Summary
이 기술의 목적은 폐 인플레이션과 폐 동맥을 통해 무선 불투명 한 폴리머 기반 화합물의 주입을 통해 초기 산후 및 성인 마우스의 폐 동맥 네트워크의 전 생체 시각화입니다. 캐스팅된 조직에 대한 잠재적 응용 프로그램도 논의됩니다.
Abstract
혈관은 3 차원 공간에서 복잡한 네트워크를 형성합니다. 따라서 조직의 표면을 관찰하여 혈관 네트워크가 상호 작용하고 어떻게 작용하는지 시각적으로 이해하기가 어렵습니다. 이 방법은 폐의 복잡한 3차원 혈관 구조를 시각화하는 수단을 제공한다.
이를 달성하기 위해 카테터는 폐 동맥에 삽입되고 혈관은 동시에 혈액을 플러시하고 저항을 제한하기 위해 화학적으로 팽창됩니다. 폐는 표준 압력에서 기관을 통해 팽창하고 중합체 화합물은 표준 유량에 혈관 침대에 주입된다. 전체 동맥 망이 채워지고 치료할 수 있게 되면 폐 혈관은 마이크로 CT(μCT) 스캐너에서 직접 시각화되거나 이미지화될 수 있습니다.
성공적으로 수행 하면, 하나는 초기 산후 나이에서 성인에 이르기까지 쥐에 폐 동맥 네트워크를 감사할 수 있습니다. 또한 폐 동맥 침대에서 시연되었지만 이 방법은 최적화된 카테터 배치 및 끝점을 갖춘 혈관 침대에 적용할 수 있습니다.
Introduction
이 기술의 초점은 마우스에 있는 폴리머 기지를 둔 화합물을 사용하여 폐 동맥 건축의 시각화입니다. 뇌,,심장 및 신장1,2,2,,3,4,5와같은 전신 혈관 침대에서 광범위한 작업이 수행되었지만 폐 동맥 망의 준비 및 충진에 관한 정보가 적습니다. 따라서 이 연구의 목적은 전작6,,7,,8을 확장하고 조사관이 쉽게 따를 수 있는 상세한 서면 및 시각적 참조를 제공하여 폐 동맥 나무의 고해상도 이미지를 생성하는 것입니다.
자기 공명 영상, 에코카디그래피 또는 CT 혈관 조영술9,,10과같은 폐 혈관을 라벨링 및 이미징하기 위한 수많은 방법이 존재하지만, 이러한 양식의 대부분은 연구될 수 있는 것의 범위를 제한하여 작은 혈관을 적절히 채우거나 캡처하지 못합니다. 직렬 단면 및 재구성과 같은 방법은 고해상도를 제공하지만 시간 /노동 집약적11,,12,,13입니다. 주변 연조직 무결성은 전통적인 부식 주조10,,13,,14,,15,,16에서손상된다. 동물 의 나이와 크기조차도 카테터를 도입하려고 할 때 요인이되거나 해상도가 부족합니다. 반면에 폴리머 주입 기술은 동맥을 모세관 수준으로 채우고 μCT와 결합하면 비교할 수 없는 분해능5를허용합니다. 산후 14일의 어린 마우스 폐에서 샘플을 성공적으로캐스팅하고 몇 시간 만에 처리되었습니다. 이들은 기존연조직(17)을손상시키지 않고 조직학적 제제/전자 현미경검사(EM)를 위해 무기한 재스캔하거나 심지어 보내질 수 있다. 이 방법의 주요 제한 사항은 CT 장비/소프트웨어의 선행 비용, 혈관 내 압력을 정확하게 모니터링하는 데 어려움을 겪고 있으며 동일한 동물에서 세로로 데이터를 수집할 수 없다는 것입니다.
이 논문은 폐 동맥 주입 기술을 더욱 최적화하고 출생 후 날 1 (P1)까지 연령 / 크기 관련 경계를 밀어 눈에 띄는 결과를 산출하기 위해 기존의 작업을 기반으로합니다. 동맥 혈관 네트워크를 연구하려는 팀에게 가장 유용합니다. 따라서 카테터 배치/안정화에 대한 새로운 지침을 제공하고, 채우기 속도/볼륨에 대한 제어가 증가하고, 주조 성공증가를 위한 주목할 만한 함정을 강조합니다. 그런 다음 결과 캐스트를 향후 특성화 및 형태 분석에 사용할 수 있습니다. 아마도 더 중요한 것은, 이것은 이 복잡한 절차를 통해 사용자를 안내하는 우리의 지식에 대한 첫 번째 시각적 데모입니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 국립 심장 폐 및 혈액 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 준비
- 헤파린 (1 단위 /g 마우스 체중)과 마우스 를 인내하여 2 분 동안 앰필 할 수 있도록하십시오.
- CO2 챔버에서 동물을 안락사시합니다.
- 수술 판의 척추 자세로 마우스를 준비하고 테이프로 네 개의 팔다리를 모두 보드에 고정시하십시오. 미세 해부에 배율을 사용합니다.
2. 폐와 기관 노출
- 모발 간섭을 최소화하기 위해 마우스의 복부 면을 70% 에탄올로 스프레이합니다.
- 집게로 복부 피부를 잡고 배꼽 부위의 가위로 작은 절개를 합니다. 가위의 끝을 복부 근육과 피부 사이의 근막 층으로 밀어 넣고 두 층을 분리합니다. 복부, 흉곽 및 목에서 피부를 제거하여 장밋빛으로 작동합니다.
- 가위로 복부 근육을 열고 다이어프램이 노출될 때까지 양쪽에서 측면으로 자른다.
