Summary
Le but de cette technique est la visualisation ex vivo des réseaux artériels pulmonaires des souris postnatales et adultes précoces par l’inflation pulmonaire et l’injection d’un composé à base de polymère radio-opaque par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire. Les applications potentielles pour les tissus moulés sont également discutées.
Abstract
Les vaisseaux sanguins forment des réseaux complexes dans l’espace tridimensionnel. Par conséquent, il est difficile d’apprécier visuellement comment les réseaux vasculaires interagissent et se comportent en observant la surface d’un tissu. Cette méthode fournit un moyen de visualiser l’architecture vasculaire tridimensionnelle complexe du poumon.
Pour ce faire, un cathéter est inséré dans l’artère pulmonaire et la vascularisation est simultanément rincée de sang et chimiquement dilatée pour limiter la résistance. Les poumons sont ensuite gonflés par la trachée à une pression standard et le composé polymère est infusé dans le lit vasculaire à un débit standard. Une fois que l’ensemble du réseau artériel est rempli et autorisé à guérir, la vascularisation pulmonaire peut être visualisée directement ou image sur un scanner micro-CT (μCT).
Lorsqu’on les effectue avec succès, on peut apprécier le réseau artériel pulmonaire chez des souris allant de l’âge postnatal précoce aux adultes. En outre, bien que démontré dans le lit artériel pulmonaire, cette méthode peut être appliquée à n’importe quel lit vasculaire avec le placement optimisé de cathéter et les extrémités.
Introduction
L’objectif de cette technique est la visualisation de l’architecture artérielle pulmonaire à l’aide d’un composé à base de polymère chez la souris. Tandis que des travaux étendus ont été exécutés sur les lits vasculaires systémiques tels que le cerveau, le coeur, et le rein1,2,3,4,,5, moins d’information est disponible concernant la préparation et le remplissage du réseau artériel pulmonaire. Le but de cette étude, par conséquent, est d’élargir les travaux précédents6,7,8 et de fournir une référence écrite et visuelle détaillée que les chercheurs peuvent facilement suivre pour produire des images à haute résolution de l’arbre artériel pulmonaire.
Bien qu’il existe de nombreuses méthodes d’étiquetage et d’imagerie de la vascularisation pulmonaire, telles que l’imagerie par résonance magnétique, l’échocardiographie ou l’angiographiect 9,,10,bon nombre de ces modalités ne remplissent pas adéquatement et/ou capturent les petits vaisseaux, limitant ainsi la portée de ce qui peut être étudié. Les méthodes telles que le sectionnage en série et la reconstruction fournissent une haute résolution, mais sont temps / travail intensif11,12,13. L’intégrité des tissus mous environnants est compromise dans le moulage traditionnel de corrosion10,13,14,15,16. Même l’âge et la taille de l’animal deviennent des facteurs lors de la tentative d’introduire un cathéter ou, la résolution fait défaut. La technique d’injection de polymère, d’autre part, remplit les artères au niveau capillaire et lorsqu’elle est combinée avec μCT, permet une résolution inégalée5. Des échantillons de poumons de souris aussi jeunes que le jour postnatal 14 ont été lancés avec succès8 et traités en quelques heures. Ceux-ci peuvent être rescanned indéfiniment, ou même envoyé pour la préparation histologique / microscopie électronique (EM) sans compromettre le tissu mou existant17. Les principales limites à cette méthode sont le coût initial de l’équipement/logiciel de CT, les défis avec la surveillance précise de la pression intravasculaire, et l’incapacité d’acquérir des données longitudinalement dans le même animal.
Cet article s’appuie sur les travaux existants pour optimiser davantage la technique d’injection d’artère pulmonaire et repousser les limites liées à l’âge/taille jusqu’au jour postnatal 1 (P1) pour produire des résultats frappants. Il est plus utile pour les équipes qui veulent étudier les réseaux vasculaires artériels. Par conséquent, nous fournissons de nouvelles directives pour le placement/stabilisation de cathéter, le contrôle accru sur le taux/volume de remplissage, et mettons en évidence les pièges notables pour le succès accru de coulée. Les moulages qui en résultent peuvent ensuite être utilisés pour la caractérisation future et l’analyse morphologique. Peut-être plus important encore, c’est la première démonstration visuelle, à notre connaissance, qui guide l’utilisateur à travers cette procédure complexe.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national des poumons et du sang cardiaques.
