Summary
O objetivo desta técnica é a visualização ex vivo de redes arteriais pulmonares de camundongos pós-natais e adultos precoces através da inflação pulmonar e injeção de um composto radio-opaco à base de polímero através da artéria pulmonar. Também são discutidas possíveis aplicações para tecidos fundidos.
Abstract
Vasos sanguíneos formam redes intrincadas no espaço tridimensional. Consequentemente, é difícil apreciar visualmente como as redes vasculares interagem e se comportam observando a superfície de um tecido. Este método fornece um meio de visualizar a complexa arquitetura vascular tridimensional do pulmão.
Para isso, um cateter é inserido na artéria pulmonar e a vasculatura é simultaneamente lavada de sangue e quimicamente dilatada para limitar a resistência. Os pulmões são então inflados através da traqueia a uma pressão padrão e o composto de polímero é infundido no leito vascular a uma taxa de fluxo padrão. Uma vez que toda a rede arterial é preenchida e permitida a cura, a vasculatura pulmonar pode ser visualizada diretamente ou visualizada em um scanner micro-CT (μCT).
Quando realizado com sucesso, pode-se apreciar a rede arterial pulmonar em camundongos que variam de idades pós-natal precoces a adultos. Além disso, enquanto demonstrado no leito arterial pulmonar, este método pode ser aplicado em qualquer leito vascular com colocação otimizada de cateter e pontos finais.
Introduction
O foco desta técnica é a visualização da arquitetura arterial pulmonar usando um composto à base de polímero em camundongos. Embora tenha sido realizado um trabalho extensivo em leitos vasculares sistêmicos como cérebro, coração e rim1,2,,3,4,5, há menos informações sobre a preparação e o preenchimento da rede arterial pulmonar. O objetivo deste estudo, portanto, é expandir o trabalho anterior6,,7,8 e fornecer uma referência escrita e visual detalhada que os pesquisadores podem facilmente seguir para produzir imagens de alta resolução da árvore arterial pulmonar.
Enquanto existem inúmeros métodos para rotulagem e vasculatura pulmonar de imagem, como ressonância magnética, ecocardiografia ou angiografia ct9,10, muitas dessas modalidades não conseguem preencher adequadamente e/ou capturar os pequenos vasos, limitando o escopo do que pode ser estudado. Métodos como secção serial e reconstrução fornecem alta resolução, mas são tempo/trabalho intensivo11,,12,13. A integridade do tecido mole circundante está comprometida na fundição tradicional de corrosão10,13,14,15,16. Mesmo a idade e o tamanho dos animais tornam-se fatores ao tentar introduzir um cateter ou, falta resolução. A técnica de injeção de polímero, por outro lado, preenche as artérias ao nível capilar e, quando combinada com μCT, permite uma resolução incomparável5. Amostras de pulmões de camundongos tão jovens quanto o pós-natal 14 foram lançadas com sucesso8 e processadas em questão de horas. Estes podem ser rescandados indefinidamente, ou mesmo enviados para preparação histológica/microscopia eletrônica (EM) sem comprometer o tecido mole existente17. As principais limitações para este método são o custo inicial do equipamento/software ct, desafios com o monitoramento preciso da pressão intravascular e a incapacidade de adquirir dados longitudinalmente no mesmo animal.
Este artigo baseia-se no trabalho existente para otimizar ainda mais a técnica de injeção da artéria pulmonar e empurrar os limites relacionados à idade/tamanho até o pós-natal 1 (P1) para produzir resultados impressionantes. É mais útil para equipes que desejam estudar redes vasculares arteriais. Assim, fornecemos novas orientações para a colocação/estabilização do cateter, maior controle sobre taxa/volume de preenchimento e destacamos armadilhas notáveis para o aumento do sucesso de fundição. Elencos resultantes podem então ser usados para caracterização futura e análise morfológica. Talvez mais importante, esta é a primeira demonstração visual, pelo nosso conhecimento, que orienta o usuário através deste procedimento intrincado.
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Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do Instituto Nacional de Pulmão e Sangue do Coração.
1. Preparação
- Injete o mouse intraperitonealmente com heparina (1 unidade/g de peso corporal do rato) e deixe-o ambulatório por 2 minutos.
- Eutanize o animal em uma câmara de CO2.
- Disponha o mouse em uma posição supina em uma placa cirúrgica e fixe todos os quatro membros na placa com fita. Use a ampliação para dissecção fina.
2. Expondo pulmões e traqueia
- Pulverize o lado ventral do mouse com 70% de etanol para minimizar a interferência capilar.
- Segure a pele abdominal com fórceps e faça uma pequena incisão com uma tesoura na região umbilical. Deslize as pontas da tesoura para a camada fascial entre a musculatura abdominal e a pele e comece a separar as duas camadas. Trabalhe rostrally, removendo a pele do abdômen, costela e pescoço.
- Abra a musculatura abdominal com uma tesoura e corte lateralmente em ambos os lados até que o diafragma seja exposto.