- xiphoid 과정을 부드럽게 파악하고 흉곽을 약간 들어 올려 얇고 반투명 한 다이어프램을 통해 caudal 폐의 시야를 극대화합니다. 신중하게 xiphoid 과정 바로 아래에 격막에 작은 절개를합니다. 폐는 붕괴하고 격막에서 물러나게 됩니다. 흉곽에서 멀리 격막을 해부, 폐 빈맥을 닉하지 않도록주의.
- 열등한 베나 카바(IVC)와 식도를 찾아 서두르고 다이어프램을 통과합니다. 거즈를 사용하여 흉부 구멍에 있는 모든 풀링 혈액을 청소하고 폐와의 접촉을 피하십시오.
- 다시 한 번 xiphoid를 잡고 부드럽게 들어 올립니다. 흉곽을 양측으로 잘라 (대략 midaxillary 라인에서) 폐와의 접촉을 피하십시오. 전방 흉곽을 완전히 제거하여 주누브리움 바로 앞에 흉골 각도를 따라 최종 절단을 합니다.
- 미리 채워진 주사기를 사용하여, 자유롭게 건조를 방지하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 폐를 적시. 절차 전반에 걸쳐 이 루틴을 계속합니다.
- 집게를 사용하여, 주브리움을 잡고 부드럽게 몸에서 상승. 가위를 사용하여 1-2mm 측면을 매니브리움으로 자르고, 쇄골을 절단하고, 제거합니다. 이렇게 하면 그 아래에 있는 흉선이 드러납니다.
- 흉골의 각 엽을 잡고, 분리하고 제거합니다. 이 절차를 submandib선으로 반복합니다. 마지막으로, 기관을 오버레이 근육 조직을 제거합니다.
참고 : 해부 에 따라, 심장, 오름차순 대동맥 (AA), 폐 동맥 트렁크 (PAT), 및 기관표시되어야한다. 트렁크에서 벗어난 기본 동맥 가지가 분할되거나 부상되지 않았는지 확인합니다.
3. PA 카테터레이션 및 혈액 관류
- 유닛 1을 조립하기 위해, 30G 바늘의 허브에 PE-10 튜브15cm를 실어 PBS에서10-4M 나트륨 니트로스트러스사이드(SNP)로 미리 채워진 1mL 주사기에 부착한다. 모든 공기가이 단위 (그림 1)에서제거 될 때까지 플런저를 진행하여 튜브를 프라임합니다.
주의: SNP는 삼키면 독성이 있습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 취급 후 피부를 철저히 씻어 줍니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.- 또는 단위 2를 어셈블합니다. 생후 7일(P7) 이하의 마우스의 경우, 후직을 사용하여 허브로부터 30G 바늘을 추가로 분리하고 바늘을 유닛1(도 1)의튜브의 열린 끝에 나사로 연결한다.
- 바늘 대신, 7-0 실크의 10cm 길이의 한쪽 끝을 파악하기 위해 곡선 날카로운 집게를 사용합니다. 한쪽에서 들어오는 심장의 정점을 관통하고 근육을 통해 다른 쪽에서 집게의 끝을 전달합니다. 또 다른 집게 세트로 실크를 잡고 약 2cm 길이를 당겨 묶습니다. 봉합사의 나머지 8cm 끝을 가지고, 심장을 caudally 잡아 당기고, 수술 보드에 끝을 테이프.
참고 : 이것은 긴장을 만들어 큰 혈관을 더 노출시키고 심장을 제자리에 묶을 수 있으므로 폐 동맥에 카테터를 쉽게 배치 할 수 있습니다. - AA와 PAT 의 곡선 집게 팁을 후크. 오프닝을 통해 다시 7-0 실크의 3cm 길이를 당겨 단일 던지기 느슨한 봉합사를 만듭니다.
- 가위를 사용하면 심장 정점을 향해 1-2mm 절개를 하여 얇은 벽의 오른쪽 심실(RV)을 관통하여 카테터(Unit 1)를 삽입할 수 있습니다. 삽입 하기 전에 시스템에 공기가 없는지 확인 합니다. 프라이밍 튜빙을 오른쪽 심실로 소개하고 반투명 얇은 벽의 PAT로 부드럽게 진출합니다.
- 카테터가 왼쪽 또는 오른쪽 폐 가지로 진행되지 않았으며 폐 동맥 분기점을 반소하지 않았는지 시각적으로 확인합니다. 테이프를 사용하여 튜브의 탈면 부분을 수술 보드에 고정하십시오.
참고: RV를 식별하려면 집게를 사용하여 심장의 오른쪽을 꼬집습니다. 좌심실과 달리 RV의 비교적 얇은 자유 벽을 쉽게 파악해야 합니다. - P7 보다 젊은 마우스의 경우, 장치 2를 마이크로 조작기에 부착하고 상기 기조를 사용하여 전술한 바와 같이 장치의 바늘 끝을 PAT에 도입한다.
- 카테터가 왼쪽 또는 오른쪽 폐 가지로 진행되지 않았으며 폐 동맥 분기점을 반소하지 않았는지 시각적으로 확인합니다. 테이프를 사용하여 튜브의 탈면 부분을 수술 보드에 고정하십시오.
- 큰 배 주위의 느슨한 봉합사를 부드럽게 조이고 3.2 단계에서 만든 봉합사의 8cm 길이를 잘라 내츄럴 한 휴식 위치로 심장을 돌려놓습니다. 이제 카테터는 PAT 내에서 단단히 고정됩니다.
