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Cancer Research

Algoritmi di apprendimento automatico per il rilevamento precoce delle metastasi ossee in un modello di ratto sperimentale

Published: August 16, 2020 doi: 10.3791/61235
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 1, 1
1Department of Radiology, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 2Department of Medical Physics in Radiation Oncology, German Cancer Research Center, 3Department of Internal Medicine 3, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

Questo protocollo è stato progettato per addestrare un algoritmo di apprendimento automatico per utilizzare una combinazione di parametri di imaging derivati dalla risonanza magnetica (RMI) e dalla tomografia a emissione di positroni (PET/CT) in un modello di ratto delle metastasi ossee del cancro al seno per rilevare la malattia metastatica precoce e prevedere la successiva progressione alle macrometastasi.

Abstract

Gli algoritmi di apprendimento automatico (ML) consentono l'integrazione di diverse funzionalità in un modello per eseguire attività di classificazione o regressione con una precisione superiore ai relativi componenti. Questo protocollo descrive lo sviluppo di un algoritmo ML per prevedere la crescita delle macrometastasi ossee del cancro al seno in un modello di ratto prima che eventuali anomalie siano osservabili con metodi di imaging standard. Tale algoritmo può facilitare la diagnosi della malattia metastatica precoce (cioè la micrometastasi) che viene regolarmente persa durante gli esami di messa in scena.

Il modello di metastasi applicato è specifico del sito, il che significa che i ratti sviluppano metastasi esclusivamente nella gamba posteriore destra. Il tasso di acquisizione del tumore del modello è del 60%-80%, con macrometastasi che diventano visibili nella risonanza magnetica (RMI) e nella tomografia a emissione di positroni/TC (PET/CT) in un sottoinsieme di animali 30 giorni dopo l'induzione, mentre un secondo sottoinsieme di animali non presenta crescita tumorale.

Partendo dagli esami delle immagini acquisiti in un momento precedente, questo protocollo descrive l'estrazione di caratteristiche che indicano la vascolarizzazione del tessuto rilevata dalla risonanza magnetica, il metabolismo del glucosio da PET/CT e la successiva determinazione delle caratteristiche più rilevanti per la previsione della malattia macrometastatica. Queste caratteristiche vengono poi indotta in una rete neurale media del modello (avNNet) per classificare gli animali in uno dei due gruppi: uno che svilupperà metastasi e l'altro che non svilupperà alcun tumore. Il protocollo descrive anche il calcolo dei parametri diagnostici standard, come l'accuratezza complessiva, la sensibilità, la specificità, i valori predittivi negativi/positivi, i rapporti di probabilità e lo sviluppo di una caratteristica operativa del ricevitore. Un vantaggio del protocollo proposto è la sua flessibilità, in quanto può essere facilmente adattato per addestrare una pletora di diversi algoritmi ML con combinazioni regolabili di un numero illimitato di funzionalità. Inoltre, può essere utilizzato per analizzare diversi problemi in oncologia, infezione, e l'infiammazione.

Introduction

Lo scopo di questo protocollo è integrare diversi parametri di imaging funzionale da RMI e PET/CT in un algoritmo ML di rete neurale media (avNNet) basato su modelli. Questo algoritmo prevede la crescita delle macrometastasi in un modello di ratto di metastasi ossee del cancro al seno in un momento precoce, quando i cambiamenti macroscopici all'interno dell'osso non sono ancora visibili.

Prima della crescita delle macrometastasi, si verifica un'invasione del midollo osseo delle cellule tumorali diffuse, comunemente indicata come malattia micrometastatica1,2. Questa invasione iniziale può essere considerata un primo passo nella malattia metastatica, ma in genere viene persa durante gli esami di stagingconvenzionali 3,4. Sebbene le modalità di imaging attualmente disponibili non siano in grado di rilevare la microinvasione del midollo osseo quando vengono utilizzate da sole, è stato dimostrato che una combinazione di parametri di imaging che producono informazioni sulla vascolarizzazione e sull'attivitàmetabolica ha dimostrato di ottenere prestazioni migliori 5. Questo vantaggio complementare si ottiene combinando diversi parametri di imaging in un avNNet, che è un algoritmo ML. Tale avNNet consente la previsione affidabile della formazione di macrometastasi ossee prima della presente di eventuali metastasi visibili. Pertanto, l'integrazione dei biomarcatori di imaging in un avNNet potrebbe servire come parametro surrogato per la microinvasione del midollo osseo e la malattia metastatica precoce.