1. Préparation
- Injectez la souris intraperitoneally avec de l’héparine (1 unité/g de poids corporel de la souris) et laissez-la s’ambriculer pendant 2 min.
- Euthanasier l’animal dans une chambre CO2.
- Disposer la souris en position supination sur une planche chirurgicale et fixer les quatre membres à la planche avec du ruban adhésif. Utilisez le grossissement pour la dissection fine.
2. Exposer les poumons et la trachée
- Vaporiser le côté ventral de la souris avec 70% d’éthanol pour minimiser les interférences capillaires.
- Saisissez la peau abdominale avec des forceps et faites une petite incision avec des ciseaux dans la région ombilicale. Faites glisser les pointes des ciseaux dans la couche fasciale entre la musculature abdominale et la peau et commencer à séparer les deux couches. Travailler rostrally, enlever la peau de l’abdomen, la cage thoracique, et le cou.
- Ouvrir la musculature abdominale avec des ciseaux et couper ultérieurement des deux côtés jusqu’à ce que le diaphragme soit exposé.
- Saisissez doucement le processus xiphoide et soulevez légèrement la cage thoracique en maximisant la vue des poumons caudal à travers le diaphragme mince et semi-transparent. Faites soigneusement une petite incision dans le diaphragme juste en dessous du processus xiphoide. Les poumons s’effondrent et se rétractent du diaphragme. Disséquer le diaphragme loin de la cage thoracique, en prenant soin de ne pas entailler le parenchyme pulmonaire.
- Localiser et couper le vena cava inférieur (IVC) et l’œsophage où ils passent à travers le diaphragme. Utilisez de la gaze pour nettoyer tout sang de mise en commun dans la cavité thoracique, en évitant le contact avec les poumons.
- Saisissez le xiphoide une fois de plus et soulevez doucement. Couper la cage thoracique bilatéralement (à peu près à la ligne midaxillaire) en évitant le contact avec les poumons. Retirer complètement la cage thoracique antérieure, en faisant la coupe finale le long de l’angle sternal juste avant le manubrium.
- À l’aide d’une seringue préremplie, mouiller généreusement les poumons à l’aide d’une solution saline tamponnée par le phosphate (PBS, pH 7.4) pour éviter le dessèchement. Continuez cette routine tout au long de la procédure.
- À l’aide de forceps, saisissez le manubrium et soulevez doucement loin du corps. À l’aide de ciseaux, couper 1-2 mm latéralement au manubrium, couper les clavicules et enlever. Cela exposera le thymus en dessous.
- Saisissez chaque lobe du thymus, séparez-les et retirez-les. Répétez cette procédure avec la glande submandibulaire. Enfin, enlever le tissu musculaire superposant la trachée.
REMARQUE : Après la dissection, le coeur, l’aorte ascendante (AA), le tronc artériel pulmonaire (PAT), et la trachée devraient être visibles. Assurez-vous que les branches artérielles primaires du tronc ne sont pas divisées ou blessées.
3. Cathétérisme pa et perfusion sanguine
- Pour assembler l’unité 1, enfiler 15 cm de tubes PE-10 sur le moyeu d’une aiguille de 30 G et attacher à une seringue de 1 mL préremplie de 10à 4 M de nitroprusside de sodium (SNP) en PBS. Amorcer le tube en avançant le piston jusqu’à ce que tout l’air soit purgé de cette unité ( figure 1).
ATTENTION: SNP est toxique s’il est avalé. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Laver soigneusement la peau après manipulation. Portez l’équipement de protection individuelle approprié.- Alternativement, assemblez l’unité 2. Pour les souris postnatales 7 (P7) et plus jeunes, utilisez un hémostat pour détacher une aiguille supplémentaire de 30 G de son moyeu et enfiler l’aiguille sur l’extrémité ouverte du tube de l’unité 1 (figure 1).
- Au lieu d’une aiguille, utilisez des forceps tranchants incurvés pour saisir une extrémité d’une longueur de 10 cm de soie de 7-0. Pénétrer l’apex du cœur entrant d’un côté et en passant les extrémités des forceps à travers le muscle et de l’autre côté. Saisissez la soie avec un autre ensemble de forceps et tirez environ 2 cm de longueur à travers et attachez-vous. Prenez l’extrémité restante de 8 cm de la suture, tirant le cœur caudalement, et bande la fin de la planche chirurgicale.
