Summary
この技術の目的は、肺インフレおよび肺動脈を介した放射線不透明ポリマー系化合物の注入を介した早期出生後および成人マウスの肺動脈ネットワークのex vivo視覚化である。キャストされた組織の潜在的な用途についても議論される。
Abstract
血管は、3次元空間で複雑なネットワークを形成します。その結果、血管ネットワークが組織の表面を観察することによってどのように相互作用し、動作するかを視覚的に理解することは困難である。この方法は、肺の複雑な3次元血管アーキテクチャを可視化する手段を提供する。
これを達成するために、カテーテルが肺動脈に挿入され、脈管構造が同時に血液を洗い流され、化学的に拡張されて抵抗を制限する。肺は、標準的な圧力で気管を通して膨張し、ポリマー化合物は、標準的な流量で血管床に注入されます。動脈ネットワーク全体が満たされて治癒することが許されると、肺血管構造を直接可視化するか、マイクロCT(μCT)スキャナで画像化することができます。
正常に行われると、出生後の早期から成人までのマウスの肺動脈ネットワークを理解することができる。さらに、肺動脈床で実証されている間、この方法は、最適化されたカテーテルの配置およびエンドポイントを有する任意の血管床に適用することができる。
Introduction
この技術の焦点は、マウスにおけるポリマー系化合物を用いた肺動脈アーキテクチャの可視化である。脳、心臓、腎臓,,11、2、3、4、5などの全身血管床に関する広範な作業が行われてきたが、肺動脈ネットワークの準備および充填に関する情報は少ない。,2,345したがって、この研究の目的は、前の研究66、7、87,8に拡大し、調査官が肺動脈樹の高解像度画像を生成するために簡単に従うことができる詳細な書面および視覚的な参照を提供することである。
磁気共鳴画像、心エコー検査、CT血管造影,9、10など、肺血管構造の標識やイメージングには数多くの方法がありますが、これらのモダ9リティの多くは小さな血管を十分に充填および/または捕獲できず、研究できる範囲を制限しています。シリアル断面化や再構築などの方法は、高解像度を提供しますが、時間/労働集約型の11、12、13です。,12,13従来の腐食鋳造,,10、13、14、15、16で、軟部組織の完全性を取り巻く妥協がある。10,13,141516動物の年齢や大きさでさえ、カテーテルを導入しようとするときに、または、解像度が欠けている要因になります。一方、ポリマー注入技術は、動脈を毛細管レベルまで満たし、μCTと組み合わせると、比類ない分解能5を可能にする。出生後14日目の若いマウス肺からのサンプルは、8に正常にキャストされ、数時間で処理されました。これらは、無期限に再スキャンすることも、既存の軟組織17を損なうことなく組織学的準備/電子顕微鏡(EM)のために送ることさえできる。この方法の主な制限は、CT機器/ソフトウェアの先行コスト、血管内圧を正確に監視する課題、および同じ動物の中で縦方向にデータを取得できないことです。
この論文は、肺動脈注射技術をさらに最適化し、年齢/サイズ関連の境界を出生後1日目(P1)に押し下げて顕著な結果を生み出す既存の作業に基づいています。動脈血管ネットワークを研究したいチームにとって最も有用です。したがって、カテーテルの配置/安定化、フィルレート/ボリュームの制御の強化、鋳造成功の増加に対する注目すべき落とし穴のハイライトに関する新しいガイダンスを提供します。その結果、結果のキャストを将来の特性評価と形態解析に使用できます。おそらくもっと重要なのは、これは私たちの知る限りでは、この複雑な手順をユーザーに説明する最初の視覚的なデモンストレーションです。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、国立心臓肺血液研究所の施設動物のケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています。
1. 準備
- ヘパリン(1単位/gマウス体重)で腹腔内にマウスを注入し、2分間アンブレートさせます。
- CO2チャンバーで動物を安2楽死させる。
- 外科用基板の上の上の上の上の位置にマウスを配置し、テープでボードにすべての4つの手足を固定します。細かい解剖のために倍率を使用してください。
2. 肺と気管の露出
- 毛髪の干渉を最小限に抑えるために、マウスの腹側に70%エタノールをスプレーします。
- 鉗子で腹部の皮膚をつかみ、臍帯ではさみで小さな切開を行います。腹筋と皮膚の間の筋層にはさみの先端をスライドさせ、2つの層を分離し始めます。腹部、胸部、頸部から皮膚を取り除く、ロストレ的に働く。
- 腹部の筋肉をはさみで開き、横隔膜が露出するまで両側を横切って切ります。
- xiphoidプロセスを穏やかにつかみ、細い半透明の横隔膜を通して尾頭肺の視界を最大限に引き上げます。xiphoidプロセスのすぐ下にある横隔膜に小さな切開を慎重に行います。肺は崩壊し、横隔膜から引き離されます。胸部から隔膜を解剖し、肺のパレンチマをニックしないように注意する。
- 下の大静脈(IVC)と食道を見つけて切断し、横隔膜を通過します。ガーゼを使用して胸腔内の任意のプール血液をクリーンアップします, 肺との接触を避けます.