Per sviluppare il protocollo, è stato utilizzato un modello precedentemente descritto di metastasi ossee per cancro al seno nei ratti nudi6,7,8. Il vantaggio di questo modello è la sua site-specificità, il che significa che gli animali sviluppano metastasi ossee esclusivamente nella gamba posteriore destra. Tuttavia, il tasso di tumore-prendere di questo approccio è 60%-80%, quindi un numero considerevole di animali non sviluppano metastasi durante lo studio. Utilizzando modalità di imaging come MRe e PET/CT, la presenza di metastasi è rilevabile dal giorno 30 postinjection (PI). In precedenza, l'imaging (ad esempio, 10 PI) non distingue tra gli animali che svilupperanno malattie metastatiche e quelli non lo faranno (Figura 1).

Un avNNet addestrato sui parametri di imaging funzionale acquisiti il giorno 10 PI, come descritto nel seguente protocollo, predice o esclude in modo affidabile la crescita delle macrometastasi entro le seguenti 3 settimane. Reti neurali combinano nodi artificiali all'interno di diversi livelli. Nel protocollo di studio, i parametri di imaging funzionale per l'afflusso di sangue del midollo osseo e l'attività metabolica rappresentano lo strato inferiore, mentre la previsione della malignità rappresenta lo strato superiore. Un livello intermedio aggiuntivo contiene nodi nascosti connessi sia al livello superiore che a quello inferiore. La forza delle connessioni tra i diversi nodi viene aggiornata durante il training della rete per eseguire la rispettiva attività di classificazione con alta precisione9. La precisione di tale rete neurale può essere ulteriormente aumentata calcolando la media delle uscite di diversi modelli, con conseguente avNNet10.

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Protocol

Tutte le procedure di cura e di sperimentazione sono state eseguite in conformità con la legislazione nazionale e regionale in materia di protezione degli animali, e tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal governo statale della Franconia, Germania (numero di riferimento 55.2 DMS-2532-2-228).

1. Induzione di metastasi ossee da cancro al seno nella gamba posteriore destra di ratti nudi

NOTA: Una descrizione dettagliata dell'induzione di metastasi ossee di cancro al seno nei ratti nudi è stata pubblicata altrove6,8. I passaggi più rilevanti sono presentati di seguito.

  1. Cultura MDA-MB-231 cellule di cancro al seno umano in RPMI-1640, integrato con 10% siero di vitello fetale (FCS). Mantenere le cellule in condizioni standard (37 gradi centigradi, 5% CO2) e passare le cellule 2-3 volte alla settimana.
  2. Lavare le cellule MDA-MB-231 quasi confluenti con 2 mM EDTA in salina tamponata fosfato (PBS), quindi staccare le cellule con 0,25% di metapsina. Determinare la concentrazione cellulare con una camera di Neubauer e risunderle in 200 L di RPMI-1640 ad una concentrazione di 1,5 x10 5 cellule/200 L.
  3. Usa ratti nudi di 6-8 settimane e tienili in condizioni controllate e senza agenti patogeni (21 gradi centigradi ± temperatura ambiente 2 gradi centigradi, 60% di umidità e ritmo chiaro-scuro di 12 h). Offrire mangimi autoclaved e acqua ad libitum.
  4. Prima di eseguire l'intervento chirurgico, iniettare un farmaco analgesico (ad esempio, Carprofen 4 mg/kg) sottocutaneamente. Anestetizzare i ratti con un isoflurane (1–1,5 vol. %) miscela di ossigeno ad una velocità di flusso di 2 L/min. Controllare la profondità anestetica pizzicando.
  5. Per la chirurgia, utilizzare un microscopio operativo con ingrandimento 16x.
  6. Eseguire un taglio di 2-3 cm nella regione inguinale destra del ratto. Dizionare tutte le arterie nella regione inguinale destra, compresa l'arteria femorale (FA), l'arteria epigastrica superficiale (SEA), l'arteria genicolare discendente (DGA), l'arteria popliteale (PA) e l'arteria safenosa (SA). Posizionare due clip rimovibili sulla FA: una prossima all'inizio del SEA e un'altra direttamente prossima all'inizio della DGA.
  7. Ligate la parte distale del SEA. Eseguire un taglio della parete della SEA e inserire un ago di 0,3 mm di diametro nel SEA. Collegare una siringa contenente la sospensione cellulare dal punto 1.2 all'ago. Rimuovere la clip distatale dalla FA e ritagliare la SA.
  8. Iniettare lentamente la sospensione delle cellule MDA-MB-231 dal punto 1.2 (1,5 x10 5 celle/200 L) nel SEA. Rimuovere l'ago, ligare il SEA, e rimuovere le clip dell'arteria. Chiudere la ferita utilizzando clip chirurgiche e terminare l'anestesia. Monitorare gli animali ogni giorno per valutare le dimensioni del tumore e qualsiasi prova di dolore.

