomics: Extracting more information from medical images using advanced feature analysis. European Journal of Cancer. 48 (4), 441-446 (2012).
- Gillies, R. J., Kinahan, P. E., Hricak, H. Radiomics: Images are more than pictures, they are data. Radiology. 278 (2), 563-577 (2016).
- Nioche, C., et al. Lifex: A freeware for radiomic feature calculation in multimodality imaging to accelerate advances in the characterization of tumor heterogeneity. Cancer Research. 78 (16), 4786-4789 (2018).
- Ellmann, S., et al. Application of machine learning algorithms for multiparametric MRI-based evaluation of murine colitis. PLOS ONE. 13 (10), 0206576 (2018).