- もう一度xiphoidをつかみ、穏やかに持ち上げます。肺との接触を避けて、胸部を両側(大体中軸線)で切る。前胸部を完全に取り除き、骨膜の直前に胸骨の角度に沿って最終的なカットを行います。
- プリフィルドシリンジを使用して、乾燥を防ぐためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で肺を自由に濡らします。この手順を通してこのルーチンを続けます。
- 鉗子を使用して、マニュブリウムをつかみ、体からそっと離れて上昇します。はさみを使用して、マニュバーに1〜2mmの横をカットし、鎖骨を切断し、除去します。これは、下の胸腺を露出します。
- 胸腺のローブを一つずつ持ち、引き離して取り除きます。顎下腺でこの手順を繰り返します。最後に、気管を重ねている筋肉組織を取り除きます。
注:解剖の後、心臓、上り大動脈(AA)、肺動脈幹(PAT)、および気管が見える必要があります。幹の初動脈枝が分かれて傷ついていないことを確認します。
3. PAカテーテル法および血液灌流
- ユニット1を組み立てるには、30G針のハブにPE-10チューブの糸15cmを組み立て、PBSで10-4 Mナトリウムニトロトルシド(SNP)をあらかじめ充填した1mLシリンジに取り付けます。このユニットからすべての空気がパージされるまでプランジャを進めてチューブをプライムする(図1)。
注意:SNPは飲み込むと有毒です。皮膚や目との接触を避けてください。取扱い後、肌をよく洗ってください。適切な個人用保護具を着用してください。- または、ユニット2を組み立てます。7日目(P7)以下のマウスの場合、止止めを使用してハブから追加の30G針を取り外し、針をユニット1のチューブの開いた端に通す(図1)。
- 針の代わりに、曲面の鋭い鉗子を使用して、長さ10cmのシルクの一方の端をつかみます。一方の側から入り込む心臓の頂点を貫通し、筋を通して、もう一方の側の外に鉗子の先端を渡す。別の鉗子でシルクをつかみ、約2cmの長さを引っ張って結びます。縫合糸の残りの8cmの端を取り、心臓を引っ張り、外科用ボードに最後をテープで留めます。
注:これは緊張を作成し、さらに大きな血管を露出させ、心臓を所定の位置にテザリングし、肺動脈内のカテーテルの配置を容易にします。 - AAとPATの両方の下で湾曲した鉗子の先端をフックし、開口部を通して7-0シルクの3cmの長さを引き戻し、シングルスローの緩い縫合糸を作成します。
- はさみを使用すると、心臓の頂点に向かって1〜2mmの切開を行い、薄壁の右心室(RV)を貫通し、カテーテル(Unit 1)の挿入を可能にする。挿入する前に、システムに空気がないことを確認してください。プライミングチューブを右心室に導入し、半透明の薄壁PATにそっと進めます。
- カテーテルが左または右の肺分岐に進んでいないこと、および肺動脈分岐点に隣接していないことを視覚的に確認する。テープを使用して、チューブの遠位部分を外科用基板に固定します。
注:RVを識別するには、フォースを使用して心臓の右側をつまむ。左心室とは異なり、RVの比較的薄い自由な壁は容易に把握されるべきである。 - P7より若いマウスの場合は、ユニット2をマイクロマニピュレーターに取り付け、マニピュレータを使用して上記のようにユニットの針端をPATに導入します。
- カテーテルが左または右の肺分岐に進んでいないこと、および肺動脈分岐点に隣接していないことを視覚的に確認する。テープを使用して、チューブの遠位部分を外科用基板に固定します。
- 両方の大きな容器の周りの緩い縫合糸を静かに締め、ステップ3.2で作成された縫合糸の8cmの長さをカットして、心臓を自然な休息位置に戻します。カテーテルは今しっかりとPAT内で固定されています。
- 心臓の左耳の大音をクリップして、パーフューズがシステムを終了できるようにします。
- シリンジポンプ内のSNP含有シリンジ(ユニット1またはユニット2、サイズ依存)を確保し、0.05 mL/minの速度で溶液を浸透させ、血液を洗い流し、脈管構造を最大限に拡張します。血液/パーフューズは、切り取られた耳介を介して出ます。パーフューズートが透明になるまで灌流を続けます(成虫マウスでは200μL程度、若い動物の場合は少ない)。
注:低粘度のPBS/SNPを浸透させる場合、時間を節約するために比較的高い注入速度が使用されました。より粘性ポリマー化合物は、過充填、破裂を防止し、遠位端点の制御を最大化するために、より遅い速度で注入されます。
4. 気管切開と肺の膨張
- 肺膨張ユニットを構築する(図2)。
- 柔軟なプラスチック24G静脈内(IV)カテーテル(針を取り除く)/蝶の注入をストップコックに接続し、開いた50 mLシリンジ(プランジャーなし)に取り付けます。リングスタンドから注射器を掛けます。
- 10%緩衝ホルマリンをシリンジに加えます。栓コックを開き、ホルマリンがチューブに入り、システムからすべての空気をパージできるようにします。ストップコックを閉じ、半月板が気管の上に20cmになるまで注射器を上げる8.