- 심장의 왼쪽 오리클을 잘라서 퍼지가 시스템을 빠져나갈 수 있도록 합니다.
- 주사기 펌프에서 SNP 함유 주사기(유닛 1 또는 유닛 2, 크기 종속)를 확보하고 0.05mL/min의 속도로 용액을 침투하여 혈액을 플러시하고 혈관을 최대화합니다. 혈액/퍼퓸은 잘린 오리클을 통해 빠져나옵니다. 배설이 명확해질 때까지 관류를 계속하십시오 (성인 마우스의 경우 ~ 200 μL, 어린 동물에게는 적습니다).
참고: 낮은 점도 PBS/SNP를 인퓨징할 때, 시간을 절약하기 위해 상대적으로 높은 주입율이 사용되었습니다. 점성이 높은 폴리머 화합물은 과충진, 파열 및 탈모 종점에 대한 제어를 최대화하기 위해 느린 속도로 주입됩니다.
4. 기관 절제술 및 폐 인플레이션
- 폐 인플레이션 단위를 구성합니다(그림2).
- 유연한 플라스틱 24G 정맥(IV) 카테터(바늘 제거)/나비 주입 세트를 스톱콕에 연결하여 50mL 주사기(플런저 없음)에 부착합니다. 링 스탠드에서 주사기를 걸어.
- 주사기에 10% 버퍼링 된 포르말린을 추가합니다. 스톱콕을 열어 포르말린이 튜브에 들어가 시스템에서 모든 공기를 제거할 수 있도록 합니다. 스톱콕을 닫고 반월 상 연골이 기관8위에 20cm 가 될 때까지 주사기를 올립니다.
주의: 포르말린은 인화성, 발암성, 섭취 시 급성 독성이 있으며 피부 자극, 심각한 눈 손상, 피부 민감성 및 세균 세포 돌연변이성을 유발합니다. 섭취를 피하고 피부와 눈과 접촉하십시오. 증기 또는 미스트의 흡입을 피하십시오. 점화원에서 멀리 하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
- 2-4mm 를 분해한 연골에 두 개의 느슨한 봉합사를 열등하게 놓습니다.
- 가위를 사용하여, 봉합사보다 우수한 카리갑 인대에 작은 절개를합니다.
- IV 카테터를 개구부에 삽입하고 두 개의 느슨한 봉합사를 넘어 팁을 진행합니다.
- 기관 주위의 봉합사를 조이고 스톱콕을 엽니다. 포르말린이 중력으로 폐로 들어가폐를 완전히 팽창시킬 때까지 5분 동안 기다립니다. 폐가 인플레이션 중에 흉곽을 고수하는 경우, 무딘 기울어진 집게로 흉곽의 외부를 잡고 모든 방향으로 이동하여 엽을 자유롭게 합니다. 폐와 직접 접촉하지 마십시오.
- 5 분 후, 첫 번째 봉합사 및 ligate 넘어 IV 카테터를 다시. 두 번째 봉합사를 반복합니다. 폐는 이제 폐쇄되고 가압된 상태로 팽창됩니다.
5. 혈관을 캐스팅
- 1.5mL 튜브에서, 8:1:1 용액8의 폴리머:희석제:경화제의 1mL을 준비하고 좋은 혼합을 보장하기 위해 여러 번 부드럽게 반전한다.
- 1cc 주사기에서 플런저를 제거하고, 장갑을 낀 손가락으로 반대쪽 끝을 덮고, 폴리머 화합물을 주사기에 붓습니다. 플런저를 조심스럽게 다시 삽입하고, 뒤집고, 플런저를 전진하여 모든 공기를 제거하고 주사기 끝에 반월상 연골을 형성합니다.
- 바늘의 허브에서 SNP/PBS 주사기를 제거하고 반월 상연을 만들기 위해 허브에 추가 PBS를 드립. 허브에 갇힌 공기를 주의 깊게 확인하고 필요한 경우 빠져나와 반월 상 연골을 개혁하십시오. 중합체 화합물로 채워진 주사기에 허브에 가입하십시오.
참고: 양쪽 끝에 반월상연골을 만들면 공기가 시스템에 들어갈 수 있는 기회가 크게 줄어듭니다. - 주사기 펌프에 채워진 폴리머 화합물을 부착하고 0.02 mL/min에 주입한다.
참고: 폐가 작을수록 속도가 느려지는 것이 과충진을 방지하는 데 도움이 될 수 있지만 필수는 아닙니다. - PE 튜브아래로 자유롭게 이동하여 주사기 볼륨을 주의하십시오. 모든 로브가 모세관 수준으로 완전히 채워지고 주사기 펌프를 멈출 때까지 계속 채웁니다. 주사기 볼륨을 다시 확인합니다.
참고: 여러 실행 후 추정 부피를 사용하여 대략적인 끝점(성인 마우스의 경우~35 μL, P1 강아지의 경우 ~5 μL)을 측정할 수 있습니다. 펌프가 중단된 후 시스템의 잔류 압력은 중합체 화합물을 폐 동맥으로 계속 밀어 넣습니다. 모든 폐 엽은 비슷한 속도로 채워야합니다. - 광섬유 세척 물티슈로 폐를 덮고, PBS를 자유롭게 바르고, 시체가 실온에서 30-40 분 동안 방해받지 않고 앉을 수 있도록하십시오. 이 기간 동안, 중합체 화합물은 치료및 경화될 것이다.
- 카테터를 제거하고 마우스의 팔/하반을 끊고 머리/흉부를 50mL 원판에 넣고 하룻밤 사이에 10% 버퍼링된 포르말린으로 채워진다.