REMARQUE : Cela créera de la tension, exposant davantage les grands vaisseaux et attachant le cœur en place, permettant un placement plus facile du cathéter dans l’artère pulmonaire. - Accrochez les extrémités des forceps incurvées sous les AA et PAT. Tirez une longueur de 3 cm de soie de 7-0 en arrière à travers l’ouverture et de créer une suture lâche d’un seul lancer.
- À l’aide de ciseaux, faire une incision de 1 à 2 mm vers l’apex du cœur, en pénétrant le ventricule droit à parois minces (RV), pour permettre l’insertion du cathéter (unité 1). Avant l’insertion, confirmez qu’il n’y a pas d’air dans le système. Introduisez le tube amorçage dans le ventricule droit et avancez doucement dans le PAT semi-transparent à parois minces.
- Vérifiez visuellement que le cathéter n’a pas avancé dans les branches pulmonaires gauches ou droites et n’empêche pas le point de branchement de l’artère pulmonaire. À l’aide de ruban adhésif, fixer la partie distale du tube à la planche chirurgicale.
REMARQUE : Pour identifier le VR, utilisez des forceps pour pincer le côté droit du cœur. Contrairement au ventricule gauche, la paroi libre relativement mince du RV doit être facilement saisie. - Pour les souris plus jeunes que P7, attachez l’unité 2 à un micromanipulateur et introduisez l’extrémité de l’aiguille de l’unité dans le PAT tel que décrit ci-dessus à l’aide du manipulateur.
- Vérifiez visuellement que le cathéter n’a pas avancé dans les branches pulmonaires gauches ou droites et n’empêche pas le point de branchement de l’artère pulmonaire. À l’aide de ruban adhésif, fixer la partie distale du tube à la planche chirurgicale.
- Serrez doucement la suture lâche autour des deux grands vaisseaux et coupez la longueur de 8 cm de suture créée à l’étape 3.2 pour ramener le cœur à une position de repos naturelle. Le cathéter est maintenant solidement fixé dans le PAT.
- Clip l’auricule gauche du cœur pour permettre perfusate de sortir du système.
- Sécurisez la seringue contenant du SNP (unité 1 ou unité 2, de taille dépendante) dans la pompe à seringues et perfusez la solution à une vitesse de 0,05 mL/min pour rincer le sang et dilater au maximum la vascularisation. Le sang/perfusate sortira par l’auricule coupé. Continuer la perfusion jusqu’à ce que le perfusate s’éclaircit (~200 μL chez une souris adulte, moins pour les animaux plus jeunes).
REMARQUE : Lorsqu’on persussait la faible viscosité PBS/SNP, un taux d’infusion relativement plus élevé a été utilisé dans l’intérêt de gagner du temps. Le composé polymère plus visqueux est infusé à un rythme plus lent pour empêcher le remplissage excessif, la rupture et de maximiser le contrôle sur les points de terminaison distal.
4. Trachéostomie et inflation pulmonaire
- Construire l’unité d’inflation pulmonaire (figure 2).
- Connectez un cathéter intraveineux flexible de 24 G (IV) en plastique (aiguille enlevée)/infusion de papillon réglé sur un robinet d’arrêt, fixé à une seringue ouverte de 50 mL (pas de piston). Accrochez la seringue à un support d’anneau.
- Ajouter 10 % de formaline tamponnée à la seringue. Ouvrez le robinet d’arrêt, permettant à la formaline d’entrer dans le tube et de purger tout l’air du système. Fermez le robinet d’arrêt et soulevez la seringue jusqu’à ce que le ménisque soit de 20 cm au-dessus de la trachée8.
ATTENTION : La formaline est inflammable, cancérigène, extrêmement toxique lorsqu’elle est ingérée, et provoque une irritation de la peau, de graves lésions oculaires, une sensibilisation de la peau et une mutagénicité des cellules germinales. Évitez l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux. Évitez l’inhalation de la vapeur ou de la brume. Éloignez-vous des sources d’inflammation. Portez l’équipement de protection individuelle approprié.
- Placer deux sutures lâches inférieures au cartilage cricoide de 2 à 4 mm l’une de l’autre.