注意:ホルマリンは、引火性、発がん性、急性毒性、皮膚刺激、深刻な眼の損傷、皮膚感作、および生殖細胞変異原性を引き起こす。摂取を避け、皮膚や目と接触します。蒸気や霧の吸入を避けてください。点火の原因から遠ざけてください。適切な個人用保護具を着用してください。
- 2~4mm離れたクリコイド軟骨より下の2つの緩い縫合糸を置きます。
- はさみを使用して、縫合糸よりも優れたcrico甲状腺靭帯の小さな切開を行います。
- IVカテーテルを開口部に挿入し、2つの緩い縫合糸を超えて先端を進めます。
- 気管の周りの縫合糸を締め、栓コックを開きます。ホルマリンが重力で肺に入るようにし、肺が完全に膨張するまで5分待ちます。肺がインフレ時に胸部に付着する場合は、鈍い先端の鉗子で胸部の外側をつかみ、葉を解放するのを助けるためにすべての方向に移動する。肺と直接接触しないでください。
- 5分後、IVカテーテルを第1縫合糸を越えてリゲートを戻す。2 番目の縫合線についても繰り返します。肺は閉鎖された加圧状態で膨張するようになりました。
5. 血管系を鋳造する
- 1.5 mLチューブで、8:1:1溶液8 のポリマー:希釈剤:硬化剤の1 mLを調製し、良好な混合を確実にするために数回穏やかに反転します。
- 1 ccのシリンジからプランジャーを取り出し、手袋をした指で反対側の端を覆い、ポリマー化合物をシリンジに注ぎます。慎重にプランジャーを再挿入し、逆にし、すべての空気を除去し、シリンジの先端に半月板を形成するためにプランジャーを進めます。
- 針のハブからSNP/PBS注射器を取り出し、追加のPBSをハブに滴下して半月板を作成します。ハブに閉じ込められた空気がないか慎重に確認し、必要に応じて外し、半月板を改革してください。高分子化合物で満たされたシリンジにハブを結合します。
注:両端に半月板を作成すると、空気がシステムに入る機会が大幅に減少します。 - 高分子化合物充填シリンジをシリンジポンプに取り付け、0.02 mL/minで注入します。
注:小さな肺の場合、遅い速度は過剰充填を防ぐのに役立ちますが、必須ではありません。 - PEチューブを自由に下に移動し、PATに入る際にシリンジのボリュームに注意してコンパウンドを監視します。シリンジのボリュームをもう一度確認してください。
注:数回実行した後、推定ボリュームを使用して、おおよそのエンドポイント(成人マウスの場合は〜35 μL、P1子犬の場合は約5 μL)を測定できます。ポンプが停止した後、システム内の残留圧力は、高分子化合物を肺動脈に押し込み続けます。すべての肺ローブは、同様の速度で満たされるべきです。 - 光ファイバークリーニングワイプで肺を覆い、PBSを自由に塗布し、死体を室温で30〜40分間邪魔しないようにします。この期間中、高分子化合物は硬化し、硬化します。
- カテーテルを取り外し、マウスの腕/下半分を切断し、ヘッド/胸郭を10%緩衝ホルマリンで満たされた50 mL円錐形に一晩置きます。
- 固定後、気管をつかみ、心臓/肺ユニットを残りの肋骨ケージと胸部からそっと分離します。ホルマリン充填シンチレーションバイアルに心臓/肺ブロックを入れる。残りを破棄します。
6. 鋳造用の代替血管床(表1)
注:各ターゲット血管床は、異なるカテーテルの配置、注入速度、および最適な充填時間を必要とすることができます。したがって、複数の動物が複数の臓器をキャストする必要があります。
- 横隔膜よりも優れたまたは劣った全身血管床については、上記の手順1.1〜2.5に従ってください。ポータル システムとダイヤフラムに関するその他の注意事項を参照してください (表 1)。
- 止血でxiphoidプロセスをつかみ、内部胸部動脈の直前に両側(大体中軸線)で胸部を切断する。
- まだ接続されている胸部を動物の首/頭の上に置き、胸腔を完全に露出させるような上に折り畳みます。
- 上記のステップ3.1に従い、肺を取り除きます。胸部大orta(TA)が見えたら、その下に湾曲した鉗子の先端を引っ掛け、横隔膜より約10mm優れた。7-0シルクの長さ3cmをつかみ、TAの下の開口部を引き戻し、シングルスローの緩い縫合糸を作成します。ダイヤフラムの上に約8mmこの手順を繰り返します。
- 横隔膜より優れた構造の場合、スプリングはさみを使用してTAの腹側部分に小さな穴(全周の30%)を作成し、ステップ6.4に配置された緩い縫合糸に対して〜2mm劣る。
- ダイヤフラムより劣る構造の場合は、代わりに、緩い縫合糸よりも優れた小さな穴〜2mmを作成します。