- 고정 후, 기관체를 잡고 부드럽게 나머지 늑골 케이지와 흉부에서 심장 / 폐 단위를 분리합니다. 심장/폐 블록을 포르말린으로 채워진 신경병 바이알에 놓습니다. 나머지는 폐기합니다.
6. 주조를위한 대체 혈관 침대 (표 1)
참고: 각 표적 혈관 침대에는 다른 카테터 배치, 주입 속도 및 최적의 충전 시간이 필요할 수 있습니다. 따라서 여러 개의 장기를 발동하려면 여러 동물이 필요합니다.
- 다이어프램에 우수하거나 열등한 전신 혈관 침대의 경우 위와 같이 1.1-2.5 단계를 따릅니다. 포털 시스템 및 다이어프램(표1)에대한 추가 메모를 참조하십시오.
- 자궁 경외 심정 과정을 파악하고 흉부 동맥 바로 앞에서 흉곽을 양측으로 잘라냅니다( 대략 미색선에서).
- 여전히 연결된 흉곽을 접어서 동물의 목/머리에 놓여 있어 가슴 구멍을 완전히 노출시합니다.
- 위의 단계 3.1을 따라 폐를 제거하십시오. 흉부 대오르타 (TA)가 보이면 다이어프램보다 + 10mm 우수한 곡면 집게의 팁을 연결합니다. 7-0 실크의 3cm 길이를 잡고 TA에서 개구부를 뒤로 당기고, 단일 던지기 느슨한 봉합사를 만듭니다. 다이어프램 위의 이 절차를 ~8mm 이상 반복합니다.
- 다이어프램보다 우수한 구조물의 경우, 스프링 가위를 사용하여 TA의 복부 부분에 작은 구멍(총 둘레의 ~30%)을 만들고, 6.4단계에 놓인 느슨한 봉합사보다 ~2mm 열등하게 된다.
- 다이어프램보다 열등한 구조의 경우, 대신, 느슨한 봉합사보다 우수한 작은 구멍 ~2mm를 만듭니다.
- 동물의 크기에 따라 1또는 2유닛을 용기에 넣고 느슨한 봉합사를 넘어 부드럽게 배를 리게이트합니다.
- 3.7단계를 따라 주사기 펌프를 1.0mL/min의 속도로 설정하고 최소 5mL를 인내합니다. Perfusate는 IVC를 통해 종료됩니다.
- 5.1 -5.4의 주입률을 0.05mL/min으로 조정하여 실시간으로 표적 조직을 시각적으로 모니터링합니다.
참고: 주입 량은 장기 및 동물 연령에 따라 다릅니다. 부피는 비표적 혈관 침대 (즉, 두뇌, 간, 신장, 창자)로 이어지는 동맥 가지를 결찰함으로써 더 제한 될 수 있습니다. - 5.6을 따라 표적 조직을 제거하고 포르말린에 놓습니다.
7. 마이크로 CT용 샘플 마운트, 스캔 및 재구성
- 파라핀 필름을 사용하여 스캐닝 침대에 평평한 표면을 만들고 이 표면의 젖은 샘플을 중심으로한다(그림 3A).
참고: 모션 아티팩트가 감지되면 샘플에 추가 안정화가 필요할 수 있습니다. - 탈수 방지를 위해 파라핀 필름을 추가하여 가볍게 텐트/커버 샘플을 추가로 처리합니다. 조직에 변형을 일으키는 샘플에 파라핀 필름을 쉬지 않도록 특별한주의를 기울인다(도3B).
- 표 2에 설명된 설정을 사용하여 샘플을 스캔하고 지정된 실험 내에서 이러한 매개 변수를 표준화합니다.
참고: 이것은 실험/끝점에 따라 다릅니다. 샘플 간의 비교용용으로 선택한 매개 변수를 표준화합니다. - 사후 처리 및 분석을 위해 재구성된 스캔을 전송합니다.
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Representative Results
성공적인 캐스트는 전체 폐 동맥 네트워크의 균일 한 충전을 전시할 것입니다. 우리는 나이에 이르기까지 C57Bl/6J 마우스에서 이를 입증합니다: 산후일 P90(도 4A),P30(도 4B),P7(도 4C),및 P1(도 4D). 유량의 속도를 제어하고 실시간으로 채우기를 시각적으로 모니터링함으로써, 가장 단산적인 혈관의 신뢰할 수 있는 종점이 달성되었다(도5A).
일반적인 과제는 폐 손상, 불완전한 충진, 충진 또는 과충, 카테터 웨징 및 동물 크기입니다.
폐/기도에 손상이 있는 경우, 작은 누출은 폐가 압력을 보유하지 못하게합니다(도 5B,C). 완전한 인플레이션이 없는 경우 샘플 간에 정확한 정량적 및 공간 비교를 하기가 어려워집니다. 폐 parenchyma에 위험을 최소화하려면 흉곽을 제거 할 때 폐에 너무 가깝게 절단하지 말고 수술 내내 PBS로 폐를 촉촉하게 유지하여 주변 구조물에 대한 탈수및 준수를 피하십시오. 로브가 인플레이션 중에 갈비뼈를 부착하는 경우, 흉곽의 바깥쪽을 (폐에서 멀리 떨어진 곳에) 조심스럽게 잡고 이동하여 로브를 풀어줍니다. 또는 매끄러운 가장자리를 가진 주걱과 같은 무딘 악기를 사용하여 팽창된 폐를 흉곽에서 들어 올리거나 밀어낼 수 있습니다. 폐를 팽창할 때, 제안된 압력 매개변수를 고수하고 기도의 파열로 이어질 수 있기 때문에 과잉 인플레이션을 피하십시오. 마지막으로, 후 고정이 완료 될 때까지 흉부 구멍에서 폐를 제거하지 마십시오. 기관, 폐 및 심장은 흉부 구멍의 나머지 부분에서 en bloc을 제거해야합니다.