- À l’aide de ciseaux, faire une petite incision dans le ligament de la cricothyroïdie supérieur aux sutures.
- Insérez le cathéter IV dans l’ouverture et avancez la pointe au-delà des deux sutures lâches.
- Serrer les sutures autour de la trachée et ouvrir le robinet. Laissez la formaline pénétrer dans les poumons par gravité et attendez 5 min que les poumons se gonflent complètement. Si les poumons adhèrent à la cage thoracique pendant l’inflation, saisissez l’extérieur de la cage thoracique avec des forceps à pointe émoussée et déplacez-vous dans toutes les directions pour aider à libérer les lobes. Ne pas entrer en contact direct avec les poumons.
- Après 5 min, reculez le cathéter IV au-delà de la première suture et de la l torture. Répétez la deuxième suture. Les poumons sont maintenant gonflés dans un état fermé et sous pression.
5. Coulée de la vasculature
- Dans un tube de 1,5 mL, préparer 1 ml d’une solution 8:1:1de polymère:diluent:agent de traitement et inverser doucement plusieurs fois pour assurer un bon mélange.
- Retirer le piston d’une seringue de 1 cc, couvrir l’extrémité opposée d’un doigt ganté et verser le composé polymère dans la seringue. Réinsérer soigneusement le piston, inverser et faire avancer le piston pour enlever tout l’air et former un ménisque à l’extrémité de la seringue.
- Retirez la seringue SNP/PBS du moyeu de l’aiguille et égouttez des PBS supplémentaires dans le moyeu pour créer un ménisque. Vérifiez soigneusement le moyeu pour l’air emprisonné, déloger si nécessaire, et réformer le ménisque. Joignez le moyeu à la seringue remplie du composé polymère.
REMARQUE : La création d’un ménisque aux deux extrémités réduit considérablement les chances d’entrée de l’air dans le système. - Attachez la seringue remplie de composés polymères à la pompe à seringues et infuser à 0,02 mL/min.
REMARQUE : Pour les poumons plus petits, un taux plus lent peut être utile pour prévenir le suremplissage, mais n’est pas essentiel. - Surveiller le composé pendant qu’il se déplace librement vers le bas du tube pe et noter le volume de la seringue comme il entre dans le PAT. Continuer à remplir jusqu’à ce que tous les lobes sont remplis complètement jusqu’au niveau capillaire et arrêter la pompe à seringues. Vérifiez à nouveau le volume de la seringue.
REMARQUE : Après plusieurs courses, un volume estimé peut être utilisé pour évaluer un point d’évaluation approximatif (~35 μL pour une souris adulte et ~5 μL pour un chiot P1). Une fois la pompe arrêtée, la pression résiduelle du système continuera à pousser le composé polymère dans les artères pulmonaires. Tous les lobes pulmonaires doivent se remplir à un rythme similaire. - Couvrir les poumons d’un linge de nettoyage à fibre optique, appliquer généreusement pbs et laisser la carcasse s’asseoir sans être dérangée pendant 30 à 40 min à température ambiante. Pendant cette période, le composé polymère guérira et durcira.
- Retirez le cathéter, coupez les bras/moitié inférieure de la souris, et placez la tête/thorax dans un conique de 50 mL rempli de formaline tamponnée de 10% pendant la nuit.
- Après fixation, saisissez la trachée et séparez doucement l’unité cardiaque/poumon de la cage thoracique et du thorax restants. Placez le bloc coeur/poumon dans un flacon de scintillation rempli de formaline. Jetez le reste.
6. Lits vasculaires alternatifs pour la coulée (tableau 1)
REMARQUE : Chaque lit vasculaire cible peut nécessiter des placements différents de cathéter, des taux de perfusion et des temps de remplissage optimaux. Ainsi, plusieurs animaux seront nécessaires pour lancer plusieurs organes.
- Pour les lits vasculaires systémiques supérieurs ou inférieurs au diaphragme suivre les étapes 1.1-2.5 comme ci-dessus. Voir des notes supplémentaires sur le système de portail et le diaphragme (Tableau 1).
- Saisissez le processus xiphoide avec un hémostat et coupez la cage thoracique bilatéralement (approximativement dans la ligne midaxillaire) juste avant les artères thoraciques internes.
- Pliez la cage thoracique encore reliée au-dessus de telle sorte qu’elle repose sur le cou/tête de l’animal, exposant entièrement la cavité thoracique.