- Segure suavemente o processo xifoide e levante ligeiramente a caixa torácica maximizando a visão dos pulmões caudais através do diafragma fino e semitransparente. Faça cuidadosamente uma pequena incisão no diafragma logo abaixo do processo xifoide. Os pulmões entrarão em colapso e se retirarão do diafragma. Disseque o diafragma longe da caixa torácica, tomando cuidado para não cortar o parenchyma pulmonar.
- Localize e corte a veia cava inferior (IVC) e o esôfago por onde passam pelo diafragma. Use gaze para limpar qualquer sangue de poça na cavidade torácica, evitando contato com os pulmões.
- Segure o xifoide mais uma vez e levante suavemente. Corte a caixa torácica bilateralmente (aproximadamente na linha midaxillary) evitando o contato com os pulmões. Remova a caixa torácica anterior completamente, fazendo o corte final ao longo do ângulo severo pouco antes do manúbrio.
- Usando uma seringa pré-enchida, molhe liberalmente os pulmões com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, pH 7.4) para evitar a secagem. Continue essa rotina durante todo o procedimento.
- Usando fórceps, segure o manúbrio e levemente se eleve do corpo. Usando uma tesoura, corte 1-2 mm lateralmente para o manúbrio, cortando clavículas e retire. Isso vai expor o timo por baixo.
- Segure cada lóbulo do timo, se separe e remova. Repita este procedimento com a glândula submandibular. Por fim, remova o tecido muscular que sobrepõe a traqueia.
NOTA: Após a dissecção, o coração, a aorta ascendente (AA), tronco arterial pulmonar (PAT) e traqueia devem ser visíveis. Certifique-se de que os ramos arteriais primários do tronco não estão divididos ou feridos.
3. Cateterismo de PA e perfusão sanguínea
- Para montar a Unidade 1, rosca de 15 cm de tubo PE-10 sobre o cubo de uma agulha de 30 G e anexar a uma seringa de 1 mL pré-enchido com 10-4 M de nitroprusside de sódio (SNP) em PBS. Prime a tubulação avançando o êmbolo até que todo o ar seja purgado desta unidade (Figura 1).
ATENÇÃO: O SNP é tóxico se engolido. Evite contato com a pele e os olhos. Lave bem a pele após o manuseio. Use equipamentos de proteção individual apropriados.- Alternativamente, monte a Unidade 2. Para ratos pós-natal dia 7 (P7) e mais jovem, use um hemostat para separar uma agulha adicional de 30 G de seu hub e enfiar a agulha na extremidade aberta da tubulação da Unidade 1 (Figura 1).
- Em vez de uma agulha, use fórceps afiados curvos para agarrar uma extremidade de um comprimento de 10 cm de seda 7-0. Penetrar o ápice do coração entrando de um lado e passando as pontas dos fórceps através do músculo e para fora do outro lado. Segure a seda com outro conjunto de fórceps e puxe aproximadamente 2 cm de comprimento e amarre. Pegue a extremidade restante de 8 cm da sutura, puxando o coração caudally, e tape a extremidade para a placa cirúrgica.
NOTA: Isso criará tensão, expondo ainda mais os grandes vasos e amarrando o coração no lugar, permitindo uma colocação mais fácil do cateter na artéria pulmonar. - Enganque as pontas dos fórceps curvos sob o AA e o PAT. Puxe um comprimento de 3 cm de seda de 7-0 de volta através da abertura e crie uma sutura solta de um único arremesso.
- O uso de tesouras faz uma incisão de 1-2 mm em direção ao ápice do coração, penetrando no ventrículo direito de parede fina (RV), para permitir a inserção do cateter (Unidade 1). Antes da inserção, confirme que não há ar no sistema. Introduza a tubulação preparada no ventrículo direito e avance suavemente para o PAT semitransparente de paredes finas.
- Verifique visualmente se o cateter não avançou nos ramos pulmonar esquerdo ou direito e não se encaixa no ponto de ramificação da artéria pulmonar. Usando fita, fixe a porção distal da tubulação na placa cirúrgica.
NOTA: Para identificar o RV, use fórceps para beliscar o lado direito do coração. Ao contrário do ventrículo esquerdo, a parede livre relativamente fina do trailer deve ser facilmente apreendida. - Para camundongos mais jovens que P7, conecte a Unidade 2 a um micromanipulador e introduza a extremidade da agulha da unidade no PAT como descrito acima usando o manipulador.
- Verifique visualmente se o cateter não avançou nos ramos pulmonar esquerdo ou direito e não se encaixa no ponto de ramificação da artéria pulmonar. Usando fita, fixe a porção distal da tubulação na placa cirúrgica.
- Aperte suavemente a sutura solta em torno de ambos os vasos grandes e corte o comprimento de 8 cm de sutura criado na etapa 3.2 para devolver o coração a uma posição de repouso natural. O cateter está agora firmemente fixado dentro do PAT.