패치(도 5D)또는 불완전(도5E)충전은 카테터를 통해 혈관 시스템에 공기가 유입되어 화합물의 하류 흐름을 차단하는 "에어록"에서 발생할 수 있다. 에어록의 가능성을 최소화하기 위해 삽입 전(3.4단계) 및 주사기 전환 시 카테터 끝에서 부터 폴리머 화합물로의 주사기 전환 중에 주의질적으로 공기를 제거한다. 채우기가 패치 또는 불완전한 상태로 남아 있는 경우 초점/긴 세그먼트 협착 또는 불법 성으로 인해 혈관 저항이 증가했음을 나타낼 수 있습니다. 혈전은 또한 불완전한 충진으로 이끌어 낼 수 있고 절차 의 앞에 헤파린을 사용하여 쉽게 피할 수 있습니다.
부적절한 사출 량은 과소 평가 또는 과충으로 이어질 것입니다. 밑약은 너무 작은 화합물이 혈관에 도입 될 때 발생(도 5F). 대안적으로, 지나치게 충진하거나 너무 많은 중합체 화합물을 너무 빨리 도입하면 동맥파열(도 5G)또는 더 일반적으로 정맥 운송(도5H)을유발할 수 있다. 주사기 펌프를 사용하여 두 가지 문제를 모두 완화할 수 있습니다. 조사관은 제안된 비율 및 볼륨 제한을 신중하게 준수하거나 특정 모델 및 최적화에 따라 자체 요금을 설정해야 합니다. 배율 하에서 실시간으로 폴리머 화합물 관류를 모니터링하는 것이 중요하며, 작은 동맥/모세혈관의 충진은 종점으로 사용되어야 한다.
폐 트렁크 아래로 카테터를 너무 멀리 진행하면 팁이 하나의 폐 동맥 가지에 쐐기를 박고 흐름의 불균형을 일으킬 수 있습니다. 그 결과, 한쪽은 한쪽폐에 과충진을 자주 유도하고 다른 한쪽에 충진을 하는 다른한쪽(도 5I)보다빠르게 채웁니다. 카테터 웨징이 이 시나리오에서 가장 가능성이 높은 이유이지만,"에어록"과 헤파린의 부족도 요인이 될 수 있습니다.
마지막으로, 작은 동물은 추가 장애물의 자신의 세트를 제시한다. 젊은 동물들은 꾸준한 손을 요구하고 작은 실수는 덜 용서합니다. 미세 수술을 위해 특별히 설계된 고품질 기기는 출생 후 초기 시점에서 더 중요해집니다. 미세 조작기의 사용은 배치뿐만 아니라 카테터 탈구를 방지하는 데 크게 도움이됩니다. 또한 작은 동물의 주사기 펌프를 활용하여 엔드포인트를 정확하게 제어하고 관리하는 것이 필수적입니다.
폐 혈관에 대해 구체적으로 도시되었지만,이 절차는 전신 표적 혈관 침대에 쉽게 적용 할 수 있습니다(표 1). 위에 나열된 과제 외에도 올바른 진입점을 선택하는 것이 중요합니다. 흉부 대동맥을 통해 주조하면 대부분의 혈관 침대에 훌륭한 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 카테터를 대상 부위에 근접으로 삽입하고 비표적 혈관을 계각하여 유량 및 부피 제어에 지원한다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 정제는 탈구 혈관 끝점(그림6A-F)과표준 주입 속도의 적절한 직접 모니터링과 결합되어 충진을 최적화합니다.Figure 6A 이러한 캐스팅 방법의 많은 예는 문학에 존재하고 완전한 참조를 위해 너무 많습니다. 그러나, 추가 세부 사항은 이들,,4,5,7,18,,,19,20, 21과,21같은 장기 특이적 텍스트에서 발견될 수 있다.,
주조 후, 샘플은 μCT 스캐닝(도7A,B)을위해 처리될 수 있다. 후처리의 경우 상업용 소프트웨어 패키지(재료 표참조)는 스틸 이미지(그림7C)또는 영화로 제시된 폐 혈관 트리의 3D 볼륨 렌더링을 생성했습니다. 세그먼트 길이 및 수, 단통, 순서(생성 또는 계급), 볼륨 및 아케이드 길이와 같은 혈관 특성을 탐구하는 추가 통계 분석도 수행될 수 있다. μCT 스캐닝 외에도, 캐스팅된 샘플을 지우어 총 이미지를 얻거나 조직학적 분석8을위해 처리 및 절단할 수 있다.