- 動物の大きさに応じて、ユニット1または2を容器に導入し、緩い縫合糸を超えて進み、容器を穏やかにリゲートします。
- ステップ3.7に従い、1.0 mL/minの速度でシリンジポンプを設定し、最低5 mLを浸透させる。パーフューズはIVC経由で終了します。
- 0.05 mL/minに注入速度を調整するステップ5.1-5.4に従い、リアルタイムで標的組織を目視的にモニタリングする。
注:注入量は、臓器および動物の年齢に固有になります。容積は、非標的血管床(すなわち、脳、肝臓、腎臓、腸)につながる動脈枝を合流させることによってさらに制限することができる。 - 5.6に従い、標的組織を取り除き、ホルマリンに入れる。
7. マイクロCT用のサンプルマウント、スキャン、および再構築
- パラフィンフィルムを使用して、走査ベッドに平らな表面を作成し、この表面に湿ったサンプルを中心にします(図3A)。
注: モーションアーティファクトが検出された場合、サンプルはさらに安定化を必要とする場合があります。 - 脱水を防ぐために、追加のパラフィンフィルムで軽くテント/カバーサンプル。組織に変形を起こす試料上にパラフィンフィルムを置かないように特別な注意を払ってください(図3B)。
- 表 2に示す設定を使用してサンプルをスキャンし、特定の実験内でこれらのパラメーターを標準化します。
注: これは実験/エンドポイントに依存します。サンプル間の比較を容易にするために、選択したパラメータを標準化します。 - 後処理および分析のために再構築されたスキャンを転送します。
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Representative Results
成功したキャストは、肺動脈ネットワーク全体の均一な充填を示します。これは、C57Bl/6Jマウスの年齢に及ぶ:出生後の日P90(図4A)、P30(図4B)、P7(図4C)、およびP1(図4D)でこれを実証する。Figure 4C流量を制御し、リアルタイムで充填を監視することで、最も遠位血管系の信頼性の高いエンドポイントが達成されました(図5A)。
一般的な課題には、肺の損傷、不完全な充填、不足充填、または過剰充填、カテーテルのくさび、動物の大きさなどがあります。
肺/気道に損傷がある場合、小さな漏れは肺が圧力を保持するのを妨げる(図5B、C)。C完全なインフレーションがない場合、サンプル間で正確な定量比較と空間比較を行うのは困難になります。肺のパレンチマへのリスクを最小限に抑えるために、胸部を取り除くときに肺にあまりにも密接に切断することを避け、脱水症状を避け、周囲の構造に付着することを避けるために、手順全体を通してPBSで肺を湿らせておいてください。インフレ時にローブがリブケージに付着する場合は、胸部の外側(肺から離れる)を鉗子でそっとつかみ、それを方向に動かしてローブを解放します。あるいは、滑らかなエッジを持つヘラのような鈍い器具を、膨張した肺を胸部から持ち上げたり押し出したりするために使用することができます。肺を膨らませる場合は、推奨圧力パラメータに従い、気道の破裂につながる可能性がありますので、過剰インフレを避けてください。最後に、後固定が完了するまで、胸腔から肺を取り除かないでください。気管、肺、および心臓は、胸腔の残りの部分からブロックを取り除くべきである。
パッチ(図5D)または不完全な(図5E)充填は、カテーテルを介して血管系に空気が導入され、化合物の下流流を遮断する「エアロック」から生じる可能性があります。エアロックの可能性を最小限に抑えるために、挿入前のカテーテルの先端(ステップ3.4)から、そしてSNP/PBSから高分子化合物への注射器の移行中に、気を入れて空気を慎重にパージします。充填物がパッチ状または不完全なままである場合、焦点/長いセグメント狭窄またはトルトウ症の結果として血管抵抗が増加した徴候である可能性があります。血栓はまた不完全な充填を導き、処置の前にヘパリンを使用することによって容易に避けることができる。
不適切な注入量は、不足や過剰充填につながります.不足充填は、あまりにも少ない化合物が血管系に導入されたときに発生します (図 5F)。あるいは、過剰充填、またはあまりにも多くの高分子化合物をあまりにも速く導入すると、動脈破裂(図5G)または、より一般的には静脈通過を引き起こす可能性がある(図5H)。両方の問題は、シリンジポンプを使用して軽減することができます。調査官は、提案された速度と体積の制限を慎重に遵守するか、特定のモデルと最適化に基づいて独自のレートを確立する必要があります。倍率下でリアルタイムでポリマー化合物灌流をモニタリングすることは重要であり、小さな細動脈/毛細血管の充填はエンドポイントとして使用する必要があります。