- Corte a aurícula esquerda do coração para permitir que o perfusato saia do sistema.
- Fixar seringa contendo SNP (Unidade 1 ou Unidade 2, tamanho dependente) na bomba de seringa e perfundir a solução a uma taxa de 0,05 mL/min para lavar o sangue e dilatar a vasculatura. O sangue/perfusado sairá através da auricle cortada. Continue a perfusão até que o perfusato seja claro (~200 μL em um rato adulto, menos para animais mais jovens).
NOTA: Ao perfundir a baixa viscosidade PBS/SNP, uma taxa de infusão relativamente maior foi usada no interesse de economizar tempo. O composto polímero mais viscoso é infundido a uma taxa mais lenta para evitar o excesso de escoamento, ruptura e maximizar o controle sobre os pontos finais distais.
4. Traqueostomia e inflação pulmonar
- Construir a unidade de inflação pulmonar(Figura 2).
- Conecte um cateter intravenoso de plástico flexível de 24 G (IV) (agulha removida)/infusão de borboleta situada em uma torneira, presa a uma seringa aberta de 50 mL (sem êmbolo). Pendure a seringa de uma banca de anéis.
- Adicione 10% de formalina tamponada à seringa. Abra a torneira, permitindo que a formalina entre na tubulação e purigue todo o ar do sistema. Feche a torneira e levante a seringa até que o menisco esteja 20 cm acima da traqueia8.
ATENÇÃO: A formalina é inflamável, cancerígena, agudamente tóxica quando ingerida, e causa irritação na pele, danos graves nos olhos, sensibilização da pele e mutagenicidade das células germinativas. Evite a ingestão e o contato com a pele e os olhos. Evite a inalação do vapor ou da névoa. Mantenha-se longe de fontes de ignição. Use equipamentos de proteção individual apropriados.
- Coloque duas suturas soltas inferiores à cartilagem cricoide de 2-4 mm de distância.
- Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão no ligamento cricothiroide superior às suturas.
- Insira o cateter IV na abertura e avance a ponta além das duas suturas soltas.
- Aperte as suturas ao redor da traqueia e abra a torneira. Permita que a formalina entre nos pulmões pela gravidade e espere 5 minutos para que os pulmões inflem completamente. Se os pulmões aderirem à caixa torácica durante a inflação, segure o lado de fora da caixa torácica com fórceps de ponta sem cortes e mova-se em todas as direções para ajudar na libertação dos lóbulos. Não faça contato direto com os pulmões.
- Depois de 5 min, volte o cateter IV além da primeira sutura e ligadura. Repita para a segunda sutura. Os pulmões estão agora inflados em um estado fechado e pressurizado.
5. Lançando a vasculatura
- Em um tubo de 1,5 mL, prepare 1 mL de uma solução 8:1:18 de polímero:diluente:agente de cura e inverta suavemente várias vezes para garantir uma boa mistura.
- Retire o êmbolo de uma seringa de 1 cc, cubra a extremidade oposta com um dedo enluvado e despeje o composto de polímero na seringa. Reinserir cuidadosamente o êmbolo, inverter e avançar o êmbolo para remover todo o ar e formar um menisco na ponta da seringa.
- Remova a seringa SNP/PBS do cubo da agulha e gotejar PBS adicionais no cubo para criar um menisco. Verifique cuidadosamente o hub quanto ao ar preso, desaloja se necessário, e reforme o menisco. Junte-se ao hub para a seringa cheia com o composto polímero.
NOTA: Criar um menisco em ambas as extremidades reduz significativamente a chance de o ar entrar no sistema. - Conecte a seringa preenchida do composto polímero à bomba de seringa e infundir a 0,02 mL/min.
NOTA: Para pulmões menores, uma taxa mais lenta pode ser útil para evitar o excesso de estoque, mas não é essencial. - Monitore o composto à medida que ele se move livremente para baixo da tubulação pe e observe o volume da seringa à medida que entra no PAT. Continue enchendo até que todos os lóbulos sejam preenchidos completamente até o nível capilar e pare a bomba de seringa. Verifique novamente o volume da seringa.
NOTA: Após várias corridas, um volume estimado pode ser usado para medir um ponto final aproximado (~35 μL para um mouse adulto e ~5 μL para um filhote P1). Depois que a bomba for interrompida, a pressão residual no sistema continuará empurrando o composto polímero para as artérias pulmonares. Todos os lóbulos pulmonares devem encher a uma taxa semelhante. - Cubra os pulmões com um lenço de limpeza de fibra óptica, aplique liberalmente PBS e permita que a carcaça fique intacta por 30-40 min em temperatura ambiente. Durante este período, o composto polímero irá curar e endurecer.
- Retire o cateter, corte os braços/metade inferior do mouse e coloque a cabeça/tórax em uma cônica de 50 mL preenchida com formalina tamponada de 10% durante a noite.