2. Risonanza magnetica (GG)

NOTA: per una descrizione dettagliata delle procedure di risonanza magnetica, vedere b'uerle et al.11.

  1. Eseguire la risonanza magnetica 10 giorni PI utilizzando uno scanner sperimentale dedicato (vedi Tabella dei materiali) o un sistema MR umano con una bobina animale appropriata.
  2. Anestesizzare il ratto con un isoflurane (1–1,5 vol. %) /miscela di ossigeno come descritto sopra. Posizionare un catetere nella vena della coda del ratto e nastro adesivo alla coda. Collegare una siringa contenente l'agente di contrasto (0,1 mmol/kg Gd-DTPA in circa 0,5 mL).
  3. Posizionare il ratto anetizzato nel sistema MR. Individuare il femore distale e la tibia prossimale della gamba posteriore destra in una sequenza anatomica (ad esempio, sequenza di eco turbo ponderata T2; TR - 8.654 ms; TE - 37 ms; matrice 320 x 272; FOV - 65 mm x 55 mm; spessore della sezione : 1 mm; tempo di scansione 11:24 min).
  4. Determinare le fette che coprono il femore distale e la tibia prossimale della gamba posteriore destra e iniziare la sequenza DCE-MRI (ad esempio, sequenza di scatto ad angolo basso veloce; TR - 3,9 ms; TE - 0,88 ms; matrice : 256 x 216; FOV - 65 x 54 mm2; spessore della sezione : 1 mm; 8 fette; 100 punti di tempo; tempo di scansione : 8:25 min). Dopo 30 s, iniziare a iniettare l'agente di contrasto per un periodo di tempo di 10 s.
    NOTA: Il tempo totale per eseguire un esame di risonanza magnetica è di circa 20 min per animale.

3. Tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT)

NOTA: per una descrizione dettagliata delle procedure PET, vedere Cheng all'al.12.

  1. Eseguire l'imaging PET/CT 10 giorni PRIMA utilizzando uno scanner sperimentale dedicato (vedere Tabella dei materiali).
  2. Tenere gli animali digiunti prima dell'imaging. Anestetizzare il ratto come descritto al punto 2.2 e inserire un catetere nella vena della coda come descritto sopra.
  3. Iniettare 6 MBq di 18F-Fluorodeoxyglucosio (18F-FDG) nella vena della coda e attendere 30 min per consentire al tracciante di distribuirsi correttamente.
  4. Eseguire un'acquisizione di TC (tensione del tubo 80 kV, corrente del tubo , 500 1, risoluzione isotropica , 48,9 m, durata , 10 min).
  5. Eseguire un'acquisizione di PET statica (livello discriminatorio inferiore/superiore: 350/650 keV; finestra di temporizzazione : 3,438 ns; durata 15 min).

4. Strategie di imaging alternative

  1. Per una valutazione precoce delle cellule MDA-MB-231 nella gamba posteriore, inoculato 1,5 x10 5 cellule etichettate /200 L per la bioluminescenza (cioè, cellule che esprimono luciferina, MDA-MB-231-LUC13) o imaging a fluorescenza (cioè cellule che esprimono proteine fluorante verdi o rosse, MDA-MB-231-GFP/RFP13). Utilizzare il sistema per l'imaging ottico preclinico per rilevare le cellule MDA-MB-231 infrazioni per il tumore dopo l'inoculazionedelle cellule tumorali 14.
  2. Eseguire ultrasuoni sperimentali utilizzando uno scanner dedicato dopo l'iniezione endovenosa di microbolle per derivare parametri morfologici e funzionali della vascolarizzazione paragonabili alla risonanza magnetica7.