肺幹を下りすぎると、先端が1つの肺動脈枝にくさびを打ち、流れの不均衡を引き起こす可能性があります。その結果、一方の側が他方よりも速く充填されます (図 5I),これは頻繁に一方の肺に過剰充填し、他方で不足につながります.カテーテルのくさびが最も可能性の高い理由であるが、このシナリオでは「エアロック」とヘパリンの欠如も要因となり得る。
最後に、小さな動物は、追加の障害物の独自のセットを提示します。若い動物は安定した手を要求し、小さな間違いはあまり寛容ではありません。マイクロサージャリー用に特別に設計された高品質の機器は、出生後の早期タイムポイントでより重要になります。マイクロマニピュレーターの使用は、配置だけでなく、カテーテルの転位を防ぐのに大いに助けます。また、エンドポイントを正確に制御および管理するためには、小型動物のシリンジポンプを利用することも不可欠です。
肺血管系について具体的に示されているが、この手順は全身的な標的血管床にも容易に適用することができる(表1)。上記の課題に加えて、適切なエントリポイントを選択することが重要です。胸部大動脈を介して鋳造はほとんどの血管のベッドのための優秀な結果を作り出す。しかしながら、カテーテルを可能な限り標的部位に近位として挿入し、非標的血管系を結紮することは、流量および体積制御を補助することに留意すべきである。これらの改良と遠位血管端点の適切な直接モニタリング(図6A-F)および標準的な注入速度が充填を最適化します。このような鋳造法の多くの例は文献に存在し、完全な参照には多すぎます。,ただし、これらの,,,4、5、7、18、19、20、215,7などの臓器固有のテキストに追加の詳細が見つかることがあります。418192021
鋳造後、μCTスキャン用にサンプルを処理することができます(図7A、B)。B後処理の場合、市販のソフトウェア パッケージ (材料表を参照) は、静止画像 (図 7C)、または映画として提示された肺血管ツリーの 3D 容積レンダリングを生成しました。セグメントの長さや数、曲がりくねり、順序(生成またはランク)、体積、およびアーケードの長さなどの血管特性を探索するさらなる統計解析も行うことができます。μCTスキャンに加えて、キャストされたサンプルをクリアして総画像を得たり、組織学的分析のために処理および切断したりすることもできます。
図1:カテーテルと針のセットアップ 注射器は付属のチューブと針(Unit1およびUnit2)で示されています。インセット:針とチューブのクローズアップ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:肺インフレの設定 リングスタンド、クランプ、ホルマリンで満たされた注射器、カテーテル付きのチューブ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロCTサンプル調製前スキャン(A)ここで試料をパラフィンフィルムベースを中心とし、ここで試料をパラフィルムベースにB中心にして被覆した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:生後3ヶ月から1日までの様々な発達段階での血管キャスト肺肺の裏視、(A)P90、(B)P30、(C)P7、および(D)P1Bこの図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。 AC
図5:ポリマー化合物注入中の理想的な充填および一般的な誤差の例( A)充填端点に達した場合、堅牢で微細な血管ネットワークが観察された。(B) 完全に膨張したホルマリン浸透肺は白い破線で表され、(C)膨脹/膨張した肺が示される。これは、肺気道の障害のために観察されました。元の膨張した位置は白い破線で表され、膨張した位置は黒い点線で表され、(D)パッチリ充填:ローブの一部の血管構造は、他の領域が完全に充填されている間は充填されず、広がったままです。(E)不完全充填:高分子化合物は肺の全部分に浸透することができなかった、(F)充足:ポリマー化合物は、遠位脈管系を充填することができなかった、(G)破裂:矢印は血管系から押し出されたポリマー化合物を指しているF、(H)静脈充填:動脈セグメントを指し示す矢印に注意してください。