- Após a fixação, segure a traqueia e separe suavemente a unidade coração/pulmão da caixa torácica e tórax restantes. Coloque o bloco coração/pulmão em um frasco de cintilação preenchido com formalina. Descarte o resto.
6. Leitos vasculares alternativos para fundição (Tabela 1)
NOTA: Cada cama vascular alvo pode exigir diferentes colocações de cateter, taxas de infusão e tempos de enchimento ideais. Assim, vários animais serão necessários para lançar múltiplos órgãos.
- Para leitos vasculares sistêmicos superiores ou inferiores ao diafragma siga as etapas 1.1-2.5 conforme acima. Veja notas adicionais no sistema portal e diafragma (Tabela 1).
- Segure o processo xifoide com um hemosta e corte a caixa torácica bilateralmente (aproximadamente na linha midaxillary) pouco antes das artérias torácicas internas.
- Dobre a caixa torácica ainda conectada sobre tal forma que ela está descansando sobre o pescoço/cabeça do animal, expondo totalmente a cavidade torácica.
- Siga o passo 3.1 acima e, em seguida, remova os pulmões. Uma vez que a aorta torácica (TA) é visível, engancha as pontas de fórceps curvas por baixo dele, ~10 mm superior ao diafragma. Segure um comprimento de 3 cm de seda 7-0, puxe para trás através da abertura sob o TA, e crie uma sutura solta de um único arremesso. Repita este procedimento ~8 mm acima do diafragma.
- Para estruturas superiores ao diafragma, use uma tesoura de mola para criar um pequeno orifício (~30% da circunferência total) na porção ventral do TA, ~2 mm inferior às suturas soltas colocadas na etapa 6.4.
- Para estruturas inferiores ao diafragma, em vez disso, crie um pequeno orifício ~2 mm superior às suturas soltas.
- Dependendo do tamanho do animal, introduza a Unidade 1 ou 2 no vaso, avance além das suturas soltas e liga o vaso suavemente.
- Siga o passo 3.7, definindo a bomba de seringa a uma taxa de 1,0 mL/min e perfundando um mínimo de 5 mL. Perfusate sairá através do IVC.
- Siga os passos 5.1 - 5.4 ajustando a taxa de infusão para 0,05 mL/min, monitorando visualmente o tecido alvo em tempo real.
NOTA: O volume de infusão será específico da idade dos órgãos e animais. O volume pode ser ainda limitado ligando ramos arteriais que levam a leitos vasculares não-alvo (ou seja, cérebro, fígado, rim, intestino). - Siga 5.6, em seguida, remova o tecido alvo e coloque em formalina.
7. Montagem, varredura e reconstrução de microcsição
- Usando filme de parafina, crie uma superfície plana na cama de varredura e centrale a amostra molhada nesta superfície(Figura 3A).
NOTA: Se o artefato de movimento for detectado, a amostra pode exigir estabilização adicional. - Amostra levemente tenda/capa com filme adicional de parafina para evitar a desidratação. Tome cuidado especial para não descansar o filme de parafina na amostra causando deformação ao tecido(Figura 3B).
- Escaneie a amostra usando configurações descritas na Tabela 2 e padronize esses parâmetros dentro de um determinado experimento.
NOTA: Este é dependente de experimento/ponto final. Padronize os parâmetros escolhidos para a facilidade de comparação entre as amostras. - Transfira os scans reconstruídos para pós-processamento e análise.
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Representative Results
Um elenco bem sucedido exibirá o preenchimento uniforme de toda a rede arterial pulmonar. Demonstramos isso em camundongos C57Bl/6J variando em idade: Dia pós-natal P90 (Figura 4A),P30(Figura 4B),P7(Figura 4C)e P1(Figura 4D). Controlando a taxa de fluxo e monitorando visualmente o preenchimento em tempo real, foram alcançados pontos finais confiáveis da vasculatura mais distal(Figura 5A).
Desafios comuns incluem danos aos pulmões, enchimento incompleto, enchimento ou sobresso, enchimento do cateter e tamanho animal.
Se houver danos no pulmão/vias aéreas, pequenos vazamentos impedirão que os pulmões desarmem pressão(Figura 5B,C). Na ausência de inflação completa, torna-se difícil fazer comparações quantitativas e espaciais precisas entre as amostras. Para minimizar o risco para o parenchyma pulmonar, evite cortar muito de perto os pulmões ao remover a caixa torácica e mantenha os pulmões úmidos com PBS durante todo o procedimento para evitar desidratação e adesão às estruturas circundantes. Se um lobo adere à caixa torácica durante a inflação, segure suavemente o lado de fora da caixa torácica (longe do pulmão) com fórceps e mova-o em direção para libertar os lóbulos. Alternativamente, um instrumento contundente, como uma espátula, com uma borda lisa pode ser usado para levantar ou empurrar o pulmão inflado para longe da caixa torácica. Ao inflar os pulmões, adere aos parâmetros de pressão sugeridos e evite o excesso de inflação, pois isso pode levar à ruptura das vias aéreas. Finalmente, não remova os pulmões da cavidade torácica até que a pós-fixação esteja completa. A traqueia, os pulmões e o coração devem ser removidos em bloco das porções restantes da cavidade torácica.