5. Analisi della risonanza magnetica

  1. Utilizzare un visualizzatore DICOM15 con un dcE Plugin16 e caricare la sequenza DCE in modalità 4D facendo clic sul pulsante "Importa" nel menu superiore, selezionando la cartella DICOM contenente le immagini MR del passaggio 2.4 e facendo clic su "Visualizzatore 4D" nel menu in alto.
  2. Posizionare una regione di interesse circolare bidimensionale (ROI), con una dimensione di destinazione di 1,5 mm2, nel midollo osseo dell'albero tibiale prossimale della gamba posteriore destra, preferibilmente utilizzando i numeri di immagine 4 o 5 della sequenza costituita da 8 immagini, poiché queste immagini al centro forniscono risultati più stabili.
  3. Avviare il plug-in DCE dal menu in alto, selezionare "Miglioramentorelativo " nel campo "Tipo distampa " e definire l'intervallo di base dai punti di riferimento 1 a 5 digitando questi numeri nei rispettivi campi. Esportare l'analisi come file .txt con il rispettivo pulsante e scegliere "DCEraw.txt" come nome del file.
  4. Aprire RStudio17 e caricare il file DCE-Script.R fornito tramite il menu "File" selezionando "Apri file". Eseguire l'intero script selezionando "Code", quindi "Run Region" e quindi "Run All" dal menu. Copiare l'output nel file modello fornito denominato "ImagingFeatures.xlsx" (Figura 2).
  5. Nel visualizzatore DICOM, posizionare un secondo ROI all'interno del muscolo posteriore dell'animale e ripetere i passaggi 5.2–5.4 per ottenere le misurazioni del MDD muscolare ai fini della normalizzazione. All'interno del foglio di calcolo "ImagingFeatures.xlsx", le rispettive misurazioni ossee vengono automaticamente divise per le rispettive misurazioni muscolari ai fini della normalizzazione.
  6. Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.5 per tutti gli animali e completare il foglio di calcolo.

6. Analisi PET/CT

  1. Aprire il software di analisi PET/CT e importare i dati ottenuti nel passaggio 3 facendo clic su "File", seguito da "Importazione manuale". Contrassegnare i file ct.img.hd e pet.img.hdr. Fare clic su"Apri " e selezionare "Importa tutto".
  2. Aprire i set di dati selezionando "Analisi generale", seguita da "OK".
  3. Selezionare "ROI Quantificazione", seguita da "Crea", e quindi "Crea un ROI da un modello". Inserire un ROI bidimensionale di circa 4 mm x 6 mm nel midollo osseo dell'albero tibiale prossimale della gamba posteriore destra.
  4. Selezionare "ROIs (Target 1 overlay)" e annotare i valori media, minimo e massimo in Bq/mL.
  5. Calcolare il valore massimo standardizzato di assorbimento (SUVmax): Dividere il valore massimo (Bq/mL) per l'attività iniettata e moltiplicare il risultato per il peso dell'animale in grammi. Immettere il risultato nel foglio di calcolo (Figura 2).

7. Determinazione del tasso di recupero del tumore

  1. Per diagnosticare la crescita del tumore nella gamba posteriore destra, ripetere l'imaging MR e PET/CT il giorno 30 PI, come descritto sopra.
    NOTA: I tumori saranno chiaramente visibili il giorno 30 PI e presentano lesioni T2w-iperintense e un chiaro miglioramento del contrasto nella risonanza magnetica, insieme a un SUV max chiaramenteelevato in PET/CT. Secondo gli esperimenti precedenti, il 60%-80% degli animali svilupperà metastasi nella gamba posteriore destra.
  2. Completare il foglio di calcolo aggiungendo una colonna "Tumor" aggiuntiva e immettere "1" per ogni animale che presenta metastasi e "0" per ogni animale senza onere tumorale visibile (Figura 2). Salvare il foglio di calcolo come "ImagingFeatures.xlsx" all'interno della cartella Download.

8. Selezione delle caratteristiche

  1. Per determinare le funzionalità più rilevanti per la previsione della crescita futura del tumore, importare il foglio di calcolo in un toolkit di visualizzazione dei dati open source, apprendimento automatico e data mining18.
  2. Disegnare la subroutine File dal menu Dati nell'area di lavoro a destra e fare doppio clic su di essa. Caricare il foglio di calcolo facendo clicsull'icona"Cartella" e selezionando il file "ImagingFeatures.xlsx". Selezionare il fogliodi lavoro" Esporta " e assegnare l'attributo target alla variabile "Tumor". Assegnare la funzione "Skip" al numero di animali (Figura 3).
  3. Disegnare la subroutine "Rank" dal menu Dati nell'area di lavoro e collegare le subroutine "File" e "Rank" disegnando una linea tra di esse.
  4. Aprire la subroutine "Rank" facendo doppio clic sulla relativa icona e selezionare l'algoritmo "Information Gain"19.
  5. Dai cinque parametri acquisiti, utilizzare i primi tre per ulteriori analisi (SUVmax, PE e AUC).
    Nota: Questi parametri riflettono l'attività metabolica (SUVmax)e la vascolarizzazione dei tessuti (PE e AUC).