그림 1: 카테터 및 바늘 설정. 주사기는 부착 된 튜브와 바늘 (Unit1 및 Unit2)로 표시됩니다. 인셋: 바늘과 튜브의 클로즈업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폐 인플레이션 설정. 링 스탠드, 클램프, 포르말린으로 채워진 주사기, 카테터가 부착된 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 마이크로 CT 샘플 제제 사전 스캔. (A)여기서 표본은 파라핀 필름 베이스를 중심으로,(B)여기서 샘플은 파라필름 베이스에 중심과 덮여 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 3개월에서 1일 까지 다양한 발달 단계에서 혈관에 투사된 폐. 폐의 등쪽 보기,(A)P90,(B)P30,(C)P7, 및(D)P1은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 중합체 화합물 주입 중 이상적인 충진 및 일반적인 오류의 예로들 수 있습니다.(A)메우기 종점에 도달했을 때, 견고하고 미세한 혈관 망이 관찰되었다. (B)완전히 팽창된 포르말린 퍼퓨어드 폐는 백색 파선으로 나타내며,(C)부풀려진 폐가 부풀려진/수축된 폐가 나타난다. 이것은 손상된 폐기도 때문에 관찰되었습니다. 원래 팽창 된 위치는 흰색 대시 선으로 표현되고 수축 된 위치는 검은 점선으로 표현되며 (D)패치 충전 : 다른 영역이 완전히 채워진 동안 로브의 부분의 혈관은 채워지지 않은 채로 남아 있습니다.(E)불완전한 충진: 중합체 화합물이 폐의 전체 부분을 관통하지 못했고,(F)언더필링: 중합체 화합물은 황실 혈관을 채우지 못했고,(G)파열: 화살표는 혈관에서 압출된 폴리머 화합물을 가리키고,(H)정맥 충진: 동맥 분단을 가리키는 화살표를 완전히 채우고 정맥 시스템으로 확장한다. 정맥과 베뉴는 상당히 큰 구경이었다,(I)카테터 웨지 : 여기에 카테터는 왼쪽 엽이 과충 채우는 동안 오른쪽 엽의 혈관이 완전히 채우는 것을 방지 하나의 동맥으로 피종되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 추가 장기의 혈관 주조 및 끝점. (A)신장: 구두에 중합체 화합물의 천점 출현은 종점을 제공했다. (B)간: 장기의 가장자리에 보이는 작은 혈관을 주목한다. (C)위장: 작은 혈관이 보이고 완전히 채워졌습니다. (D)대장: 소형 선박은 쉽게 식별할 수 있고 채워져 있습니다. (E)다이어프램: 이곳의 근육은 얇고 반투명하며 작은 혈관이 뚜렷합니다. (F).뇌: 작은 혈관은 피질에서 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. CT 이미지와 중합체 화합물 채워진 폐의 3D 볼륨 렌더링. (A)단일 회색 스케일 재건 폐 슬라이스,(B)이것은 폴리머 채워진 폐로부터 생성된 CT 스캔의 최대 강도 프로젝션이었고,(C)혈관 아케이드의 3D 부피 렌더링은 시판 가능한 소프트웨어를 사용하여 생성되었다(재료표 참조). Table of Materials 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표적 동맥 혈관 침대 | 카테터 배치 | 주입 방향 | 주입 속도 | 노트 |
| 두뇌 | 두개골 대어를 가리키는 흉부 대어 | 경동맥으로 역행 | .05ml/분 | 캐누레이트 흉부 대어타, 마우스를 경향이 있는 위치로 뒤집고, 두피를 열고, 두개골을 통해 폴리머의 진행률을 시각적으로 모니터링합니다. |
| 다이어 프 램 | 왼쪽 벤터리컬 | 내부 흉부, 프레닉 및 늑간으로 영양학 | .05ml/분 | 흉곽 의 측면에 있는 창을 열고 흉곽과 다이어프램의 대부분을 그대로 둡니다. 왼쪽 통풍구를 캐누레이트하고, 오른쪽 아트리움을 클립하고, 다이어프램의 코달 측에서 진행 상황을 모니터링합니다. |
| 상반신 근육 | 두개골 대어를 가리키는 흉부 대어 | 브라치오페할릭과 좌아파안으로 역행 | .02ml/분 | 사지 흐름을 최적화하려면 경동맥을 묶고 사지 피부를 제거하여 사지 근육으로 폴리머 이동의 시각적 모니터링을 허용합니다. |
| 신장 | 소경을 가리키는 흉부 대어 | 신장 동맥으로 안테로그레이드 | .05ml/분 | 내부 혈관은 맹목적으로 채워져 있습니다. 정맥 통과를 피하기 위해, 중합체가 신장을 가로 질러 균일 한 천막 패턴으로 볼 때 주입을 중지합니다. |
| 포털 시스템 | 포털 정맥 | 포털 시스템으로 안테로그레이드 | .02ml/분 | 간을 부드럽게 접어 서 포탈 정맥을 노출합니다. |
| 간장 | 소경을 가리키는 흉부 대어 | 간 동맥으로 안테로틴 | .05ml/분 | 간으로 흐르는 창 자에서 정맥 통과를 피하기 위해 주입 하기 전에 포털 정맥을 묶어. |
| 위/ 장 | 소경을 가리키는 흉부 대어 | 체강으로 의영양증, 우수한 장분 및/또는 열등한 장분 | .05ml/분 | 창자의 일부 영역은 여러 동맥에 의해 공급 되 고 다른 시간에 채울 수 있습니다. 정맥 통과를 피하기 위해 관심 영역에 필요하지 않은 동맥을 묶고 중합체의 진행 상황을 시각적으로 모니터링하십시오. |
| 복부 내 지방 패드 | 소경을 가리키는 흉부 대어 | Anterograde하지만 선박은 연구되는 지방 패드에 따라 달라집니다 | .05ml/분 | 지방 패드는 여러 동맥에 의해 공급되며 다른 시간에 채울 수 있습니다. 정맥 통과를 피하기 위해 정확한 관심 영역에 필요하지 않은 동맥을 묶고 중합체의 진행 상황을 시각적으로 모니터링하십시오. |
| 낮은 사지 근육 | 인프라레날 대오르타 가리키는 | 대퇴동맥에 안테로그레이드 | .02ml/분 | 사지 피부를 제거하여 사지 근육으로 폴리머 이동을 시각적으로 모니터링할 수 있습니다. |
표 1. 대체 혈관 침대를 캐스팅.