O enchimento patchy(Figura 5D) ou incompleto(Figura 5E) pode surgir de uma "câmara de ar", na qual o ar é introduzido no sistema vascular através do cateter, bloqueando o fluxo a jusante do composto. Para minimizar a chance de uma câmara de ar, purgar o ar vigilantemente da ponta do cateter antes da inserção (Etapa 3.4) e durante a transição da seringa de SNP/PBS para composto de polímero. Se o preenchimento permanecer irregular ou incompleto, pode ser uma indicação de aumento da resistência vascular como resultado de estenose focal/segmento longo ou tortuosidade. Coágulos sanguíneos também podem levar ao enchimento incompleto e são facilmente evitados usando heparina antes do procedimento.
O volume de injeção inadequado levará a enchimento ou sobresso. O enchimento ocorre quando um composto muito pequeno é introduzido na vasculatura(Figura 5F). Alternativamente, o excesso de enchimento ou a introdução de muito composto polímero muito rapidamente pode causar ruptura arterial(Figura 5G) ou, mais comumente, trânsito venoso(Figura 5H). Ambos os problemas podem ser aliviados usando uma bomba de seringa. Os investigadores devem aderir cuidadosamente às restrições de taxa e volume propostas ou estabelecer suas próprias taxas com base em seu modelo específico e otimização. O monitoramento da perfusão do composto polímero em tempo real sob ampliação é crítico, e o preenchimento de pequenas artérias/capilares deve ser usado como ponto final.
Avançar o cateter muito longe do tronco pulmonar pode fazer com que a ponta se enraizar em um ramo da artéria pulmonar e criar um desequilíbrio no fluxo. Como resultado, um lado preenche mais rápido que o outro(Figura 5I), que frequentemente leva ao excesso de escoamento em um pulmão e subabasteca no outro. Embora a capinagem de cateter seja a razão mais provável neste cenário, "airlock" e falta de heparina também podem ser fatores contribuintes.
Finalmente, animais menores apresentam seu próprio conjunto de obstáculos adicionais. Animais mais jovens exigem mãos firmes e pequenos erros são menos indulgentes. Instrumentos de alta qualidade, especificamente projetados para microcirurgia, tornam-se mais importantes nos primeiros momentos pós-natal. O uso de um micromanipulador auxilia muito não só na colocação, mas na prevenção da luxação do cateter. Também é essencial utilizar a bomba de seringa em pequenos animais para controlar e gerenciar com precisão os pontos finais.
Embora especificamente mostrado para a vasculatura pulmonar, este procedimento também pode ser facilmente aplicado a leitos vasculares de alvo sistêmico(Tabela 1). Além dos desafios listados acima, escolher o ponto de entrada certo é crucial. O fundamento através da aorta torácica produz excelentes resultados para a maioria dos leitos vasculares. Deve-se notar, no entanto, que inserir o cateter o mais proximal possível ao local alvo e ligar vasculatura não-alvo auxilia no controle de fluxo e volume. Estes refinamentos combinados com o monitoramento direto adequado dos pontos finais vasculares distais(Figura 6A-F) e as taxas de infusão padrão otimizam o enchimento. Muitos exemplos desses métodos de fundição existem na literatura e são numerosos demais para referências completas. No entanto, podem ser encontrados detalhes adicionais em textos específicos do órgão, tais como estes4,,5,,7,18,19,20,21.
Após a fundição, as amostras podem ser processadas para digitalização μCT(Figura 7A,B). Para pós-processamento, um pacote de software comercial (ver Tabela de Materiais) produziu uma renderização de volume 3D da árvore vascular pulmonar apresentada como imagens estádas(Figura 7C), ou filmes. Outras análises estatísticas explorando características vasculares como comprimento e número do segmento, tortuosidade, ordem (geração ou classificação), volume e comprimento do arcade também podem ser realizadas. Além da digitalização μCT, as amostras fundidas também podem ser liberadas para obter imagens brutas ou processadas e cortadas para análise histológica8.