9. Analisi ML

  1. Aprire RStudio 3.4.117 e caricare TrainModel.R-Script fornito tramite il menu" File".
  2. Installare le librerie necessarie (questa operazione deve essere eseguita una sola volta) digitando: install.packages(c("caret", "readxl", "pROC", "RcmdrPlugin.E'R", "ggplot2"))
  3. Per caricare le librerie necessarie e impostare la cartella Download come directory di lavoro, selezionare le righe da 3 a 5 all'interno dello script TrainModel.R.
  4. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

10. Training di un algoritmo AVNNet ML

  1. Per eseguire il training di un algoritmo avNNet, selezionare le righe da 8 a 39 da TrainModel.R-Script (vedere il passaggio 9.1).
  2. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

11. Analisi dei risultati dell'algoritmo ML

  1. Per valutare i parametri standard di accuratezza diagnostica (sensibilità, specificità, valori predittivi positivi e negativi e rapporti di probabilità), selezionare le righe 41-50 da TrainModel.R-Script.
  2. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

12. Confronto della curva ROC (Receiver Operating Characteristic) del modello finale con le curve ROC dei suoi parametri costitutivi

  1. Per eseguire i test di DeLong per confrontare la curva ROC del modello con le curve ROC dei relativi parametri costitutivi, selezionare le linee 52-62 da TrainModel.R-Script (vedere il passaggio 9.1).
  2. Eseguire il codice selezionato facendo clic su "Codice" all'interno del menu, quindi su "Esegui righe selezionate".

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Representative Results

I ratti si sono ripresi rapidamente dall'intervento chirurgico e dall'iniezione delle cellule del cancro al seno MDA-MB-231 e sono stati quindi sottoposti a imaging MR e PET/CT nei giorni 10 e 30 PI (Figura 1). Un'analisi DCE rappresentativa della tibia prossimale destra di un ratto è presentata nella Figura 2A. Le misurazioni non prime DCE sono state salvate selezionando il pulsante"Esporta"e scegliendo "DCEraw.txt" come nome del file.

I calcoli successivi dei parametri dinamici, AUC, PE e washout sono stati eseguiti in RStudio con il rispettivo script. L'output delle misurazioni DCE doveva essere salvato come "DCEraw.txt" all'interno della cartella "Downloads", in modo che lo script potesse essere eseguito direttamente senza configurazioni aggiuntive per fornire una tabella di dati, come illustrato nella Figura 2B. Questi dati sono stati copiati nel foglio di calcolo fornito (Figura 2C). Analogamente, i parametri DCE per il tessuto muscolare sono stati determinati e trasferiti al foglio di calcolo (Figura 2D,E). Questi valori sono stati normalizzati dividendo le misure ossee per le misurazioni muscolari; questa operazione è stata eseguita automaticamente all'interno del foglio di calcolo. Dal PET/CT, i valori maxSUV calcolati sono stati successivamente trasferiti nella tabella (Figura 2F).

Il giorno 30 PI, tutti gli animali sono stati valutati per determinare se hanno sviluppato o meno metastasi, e la tabella è stata completata codificando il carico tumorale positivo come "1" e gli animali sani come "0" all'interno della colonna più a destra del foglio di calcolo (Figura 2C).

Il foglio di calcolo è stato importato nel toolkit di visualizzazione dei dati open source, nell'apprendimento automatico e nel data mining e la classificazione delle funzionalità ha rivelato il SUVmax, PE e AUC come le prime tre funzionalità per la previsione della malattia metastatica (Figura 3). Questi parametri riflettono l'attività metabolica (SUVmax) e la vascolarizzazione dei tessuti (PE e AUC).

L'esecuzione dello script TrainModel.R importa automaticamente il foglio di calcolo e calcola avNNet. È stata determinata la combinazione ottimale diiperpara parametri ( Figura 4A) e il modello finale è stato quindi calcolato utilizzando la combinazione di iperpara parametri ottimale ( Figura4B). Successivamente, è stato calcolato un insieme di parametri diagnostici standard (Figura 4C) ed è stata tracciata una curva ROC del modello (Figura 4D).