GH静脈および小胞は有意に大きな口径、(I)カテーテルくさび:ここではカテーテルが1つの動脈にシャントされ、左葉が過剰に充填されている間に右葉の血管構造が完全に満たされるのを防いだ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.血管の鋳造と、追加の器官の終点。(A)腎臓:糸球体中の高分子化合物のパンクテートの外観がエンドポイントを提供した。(B)肝臓:器官の縁に見える小さな血管に注意してください。(C)胃:小さな血管が目に見え、完全に満たされていた。(D)大腸:小血管は容易に識別でき、満たされる。(E)横隔膜:ここの筋肉は薄く、小さな充填された血管が見える半透明です。(F).脳: 小さな血管は皮質に見えた.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.高分子化合物充填肺のCT画像と3D体積レンダリング。 (A) 単一の灰色スケールの再構築された肺スライス、 (B) これは、ポリマー充填肺から生成されたCTスキャンの最大強度投影であり、(C)市販のソフトウェアを用いて血管の3D容積レンダリングを生成した( 材料表を参照)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ターゲット動脈血管床 | カテーテルの配置 | 輸液方向 | 輸液率 | ノート |
| 脳 | 胸部大オルタが目を見つめ | 頸動脈への逆行 | 0.05ml/分 | 胸部大表、マウスを起こしやすい位置に反転させ、頭皮を開き、頭蓋骨を通してポリマーの進行を視覚的に監視する。 |
| ダイヤフラム | 左心室 | 内胸部、胸膜、肋間への前向き | 0.05ml/分 | 胸部の側面に窓を開け、胸部と横隔膜の大部分はそのまま残します。 左心房、右心房をクリップし、ダイヤフラムの尾側からの進捗状況を監視します。 |
| 上肢筋肉 | 胸部大オルタが目を見つめ | 腕頭症および左鎖骨に逆行する | 0.02ml/分 | 四肢の流れを最適化するには、頸動脈を縛り、四肢の皮膚を取り除き、手足の筋肉へのポリマートランジットの視覚的な監視を可能にします。 |
| 腎臓 | 胸部大オルタは、寄り道を指しています | 腎動脈への前ログレード | 0.05ml/分 | 内部血管系は盲目的に満たされる。 静脈通過を避けるために、ポリマーが腎臓全体で均一な穿刺パターンで見えるときに注入を停止する。 |
| ポータルシステム | 門脈 | ポータルシステムに順次 | 0.02ml/分 | 肝臓を軽く折り畳んで門脈を露出させる。 |
| 肝 | 胸部大オルタは、寄り道を指しています | 肝動脈への前向ログレード | 0.05ml/分 | 注入前に門脈を結び、肝臓に流れ込む腸からの静脈通過を避ける。 |
| 胃/腸 | 胸部大オルタは、寄り道を指しています | セリアック、優れた腸間膜および/または劣った腸間膜への前向き | 0.05ml/分 | 腸の一部の領域は、複数の動脈によって供給され、異なる時間に充填することができます. 静脈通過を避けるために、対象領域に必要ない動脈を縛り、ポリマーの進行を視覚的に監視します。 |
| 腹腔内脂肪パッド | 胸部大オルタは、寄り道を指しています | 前向きが、血管は研究されている脂肪パッドに依存します | 0.05ml/分 | 脂肪パッドは複数の動脈によって供給され、異なる時間に充填することができます. 静脈通過を避けるために、正確な対象領域に必要とされない動脈を縛り、ポリマーの進捗状況を視覚的に監視します。 |
| 下肢筋肉 | 直角に指す変色大オルタ | 大腿動脈への前向ログラード | 0.02ml/分 | 四肢の皮膚を取り除き、手足の筋肉へのポリマートランジットの視覚的な監視を可能にします。 |
表 1.代替血管のベッドを鋳造する。
| CT 設定 | |
| kVp | 90 |
| ターゲットマテリアル | タングステン |
| 電源 | 8W |
| ろ過 | Cu 0.06 mm + アル 0.5 mm |
| 投影番号 | 6424 |
| 検出器のサイズ | フラットパネル CMOS - 2944 x 2352 ピクセル |
| 視野 (FOV) | 36 mm |
| ボクセルサイズ | 72 μm |
| 空間解像度 | ボクセルサイズ x 1.5 |
| 取得時間 | 14分 |