Figura 1: Cateter e instalação de agulhas. As seringas são mostradas com tubos e agulhas anexadas (Unit1 e Unit2). Inset: close-up de agulha e tubo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:Configuração da inflação pulmonar. Suporte do anel, grampo, uma seringa cheia de formalina, e tubos com um cateter ligado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Pré-digitalização da preparação da amostra micro-CT. (A) Aqui o espécime estava centrado em uma base de filme de parafina, (B) Aqui a amostra foi centrada e coberta na base do parafilme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Pulmões com fundamento vascular em diferentes estágios de desenvolvimento de 3 meses a 1 dia de idade. Vista dorsal dos pulmões,(A) P90, (B) P30, (C) P7 e(D) P1 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplos de preenchimento ideal e erros comuns durante a infusão de compostos de polímeros. (A) Quando o ponto final de enchimento foi alcançado, observou-se uma rede vascular robusta e fina. (B) Os pulmões totalmente inflados perfusados da formalina são representados por uma linha branca tracejada, (C) Os pulmões subinflados/deflacionados são mostrados. Isso foi observado devido a uma via aérea pulmonar comprometida. A posição original inflada é representada por uma linha branca tracejada e a posição deflacionada é representada por uma linha pontilhada preta,(D) Enchimento patchy: a vasculatura de porções do lóbulo permanece não preenchida enquanto outras áreas foram inteiramente preenchidas, (E) Enchimento incompleto: o composto polímero não conseguiu penetrar seções inteiras do pulmão, (F) Subsfilamento: o composto do polímero não preencheu vasculatura distal,(G) Ruptura: a seta está apontando para o composto polímero extrudado da vasculatura, (H) Preenchimento venoso: observe a seta apontando para os segmentos arteriais inteiramente preenchidos e estendendo-se para o sistema venoso. Veias e venules eram de calibre significativamente maior,(I) Cunha de cateter: Aqui o cateter foi desviado para uma artéria impedindo que a vasculatura dos lóbulos direito enchesse completamente enquanto o lobo esquerdo estava sobreabastecido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Fundição vascular e pontos finais em órgãos adicionais. (A) Rim: a aparência pontual do composto polímero no glomerulus forneceu o ponto final. (B) Fígado: observe os pequenos vasos visíveis nas bordas do órgão. (C) Estômago: pequenos vasos eram visíveis e totalmente preenchidos. (D) Intestino grosso: Vasos pequenos são facilmente identificáveis e preenchidos. (E) Diafragma: o músculo aqui é fino e translúcido com pequenos vasos preenchidos aparentes. (F). Cérebro: pequenos vasos eram visíveis no córtex. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Imagens de tomografia computadorizada e renderização de volume 3D de pulmões cheios de compostos de polímero. (A) Uma única fatia pulmonar reconstruída em escala cinza, (B) Esta foi uma projeção de intensidade máxima de uma tomografia computadorizada produzida a partir de pulmões cheios de polímero, (C) Uma renderização de volume 3D da arcada vascular foi gerada utilizando software comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Cama Vascular Arterial alvo | Colocação de cateter | Direção de infusão | Taxa de infusão | Notas |
| Cérebro | Aorta torácica apontando cranialmente | Retrógrado nas carótidas | .05ml/min | Aorta torácica cannulate, rato virado para a posição propensa, couro cabeludo aberto, e monitorar visualmente o progresso do polímero através do crânio. |
| Diafragma | Ventrical esquerdo | Anterograde em torácica interna, frráfica e intercostal | .05ml/min | Abra uma janela na lateral da caixa torácica, deixando a maior parte da caixa torácica e o diafragma intactos. Cannulate esquerda ventrical, clipe átrio direito, e monitore o progresso do lado caudal do diafragma. |
| Musculatura do membro superior | Aorta torácica apontando cranialmente | Retrógrado no braquiocefálico e deixado subclávio | .02ml/min | Para otimizar o fluxo de membros, amarre as artérias carótidas e remova a pele do membro para permitir o monitoramento visual do trânsito de polímeros na musculatura do membro. |
| Rim | Aorta torácica apontando caudally | Anterograde em artérias renais | .05ml/min | A vasculatura interna é preenchida cegamente. Para evitar o trânsito venoso, pare de injetar quando o polímero estiver visível em um padrão uniforme de puntificador através do rim. |
| Sistema portal | Veia portal | Anterograde no sistema portal | .02ml/min | Dobre suavemente o fígado para expor a veia do portal. |
| Hepática | Aorta torácica apontando caudally | Anterograde na artéria hepática | .05ml/min | Amarre a veia do portal antes da infusão para evitar o trânsito venoso do intestino fluindo para o fígado. |
| Estômago/ Intestino | Aorta torácica apontando caudally | Anterograde no celíaco, mesentérico superior e/ou mesenterico inferior | .05ml/min | Algumas regiões do intestino são fornecidas por múltiplas artérias e podem ser preenchidas em momentos diferentes. Para evitar o trânsito venoso, amarre artérias não necessárias para áreas de interesse e monitore visualmente o progresso do polímero. |
| Almofadas de gordura intra-abdominais | Aorta torácica apontando caudally | Anterograde, mas o vaso depende da almofada de gordura sendo estudada | .05ml/min | As almofadas de gordura são fornecidas por múltiplas artérias e podem ser preenchidas em momentos diferentes. Para evitar o trânsito venoso, amarre artérias não necessárias para uma área precisa de interesse e monitore visualmente o progresso do polímero. |
| Musculatura do membro inferior | Aorta infrarenal apontando caudally | Anterograde nas artérias femorais | .02ml/min | Remova a pele do membro para permitir o monitoramento visual do trânsito de polímeros na musculatura do membro. |
Mesa 1. Fundição de leitos vasculares alternativos.