Il risultato positivo è mostrato nella Figura 4B–D. Un confronto tra la curva ROC del modello e la curva ROC dei suoi tre componenti (ad esempio, AUC, PE e SUVmax) ha rivelato che il modello ha ottenuto risultati significativamente migliori rispetto a tutti i suoi tre costituenti (p - 0,01 per AUC, p - 0,003 per PE e p - 0,007 per SUVmax). La combinazione dei tre parametri selezionati con un avNNet era più sensibile, consentendo così la previsione di malattie macroscopiche con una precisione complessiva di 85,7% (95% intervallo di confidenza - 67.3%–96.0%). Questi risultati sono stati ottenuti da un'analisi di 28 campioni. Gli intervalli di confidenza possono essere ulteriormente ridotto aumentando il numero di animali.

I risultati negativi potrebbero essere ottenuti come descritto qui. Le misure di accuratezza erano altamente sensibili a tipi specifici di algoritmi di apprendimento automatico e ai passaggi di pre-elaborazione dei dati. Le reti neurali, in particolare, tendevano a migliorare le prestazioni quando i dati di input erano normalizzati. Ciò è stato ottenuto dalla funzione "BoxCox" nella sezione 10 del protocollo (linee 22 e 36 all'interno del TrainModel.R-Script fornito). Astenersi dalla normalizzazione e l'utilizzo di un algoritmo diverso (ad esempio, una rete neurale non mediata), modificando il metodo in "nnet" (linee 21 e 35 all'interno del TrainModel.R-Script fornito), ha provocato un'area di 0,594 sotto la curva ROC (Figura supplementare 1). Tale modello non è riuscito a sovraperformare i suoi tre costituenti in modo significativo (tutti p > 0.15).

Poiché lo script è stato ottimizzato per RStudio 3.4.1 e il pacchetto di punti di accesso versione 6.0-84, l'utilizzo di versioni software diverse potrebbe produrre risultati diversi. L'esecuzione degli script forniti con le versioni software utilizzate in questo manoscritto darà risultati simili. Tuttavia, se i lettori mirano a modificare lo script, aggiungere altre variabili, modificare cartelle di documenti o nomi di file o modificare gli algoritmi di apprendimento automatico in modo più dettagliato, saranno necessarie le rispettive regolazioni del codice. Per questi casi, il manuale del caret-package offre spiegazioni approfondite20.