| 復興 | FBPと商用アルゴリズム |
| ビニング | 1x1 |
表 2.μCT スキャンパラメータ。
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Discussion
適切に実行され、この方法は、げっ歯類モデルの比較と実験を可能にする肺動脈ネットワークの印象的な画像を生成します。いくつかの重要なステップは、成功を保証します。まず、研究者は、肺血管系および心臓のチャンバーに血栓が形成されるのを防ぐために、準備段階で動物をヘパリン化する必要があります。これはポリマー化合物の完全な動脈輸送を可能にする。第二に、横隔膜を穿刺し、胸部を取り除くとき、不注意な損傷、切り傷または損傷から肺を保護するように注意してください。気道の漏れは完全な膨張を防ぎ、不正確なサンプル間の比較をレンダリングします。第三に、頂点で心臓をテザリングはカテーテルの配置を助ける。第4に、SNPのような強い血管拡張剤の使用は、動脈および毛細血管5,5、8の血液の除去および完全な充填の両方を助ける。第五に、カテーテルをPATに入れる際には、先端を分岐に埋めないように注意してください。これにより、流れの不均衡が生じ、ポリマー化合物を左側または右側にシャントし、不均一な圧力勾配を生じる。第六に、シリンジポンプの使用は、ユーザーが速度を制御し、マウスの緊張と年齢の両方に音量を引き締めるのを可能にします。最後に、胸腔の残りの部分に取り付けられた心臓/肺を残し、一晩固定し、翌日を取り除きます。肺は十分に固定され、分離中の偶発的なニックによるデフレの可能性は最小限に抑えられます。
この方法論は望ましい結果を達成するが、代替技術は一部のユーザーにとって有用であるかもしれない。カテーテルの配置を助けるために、マイクロマニピュレータが採用されてもよい。私たちは、安定したベースを提供しながら、すでに限られた作業領域の侵入を最小限に抑えるために、小さなプロファイルと磁気ベースを持つバージョンを選択しました(磁気ベースを使用する場合は、磁石が係合できるように作業スペースの下に鋼板を置くようにしてください)。これにより、ユーザは正確に動脈の自然な軌道に従う角度でPATにカテーテルの先端を配置することができます。さらに、カテーテルは安全であり、外れる危険性は低い。別のオプションは、トランペットカテーテルの先端8の使用である。作成するのは些細なことではありませんが、トランペットカテーテルははるかに安全で、誤ってPATから滑り出す傾向が低くなります。ターゲット血管系と実験エンドポイントに応じて、これは貴重な考慮事項になる可能性があります。CO2による安楽2死は、動物のごく一部で肺出血を引き起こす可能性があり、株依存性22である。実験エンドポイントに影響を与える代替安楽死プロトコルを検討してください。肺を膨らませると、ホルマリンの使用は所定の圧力で臓器の固定を助ける。周辺血管を未固定状態で充填する必要がある場合、生理的中性バッファーを置換することができます。輸液速度と制御が特定の実験にとって重要性が低い場合は、手による灌流も可能です。ハンド注入は、過充填または血管破裂8を避けるために、拡大率の下での練習とリアルタイム監視を必要とします。最後に、この論文に用いた組織の取り付け/条件、スキャンパラメータ、および最小限の後処理は、単なる出発点として機能する必要があります。異なるスキャナ、組織、実験的エンドポイント/ユーザーニーズは、代替パラメータを必要とするかもしれません。
この技術から生成される血管画像は印象的ですが、限界があります。主として、上記の方法は、注入時の血管内圧を監視および制御することができないため、血管口径を測定するのに最適ではない。他のグループは、駆動圧力44,2323を監視することによって全身血管系におけるこれらの圧力懸念にいくらか対処することができましたが、そのような懸念は、圧力24の小さな変化と肺血管内圧を正確に測定および静的に制御することができない比較的薄い肺動脈壁のために肺側でさらに増幅されます。