| Configurações ct | |
| kVp | 90 |
| Material alvo | Tungstênio |
| Poder | 8w |
| Filtragem | 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Número de projeção | 6424 |
| Tamanho do detector | CMOS de painel plano - 2944 x 2352 pixels |
| Campo de Visão (FOV) | 36 mm |
| Tamanho Voxel | 72 μm |
| Resolução Espacial | tamanho voxel x 1,5 |
| Tempo de aquisição | 14 min. |
| Reconstrução | FBP e algoritmo comercial |
| Binning | 1x1 |
Mesa 2. Parâmetros de varredura μCT.
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Discussion
Executado corretamente, este método produz imagens marcantes de redes arteriais pulmonares, permitindo comparação e experimentação em modelos de roedores. Vários passos críticos ao longo do caminho garantem o sucesso. Primeiro, os investigadores devem heparinizar o animal na fase preparatória para evitar que coágulos sanguíneos se formem na vasculatura pulmonar e câmaras do coração. Isso permite o trânsito arterial completo do composto polímero. Em segundo lugar, ao perfurar o diafragma e remover a caixa torácica, tome cuidado para proteger os pulmões de danos, cortes ou lesões inadvertidas. Qualquer vazamento nas vias aéreas evitará a inflação completa e tornará as comparações entre as amostras imprecisas. Terceiro, amarrar o coração no ápice auxilia a colocação do cateter. Em quarto lugar, o uso de um vasodilatador forte como o SNP auxiliará tanto na remoção do sangue quanto no enchimento completo de arterioles e capilares5,8. Quinto, ao colocar o cateter no PAT, tome cuidado para não enterrar a ponta na bifurcação. Isso causará um desequilíbrio no fluxo, desviando o composto de polímero para o lado esquerdo ou direito, produzindo um gradiente de pressão desigual. Em sexto lugar, o uso de uma bomba de seringa permitirá ao usuário controlar a taxa e titer o volume tanto para a cepa quanto para a idade do mouse. Por fim, deixe o coração/pulmões ligados ao restante da cavidade torácica, conserte durante a noite e remova no dia seguinte. Os pulmões estarão bem fixos e o potencial de deflação devido a cortes acidentais durante a separação será minimizado.
Embora essa metodologia atinja os resultados desejados, técnicas alternativas podem ser úteis para alguns usuários. Para auxiliar na colocação do cateter, pode-se empregar um micromanipulador. Escolhemos uma versão com um pequeno perfil e base magnética para minimizar a invasão em uma área de trabalho já limitada, ao mesmo tempo em que fornecemos uma base estável (se usar uma base magnética certifique-se de colocar uma placa de aço sob o espaço de trabalho para permitir que o ímã se engaje). Isso permite ao usuário colocar com precisão a ponta do cateter no PAT em um ângulo que segue a trajetória natural da artéria. Além disso, o cateter é seguro e com menor risco de ser desalojado. Outra opção é o uso de um cateter trompetado ponta8. Embora não seja trivial de criar, um cateter alardeado é muito mais seguro e menos inclinado a deslizar acidentalmente para fora do PAT. A alteração da proporção de polímero:diluente altera a viscosidade e a facilidade com que os pequenos vasos são preenchidos. Dependendo da vasculatura alvo e dos pontos finais experimentais, isso pode ser uma consideração valiosa. A eutanásia via CO2 pode causar hemorragia pulmonar em uma pequena porcentagem de animais e é dependente de cepa22. Considere um protocolo alternativo de eutanásia caso este impacto seja um ponto final experimental. Ao inflar os pulmões, o uso de formalina auxilia a fixação do órgão no lugar da pressão dada. Um tampão fisiologicamente neutro pode ser substituído se os vasos periféricos precisarem ser preenchidos em um estado não fixado. Se a taxa de infusão e o controle são de menor importância para um determinado experimento, a perfusão manual também é possível. A injeção manual requer prática e monitoramento em tempo real sob ampliação para evitar o excesso de escoamento ou ruptura do vaso8. Finalmente, o suporte/condições teciduais, os parâmetros de varredura e o mínimo pós-processamento que empregamos para este artigo devem servir apenas como ponto de partida. Diferentes scanners, tecidos, pontos finais experimentais/necessidades do usuário podem exigir parâmetros alternativos.
Embora as imagens vasculares geradas a partir dessa técnica sejam impressionantes, há limitações. Principalmente, o método acima é subótimo para medir o calibre vascular devido à incapacidade de monitorar e controlar a pressão intravascular durante a infusão. Outros grupos conseguiram resolver um pouco essas preocupações de pressão na vasculatura sistêmica monitorando a pressão de condução4,23, no entanto, tais preocupações são ampliadas ainda mais no lado pulmonar devido às paredes da artéria pulmonar relativamente finas que são facilmente distensíveis com pequenas alterações nas pressões24 e a incapacidade de medir com precisão e controlar estaticamente a pressão intravascular pulmonar.