Figure 1
Figura 1: Immagini rappresentative MR e PET/CT. MR e PET/CT immagini della gamba posteriore destra di un animale che non ha sviluppato metastasi nel corso dello studio (due colonne più a sinistra, con immagini del giorno 10 e giorno 30 PI), e un animale che ha sviluppato metastasi tra il giorno 10 e il giorno 30 PI (due colonne più a destra, metastasi contrassegnate con frecce). Si noti l'elevata intensità del segnale delle metastasi nelle immagini T2w (riga superiore), il miglioramento del contrasto rappresentato dall'area aumentata sotto la curva (AUC; seconda riga) e l'aumento del valore massimo di assorbimento standardizzato nel PET/CT (SUVmax; terza fila). Si noti che non ci sono differenze visibili nelle immagini acquisite il giorno 10 PI (prima e terza colonna) tra l'animale con metastasi il giorno 30 PI e l'animale che non ha sviluppato metastasi ossee. Questa cifra è stata modificata da Ellmann et al.5. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: valutazione delle funzionalità di imaging e della compilazione in un foglio di calcolo. (A) Il miglioramento dinamico del contrasto del midollo osseo della tibia prossimale è stato analizzato con un visualizzatore DICOM freeware15 utilizzando un plugin DCE16. Le rispettive misurazioni sono state salvate e (B) ulteriormente analizzate con il file DCE-Script.R fornito in RStudio17. (C) L'output è stato copiato in un foglio di calcolo (vedere materiale supplementare per un modello). (D) Allo stesso modo, la misurazione DCE è stata eseguita per il tessuto muscolare adiacente, analizzato utilizzando RStudio (E) e quindi copiato nel foglio di calcolo. I dati sono stati normalizzati dividendo i risultati delle misurazioni ossee per i risultati delle misurazioni muscolari (C; cellule ombreggiate dal salmone). (F) Le misurazioni PET/CT sono state eseguite con il software del fornitore. Il valore massimo di assorbimento standardizzato è stato calcolato dividendo la rispettiva misurazione per l'attività iniettata e moltiplicandola per il peso corporeo dell'animale. Il risultato è stato successivamente copiato nel foglio di calcolo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Classificazione delle funzionalità. La classificazione delle funzionalità di imaging acquisite è stata eseguita all'interno di un toolkit di visualizzazione dei dati open source, apprendimento automatico e data mining18 importando il foglio di calcolo tramite la subroutine "File" e analizzandolo tramite la subroutine "Rank". Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Output RStudio rappresentativo. L'algoritmo di apprendimento automatico è stato sviluppato utilizzando RStudio17 con il file TrainModel.R-Script fornito. (A) Una ricerca a griglia tra diverse combinazioni di iperpara parametri per la rete neurale media del modello ha rivelato una dimensione di tre neuroni e un decadimento di 0,0005 come un ottimale. (B) Utilizzando questa combinazione di iperpara parametri, una rete completa è stata addestrata e convalidata incrociata, raggiungendo una precisione complessiva dell'85,7%. (C) I parametri standard di precisione diagnostica, tra cui sensibilità, specificità, valori predittivi positivi e negativi e rapporti di probabilità, sono stati calcolati da una matrice di confusione. (D) Un grafico ROC rappresentativo del modello convalidato incrociato ha rivelato un'area sotto la curva (AUC) di 0,917. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Risultato negativo. La modifica dell'algoritmo ML in una rete neurale senza una media e astenersi dalla normalizzazione dei parametri di input ha portato a un calo dell'area sotto la curva della curva ROC da 0,917 (Figura 4D) a 0,594. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Classificazione delle funzionalità alternative. A differenza del metodo standard illustrato nella Figura 3,è stata introdotta anche una variabile casuale ("Random"; evidenziata in blu), con la sua importanza inclusa nella classifica. Questo approccio ha confermato la selezione applicata delle variabili SUVmax, PE e AUC. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Gli algoritmi ML sono potenti strumenti utilizzati per integrare diverse funzionalità predittive in un modello combinato e ottenere una precisione che supera quella dei suoi costituenti separati quando vengono utilizzati da soli. Ciò nonostante, il risultato effettivo dipende da diversi passaggi critici. In primo luogo, l'algoritmo ML utilizzato è un fattore cruciale, perché diversi algoritmi ML producono risultati diversi. L'algoritmo utilizzato in questo protocollo è un avNNet, ma altri algoritmi promettenti includono Extreme Gradient Boosting21 o Random Forests. Il pacchetto di puntidi accesso 20 per RStudio fornisce una pletora di algoritmi diversi (attualmente >175), e il protocollo proposto è altamente flessibile in termini di passaggio da un algoritmo a un altro semplicemente cambiando singole righe di codice (ad esempio, cambiando il metodo "avNNet" al metodo "rf") e adattando le impostazioni di TunedGrid al rispettivo algoritmo ML. Per informazioni dettagliate, vedere il repository githubgithub 22. Un'eccellente panoramica dei diversi algoritmi e delle loro prestazioni rispetto ai diversi problemi di classificazione è stata pubblicata da Fernandez-Delgado et al.23 e potrebbe servire da punto di partenza per altri esperimenti.

Un altro fattore cruciale è la scelta delle funzionalità rilevanti da includere in un algoritmo ML. Questo protocollo propone l'uso del metodo di filtro, "Guadagno di informazioni"19, per classificare le funzionalità disponibili in ordine decrescente e utilizzare quelle più rilevanti per addestrare avNNet. I metodi di filtro si basano solo su presupposti generali, ad esempio la correlazione con la variabile da stimare, pertanto i ricercatori devono preselezionare le funzionalità indipendentemente dal classificatoreutilizzato 24,25. Tali metodi sono particolarmente efficaci nel tempo di calcolo e robusti per l'overfitting. Tuttavia, il taglio che separa le caratteristiche rilevanti da irrilevanti è definito dall'utente, rendendolo in qualche modo arbitrario. Per il protocollo proposto, sono state utilizzate le caratteristiche con il 75% di guadagno di informazioni superiore, corrispondenti a SUVmax, PE e AUC. Questa selezione, tuttavia, può essere rafforzata sistematicamente includendo una variabile casuale che non ha alcuna relazione con l'obiettivo, calcolandone il guadagno di informazioni e quindi confrontandola con il guadagno di informazioni delle caratteristiche reali ( Figura 2 ). Questo approccio leggermente più sofisticato ha inoltre confermato la scelta delle tre caratteristiche di cui sopra come la più rilevante. Tuttavia, esistono diversi metodi di filtro, insieme ad altri approcci che selezionano le funzionalità rispetto a un particolare algoritmo di classificazione, ad esempio l'estrazione di funzionalità e i metodi wrapper. Approcci di selezione delle funzionalità diversi possono produrre risultati diversi.