この方法の第二の制限は、それが本当に生理学的条件またはタイムコースを必要とする研究におけるその有用性を制限する、死後、単一のタイムポイント実験のままであるということです。その他、CT肺血管造影(CTPA)やコントラスト強化μCT(CE-CT)などの生きた動物対策は、機能的および形態学的尺度の可能性を提供する。繰り返しスキャン/縦方向の研究だけでなく、心臓/肺周期の異なる点での測定は、10、25、26、27、28を探索することができます。10,25,26,27,28これらの方法は、心エコー検査に加えて、動脈口径を測定するために確実に使用することができる。しかし、CTPAおよび心エコー検査の両方の措置は、現在、近位血管系の評価に限定されている。心エコー図の場合、CTPAは分岐肺動脈口径の十分な計算を可能にする一方で、評価は肺幹に限定され、さらに1〜2オーダーの場合は、解決が制限されるが、血管構造7の遠位部分を隠す。放射線量は、特にマルチスキャン縦断研究29,30,30においてCTを使用する際に注意深く監視されるべきであるという懸念もある。これらのアプリケーションでは、μCT機器、スキャン時間、解析ソフトウェアは高価であり、専門的なスタッフのトレーニングが必要です。一部の施設の動物イメージングコア施設は、この負担を軽減する可能性があります。
この化合物の代替として、いくつかの基は軟組織除去31、32を伴う伝統的な腐食鋳造技術を32利用する。これらの方法は、この高分子化合物と同様の結果をもたらすが、最終的な生成物は脆く、潜在的なアーティファクト15に至る。さらに、軟部組織の除去は、将来の組織学33の可能性を排除する。もう一つの選択肢は、軟部組織をそのまま残し、軟部組織が「クリア」されるフォローアップステップを実行し、サンプルを実質的に透明な34,35,35にレンダリングすることです。組織のクリアリングは、サンプル内の深く見える能力をユーザーに与えますが、全体的には、同じ3Dビジュアライゼーションを提供できないため、μCTに劣ったままです。シリアル組織学的断面とアレイ断層撮影は、非常に高い解像度を提供する方法です。この手法は、エキサイティングな新しい可能性への扉を開きますが、作業負荷は指数関数的に高く、特に大きなコホート11、12,12に役立ちません。3D X線の神学は、μCTと伝統的な占星術、あるいはEM36、37、3837,38の両方を組み合わせた非破壊的なアプローチです。36μCTを利用して、日常的な組織学39に従う関心のある領域をグローバルに特定し、正確にスカウトすることで、より高いレベルの病理を見る必要があります。低解像度の造影剤(または場合によってはコントラストなし)を高分子化合物を血管系に置き換えることは、可能であれば両方の技術を高めるのに役立つ可能性がある。計算に多いもう一つの非破壊的アプローチは、コントラストを高める可能性があり、位相検索μCTイメージング4040,4141である。この方法は、コントラストが弱いか不可能なデータに使用される場合に有用である可能性があります42.しかし、この技術で用いられる高分子化合物は、この制限に苦しんでいない。つまり、位相検索は、ポリマー化合物が希釈される可能性がある場合、例えば遠位血管構造43において有用であり得る。最後に、ステテロロジーは、44年間の肺定量構造解析の標準となっています。これは、選択されたサンプルが十分に代表的であると仮定して3D推論を行うために組織の断面上のランダムで体系的なサンプリングを使用します。強力なツールですが、エラーやバイアスにつながる可能性があります。しかし、CTイメージングとステテロロジーを組み合わせることは、大きな約束を果たしています45.
概説された方法は比較的簡単で、トレーニングの成功率は>90%です。一度マスター, それは肺血管系の完全かつ信頼性の高い鋳造を可能にします.固定では、組織およびポリマーは、将来のスキャン、潜在的な組織学、またはEM46、47,47のために無期限に安定したままである。我々は、この技術が成人期を通じてP1と同じくらい若い動物に使用できることを示し、肺動脈を介して胚状の鋳造が手の届くところにあると信じている。この技術は、カテーテルの入り口点を単に変更し、適切なエンドポイントを決定することによって、事実上他の任意の血管床に適用できることに留意すべきである。
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Disclosures
著者は開示するものは何もない
Acknowledgments
この研究は、NHLBIイントラムラル研究プログラム(DIR HL-006247)によって部分的に支援されました。画像の取得と解析に関する指導を受け、NIHマウスイメージング施設に感謝申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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