| CT 설정 | |
| kVp | 90 |
| 대상 재료 | 텅스텐 |
| 전원 | 8w |
| 필터 | Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm |
| 프로젝션 번호 | 6424 |
| 검출기 크기 | 평면 패널 CMOS - 2944 x 2352 픽셀 |
| 시야 (FOV) | 36mm |
| 복셀 사이즈 | 72 μm |
| 공간 해상도 | 복셀 사이즈 x 1.5 |
| 취득 시간 | 약 14분 |
| 재건 | FBP 및 상용 알고리즘 |
| Binning | 1x1 |
표 2. μCT 스캐닝 매개변수.
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Discussion
제대로 실행, 이 방법은 폐 동맥 네트워크의 눈에 띄는 이미지를 산출, 설치류 모델의 비교 및 실험을 허용. 길을 따라 몇 가지 중요한 단계는 성공을 보장합니다. 첫째, 조사관은 혈전이 심장의 폐 혈관과 챔버에서 형성되는 것을 방지하기 위해 준비 단계에서 동물을 헤아린해야합니다. 이를 통해 중합체 화합물의 완전한 동맥 통과를 가능하게 합니다. 둘째, 다이어프램을 뚫고 흉곽을 제거 할 때, 부주의 한 손상, 상처 또는 부상으로부터 폐를 보호하기 위해주의하십시오. 기도의 누출은 완전한 인플레이션을 방지하고 샘플 간의 비교가 부정확합니다. 셋째, 정점에 심장을 테더링하면 카테터 배치를 돕습니다. 넷째, SNP와 같은 강력한 혈관 확장제의 사용은 혈액 제거와 동맥 및 모세 혈관의 완전한 충진을 모두 돕습니다5,,8. 다섯째, 카테터를 PAT에 넣을 때, 분기에 팁을 묻지 않도록 주의하십시오. 이것은 흐름에 불균형을 일으킬 것입니다, 왼쪽 또는 오른쪽 중 하나에 폴리머 화합물을 피하고, 불평등 한 압력 그라데이션을 산출. 여섯째, 주사기 펌프를 사용하면 사용자가 마우스 변형과 나이 모두에 대한 볼륨을 제어하고 부피를 조절할 수 있습니다. 마지막으로, 흉부 구멍의 나머지 부분에 부착 된 심장 / 폐를 두고 하룻밤 고치고 다음 날을 제거하십시오. 폐는 잘 고정되고 분리 도중 우발적인 결반때문에 디플레이션을 위한 잠재력은 최소화될 것입니다.
이 방법론은 원하는 결과를 달성하는 반면, 대체 기술은 일부 사용자에게 도움이 될 수 있습니다. 카테터의 배치를 돕기 위해 마이크로 조작기를 사용할 수 있습니다. 우리는 안정적인 베이스를 제공하면서 이미 제한된 작업 영역에서 침범을 최소화하기 위해 작은 프로파일과 자기 베이스버전을 선택했습니다 (자기 베이스를 사용하면 자석이 작동 공간 아래에 강판을 놓아 자석이 참여할 수 있도록하십시오). 이를 통해 사용자는 교정기의 자연스러운 궤적을 따르는 각도로 PAT에 카테터 의 끝을 정확하게 배치할 수 있습니다. 또한 카테터는 안전하며 빠질 위험이 적습니다. 또 다른 옵션은 트럼펫 카테터 팁8의사용입니다. 만드는 것은 사소한 것이 아니지만, 트럼펫 카테터는 훨씬 더 안전하고 실수로 PAT에서 미끄러지는 경향이 적습니다. 대상 혈관 및 실험 종점에 따라 이것은 귀중한 고려 사항이 될 수 있습니다. CO2를 통한 안락사는 동물의 작은 비율로 폐 출혈을 일으킬 수 있으며 변형의존22. 이러한 영향을 미치는 실험적 종점에 영향을 미칠 경우 대체 안락사 프로토콜을 고려하십시오. 폐를 팽창할 때, 포르말린의 사용은 주어진 압력에 있는 기관의 고정을 돕습니다. 생리학적으로 중성 완충제는 주변 혈관을 고정되지 않은 상태로 채우어야 하는 경우 대체될 수 있다. 주입 속도와 제어가 주어진 실험에 덜 중요할 경우, 손으로 관류도 가능하다. 손 분사에는 과충진이나 혈관 파열을 피하기 위해 배율 하에서 연습 및 실시간 모니터링이 필요합니다8. 마지막으로, 이 백서에 사용한 티슈 마운트/조건, 스캐닝 매개변수 및 최소한의 후처리는 단지 출발점으로 만 작용해야 합니다. 스캐너, 조직, 실험 적 엔드포인트 / 사용자 요구사항이 다른 매개 변수를 요구할 수 있습니다.