Per garantire la generalizzabilità dell'algoritmo ML e impedire ulteriormente l'overfitting, il protocollo proposto applica la convalida incrociata leave-one-out (LOOCV). L'approccio migliore, tuttavia, sarebbe quello di rimuovere in modo casuale un sottoinsieme dall'intero set di dati e trattarlo come un set di test. L'algoritmo ML viene quindi sottoposto a training sul resto dei dati (ad esempio, il set di training) per prevedere successivamente l'esito del set di test. Tuttavia, questo approccio richiede un set di dati sufficientemente grande. Per i campioni di dimensioni più piccole, l'applicazione di LOOCV è comune perché fornisce una stima quasi imparziale della reale capacità di generalizzazione di un modello26. In LOOCV, il primo punto dati viene rimosso dal set di dati e avNNet viene sottoposto a training con i dati conservati. Quindi, il risultato del punto dati precedentemente trattenuto viene previsto e salvato. Questo processo viene ripetuto per tutti i punti dati, in modo che infine ogni risultato viene previsto con dati che non sono stati utilizzati per il training dell'algoritmo. Altri approcci di convalida includono le convalide incrociate x-fold (più comunemente 10 volte) e possono essere facilmente applicati modificando il rispettivo parametro trainControl all'interno del codice in method "CV".

Da un punto di vista quantitativo, le immagini mediche sono in genere valutate in modo molto semplice, in gran parte basandosi su misurazioni delle dimensioni e della forma di lesioni potenzialmente sospette oaree 27,28. Tuttavia, il vantaggio dello standard DiCOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) è che consente l'estrazione di molte funzionalità, denominate radiomica. Il termine "radiomica" è stato inizialmente definito come l'estrazione ad alta velocità di grandi quantità di caratteristichedell'immagine 29, ma è stato successivamente esteso per includere la conversione delle immagini in dati dimensionalisuperiori 30. Tuttavia, i dati dimensionali superiori vengono utilizzati principalmente per identificare le correlazioni anzichéle cause 30. Le caratteristiche descritte in questo protocollo rientrano tra le caratteristiche radiologiche classiche, come le dimensioni e la forma, e la radiomica, in quanto assomigliano a parametri generalmente accettati di vascolarizzazione e attività metabolica. Questo offre una potenziale relazione causale con la microinvasione delle cellule tumorali diffuse. Se lo si desidera dall'utente, un'estrazione di funzionalità radiomiche può essere eseguita con diversi pacchetti software31.

Il protocollo fornito non è limitato a un numero finito di funzionalità. Così, può essere utilizzato con grandi set di dati radiomici. Tuttavia, il problema di cui sopra di selezione delle funzionalità diventa sempre più importante con la crescita dei set di dati. Il protocollo presentato può anche essere trasferito a diverse impostazioni di studio, ad esempio, dai campi di oncologia, infezione o infiammazione32.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, nelle analisi o nell'interpretazione dei dati; nella scrittura del manoscritto, o nella decisione di pubblicare i risultati.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, Centro di ricerca collaborativa CRC 1181, sottoprogetto n. 02; Programma prioritario, progetti BA 4027/10-1 e BO 3811), incluso il supporto aggiuntivo per i dispositivi di scansione (INST 410/77-1 FUGG e INST 410/93-1 FUGG), e dall'Iniziativa Emerging Fields (EFI) "Big Thera" della Friedrich-Alexander-University Erlangen-N'rnberg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Binocular Operating Microscope Leica NA
ClinScan MR System Bruker NA
DICOM Viewer Horos NA www.horosproject.org
Excel: Spreadsheet Microsoft NA
FCS Sigma F2442-500ML
Gadovist Bayer-Schering NA
Inveon PET/CT Siemens NA
Inveon Research Workplace Software Siemens Healthcare GmbH NA
IVIS Spectrum PerkinElmer NA
MDA-MB-231 human breast cancer cells American Type Culture Collection N/A
Open-source data visualization, machine learning and data mining toolkit. Orange3, University of Ljubljana NA https://orange.biolab.si/
RPMI-1640 Invitrogen/ThermoFisher 11875093
Trypsin Sigma 9002-07-7
Vevo 3100 VisualSonics NA

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References

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