Uma segunda limitação para este método é que ele permanece um experimento pós-morte, ponto de tempo único, limitando sua utilidade em estudos que requerem condições realmente fisiológicas ou um curso de tempo. Outras medidas animais vivas, como a angiografia pulmonar (CTPA) ou μCT aumentada em contraste (CE-CT) oferecem a possibilidade de medidas funcionais e morfológicas. Scans/estudos longitudinais repetidos, bem como medidas em diferentes pontos do ciclo cardíaco/pulmonar, podem ser explorados10,25,26,27,28. Esses métodos podem ser utilizados de forma confiável, além da ecocardiografia, para medir o calibre arterial. No entanto, tanto as medidas de CTPA quanto de ecocardiografia estão atualmente limitadas à avaliação da vasculatura proximal. Para o ecocardiograma, a avaliação é limitada ao tronco pulmonar, enquanto a CTPA permite o cálculo adequado do calibre da artéria pulmonar do ramo potencialmente 1-2 encomendas ainda mais, mas a resolução é limitada, obscurecendo porções distais da vasculatura7. A dosagem por radiação também é uma preocupação que deve ser cuidadosamente monitorada ao usar tomografia computadorizada especialmente em estudos longitudinais multi-escaneiados29,,30. Para qualquer uma dessas aplicações, equipamentos μCT, tempo de varredura e software de análise podem ser caros e requerem treinamento especializado da equipe. Instalações de núcleo de imagem animal em algumas instituições podem aliviar esse fardo.
Como alternativa a este composto, alguns grupos utilizam técnicas tradicionais de fundição de corrosão acompanhadas de remoção de tecido mole31,32. Esses métodos produzem resultados semelhantes a este composto de polímero, mas o produto final é frágil, levando a um artefato potencial15. Além disso, a remoção do tecido mole elimina o potencial para futura histologia33. Outra opção é deixar o tecido mole intacto e realizar um passo de seguimento em que o tecido mole é "limpo" tornando a amostra praticamente transparente34,35. A limpeza tecidual dá ao usuário alguma capacidade de ver mais profundamente dentro de uma amostra, mas, no geral, permanece inferior ao μCT, pois não pode fornecer a mesma visualização 3D. Seção histológica serial e tomografia de matriz são métodos que oferecem resolução excepcionalmente alta. Embora essa técnica abra as portas para novas possibilidades excitantes, a carga de trabalho é exponencialmente maior e não particularmente propícia para grandes coortes11,12. Histologia de raios-X 3D é uma abordagem não destrutiva que casa tanto a histologia μCT quanto a histologia tradicional ou mesmo em36,,37,,38. É preciso uma visão mais elevada da patologia utilizando μCT para identificar globalmente e explorar com precisão regiões de interesse que são seguidas com histologia de rotina39. Substituir agentes de contraste de menor resolução (ou, em alguns casos, sem contraste) com composto polímero na vasculatura pode servir para elevar ambas as técnicas quando possível. Outra abordagem não destrutiva que é computacionalmente intensiva ainda, potencialmente melhora o contraste, é a imagem μCT de recuperação de fase40,41. Este método pode ser valioso quando empregado em dados barulhentos onde o contraste é fraco ou não possível42. O composto polímero empregado nesta técnica, no entanto, não sofre dessa limitação. Dito isto, a recuperação de fases pode ser útil onde o composto polímero é possivelmente diluído, por exemplo, na vasculatura distal43. Finalmente, a estereologia tem sido um padrão na análise estrutural quantitativa pulmonar há44 anos. Ele usa amostragem aleatória e sistemática em seções transversais de tecido para fazer inferências 3D assumindo que as amostras escolhidas são suficientemente representativas. Embora seja uma ferramenta poderosa, ela tem o potencial de levar a erros e preconceitos. A combinação de imagens de tomografia computadorizada com estereologia, no entanto, mantém grande promessa45.
O método delineado é relativamente simples e com o treinamento uma taxa de sucesso de >90% é alcançável. Uma vez dominado, permite a fundição completa e confiável da vasculatura pulmonar. Em fixação, tecido e polímero permanecem estáveis indefinidamente para exames futuros, histologia potencial ou EM46,47. Mostramos que essa técnica pode ser usada em animais tão jovens como P1 até a idade adulta e acreditamos que o fundição embrionária, através da artéria pulmonar, está ao alcance. Deve-se notar que essa técnica pode ser aplicada a praticamente qualquer outro leito vascular, simplesmente alterando o ponto de entrada do cateter e determinando pontos finais apropriados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramuros da NHLBI (DIR HL-006247). Gostaríamos de agradecer ao NIH Mouse Imaging Facility por orientação em aquisição e análise de imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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