이 기술로 생성된 혈관 이미지는 인상적이지만 한계가 있습니다. 주로, 상기 방법은 주입 중에 혈관 압력을 모니터링하고 제어할 수 없기 때문에 혈관 구경을 측정하는 최적이 아니다. 다른 그룹은 운전 압력4,23을모니터링하여 전신 혈관에 이러한 압력 문제를 다소 해결하는 데 성공했지만,압력(24)의 작은 변화로 쉽게 탈바할 수 없는 비교적 얇은 폐 동맥 벽으로 인해 폐 측에서 이러한 우려가 더욱 증폭되고 있으며, 정밀하게 측정하고 정적으로 폐래를 제어할 수 없다.23
이 방법에 대한 두 번째 제한은 진정한 생리적 조건이나 시간 과정을 필요로하는 연구에서 유틸리티를 제한하는 사후, 단일 타임 포인트 실험으로 남아 있다는 것입니다. CT 폐 혈관 조영술 (CTPA) 또는 대비 강화 된 μCT (CE-CT)와 같은 다른 살아있는 동물 측정은 기능적 및 형태학적 조치의 가능성을 제공합니다. 반복 스캔/종로 연구뿐만 아니라 심장/폐 주기의 다른 지점에서의 측정은10,,25,,26,,27,,28을탐구할 수 있다. 이러한 방법은 에코카르디그래피 외에도 동맥 구경을 측정하기 위해 안정적으로 사용될 수 있다. 그러나 CTPA와 에코카르디그래피 측정값은 현재 근위 혈관의 평가로 제한됩니다. 심초음파의 경우, CTPA는 분기 폐 동맥 구경의 적절한 계산을 허용하면서 폐 트렁크에 국한되어 1-2 주문이 더 가능하지만, 해상도는 제한된, 혈관의 분해 부분을 모호하게7. 방사선 투여량은 또한 특히 다중 스캔 세로 연구에서 CT를 사용할 때주의 깊게 모니터링해야 하는 관심사이다29,,30. 이러한 응용 프로그램 중 하나에 대 한, μCT 장비, 스캔 시간 및 분석 소프트웨어 비용이 많이 들 수 있습니다 및 전문 직원 교육 필요. 일부 기관의 동물 이미징 핵심 시설은 이러한 부담을 덜어줄 수 있습니다.
이 화합물에 대한 대안으로, 일부 그룹은 연조직 제거31,,32를동반전통적인 부식 주조 기술을 활용한다. 이러한 방법은 이 중합체 화합물과 유사한 결과를 산출하지만 최종 제품은 부서지기 쉽고 잠재적 인 유물(15)로이어진다. 또한, 연조직의 제거는 미래 조직학에 대한 잠재력을제거한다(33). 또 다른 옵션은 연조직을 그대로 두고 연조직이 샘플을 사실상 투명하게 하는 "지워진" 후속 단계를 수행하는것입니다(34,,35). 조직 클리어링은 사용자에게 샘플 내에서 더 깊이 볼 수 있는 몇 가지 기능을 제공하지만, 전체적으로 동일한 3D 시각화를 제공할 수 없기 때문에 μCT보다 열등합니다. 직렬 히스토로지단과 어레이 단층 촬영은 매우 높은 해상도를 제공하는 방법입니다. 이 기술은 흥미로운 새로운 가능성의 문을 열지만 워크로드는 기하급수적으로 높으며 대형 코호트11,,12에특히 도움이되지 않습니다. 3D 엑스레이 히스토로지는 μCT와 전통적인 히스토로지 또는 EM36,,37,,38을모두 결합하는 비파괴적인 접근법이다. 그것은 전 세계적으로 식별 하 고 정확 하 게 관심영역을 정찰 하는 μCT를 활용 하 여 병리학의 더 높은 수준의 보기를 걸립니다 그 다음 일상적인 조직학으로 후속39. 낮은 분해능 콘트라스트 에이전트(또는 경우에 따라 대조없음)를 복막으로 폴리머 화합물로 대체하면 가능하면 두 기술을 모두 상승시키는 역할을 할 수 있다. 아직 계산 집약적이면서도 콘트라스트를 향상시키는 또 다른 비파괴적 접근법은 위상 검색 μCT 이미징40,,41이다. 이 방법은 대비가 약하거나42가불가능한 시끄러운 데이터에 사용할 때 유용할 수 있습니다. 그러나 이 기술에 사용되는 폴리머 화합물은 이러한 제한으로 고통받지 않습니다. 즉, 위상 회수는 고분자 화합물이 희석될 수 있는 경우에 유용할 수 있습니다, 예를 들어 탈구 혈관(43)에서. 마지막으로, 입체학은44년동안 폐 정량적 구조 분석의 표준이었다. 그것은 선택한 견본이 충분히 대표한다는 가정하에 3-D 추론을 만들기 위하여 조직의 단면에 무작위, 체계적인 샘플링을 이용합니다. 강력한 도구이지만 오류와 편견으로 이어질 가능성이 있습니다. 그러나 CT 이미징과 스테레오로지를 결합하면45.
설명된 방법은 비교적 간단하며 교육과 함께 >90 %의 성공률을 달성 할 수 있습니다. 일단 마스터되면 폐 혈관의 완전하고 신뢰할 수있는 주조를 허용합니다. 고정에서, 조직 및 중합체는 향후 스캔, 잠재적 조직학 또는 EM46,,47에대해 무기한 안정적으로 유지한다. 우리는 이 기술이 성년을 통해 P1의 젊은 동물에서 사용될 수 있고 폐 동맥을 통해 배아 주조가 도달 범위 내에 있다는 것을 믿습니다. 이 기술은 단순히 카테터 진입점을 변경하고 적절한 엔드 포인트를 결정하여 거의 모든 다른 혈관 침대에 적용 할 수 있음을 주목해야한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
이 연구는 NHLBI 교내 연구 프로그램 (DIR HL-006247)에 의해 부분적으로 지원되었다. NIH 마우스 이미징 시설에서 이미지 수집 및 분석에 대한 지침을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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