- Suivez l’étape 3.1 ci-dessus, puis retirez les poumons. Une fois que l’aorte thoracique (TA) est visible, accrochez les extrémités des forceps courbes en dessous, ~10 mm supérieures au diaphragme. Saisissez une longueur de 3 cm de soie de 7-0, tirez à travers l’ouverture sous le TA, et créez une suture lâche d’un seul jet. Répétez cette procédure ~8 mm au-dessus du diaphragme.
- Pour les structures supérieures au diaphragme, utilisez des ciseaux à ressort pour créer un petit trou (~30% de la circonférence totale) sur la partie ventrale du TA, ~2 mm inférieur aux sutures lâches placées à l’étape 6.4.
- Pour les structures inférieures au diaphragme, créez plutôt un petit trou ~2 mm supérieur aux sutures lâches.
- Selon la taille de l’animal, introduire l’unité 1 ou 2 dans le navire, avancer au-delà des sutures lâches et ligote doucement le navire.
- Suivez l’étape 3.7, en fixant la pompe à seringues à une vitesse de 1,0 mL/min et en perfusant un minimum de 5 mL. Perfusate sortira par l’IVC.
- Suivez les étapes 5.1 - 5.4 en ajustant le taux de perfusion à 0,05 mL/min, en surveillant visuellement le tissu cible en temps réel.
REMARQUE : Le volume d’infusion sera spécifique à l’organe et à l’âge animal. Le volume peut être encore limité par ligature des branches artérielles menant à des lits vasculaires non ciblés (c.-à-d. cerveau, foie, rein, intestin). - Suivez 5.6 puis retirez le tissu cible et placez-le dans la formaline.
7. Montage, balayage et reconstruction d’échantillons pour micro-CT
- À l’aide d’un film de paraffine, créez une surface plane sur le lit de balayage et centrez l’échantillon humide sur cette surface (Figure 3A).
REMARQUE : Si l’artefact de mouvement est détecté, l’échantillon peut nécessiter une stabilisation supplémentaire. - Échantillon légèrement tente/couverture avec pellicule de paraffine supplémentaire pour prévenir la déshydratation. Prenez un soin particulier de ne pas reposer le film de paraffine sur l’échantillon causant la déformation du tissu (Figure 3B).
- Numérisez l’exemple à l’aide des paramètres décrits dans le tableau 2 et standardisez ces paramètres au sein d’une expérience donnée.
REMARQUE : Il s’agit d’une expérience ou d’un point de terminaison dépendant. Standardisez les paramètres choisis pour faciliter la comparaison entre les échantillons. - Transférez les scans reconstruits pour le post-traitement et l’analyse.
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Representative Results
Un casting réussi présentera un remplissage uniforme de l’ensemble du réseau artériel pulmonaire. Nous le démontrons chez les souris C57Bl/6J dont l’âge est le cas : jour postnatal P90 (figure 4A),P30 (figure 4B), P7 (figure 4C)et P1 (figure 4D). En contrôlant le débit et en surveillant visuellement le remplissage en temps réel, des critères d’évaluation fiables des vasculatures les plus distales ont été atteints (figure 5A).
Les défis communs incluent des dommages aux poumons, le remplissage incomplet, le remplissage sous-remplissage, ou le remplissage excessif, le wedging du cathéter, et la taille d’animal.
S’il y a des dommages aux voies pulmonaires/aériennes, de petites fuites empêcheront les poumons de maintenir la pression (figure 5B,C). En l’absence d’inflation totale, il devient difficile de faire des comparaisons quantitatives et spatiales précises entre les échantillons. Pour minimiser le risque pour le parenchyme pulmonaire, évitez de couper trop près des poumons lors de l’enlèvement de la cage thoracique et de garder les poumons humides avec PBS tout au long de la procédure pour éviter la déshydratation et l’adhérence aux structures environnantes. Si un lobe adhère à la cage thoracique pendant l’inflation, saisissez doucement l’extérieur de la cage thoracique (loin du poumon) avec des forceps et déplacez-le dans une direction pour libérer les lobes. Alternativement, un instrument émoussé, tel qu’une spatule, avec un bord lisse peut être utilisé pour soulever ou pousser le poumon gonflé loin de la cage thoracique. Lors du gonflage des poumons, respectez les paramètres de pression suggérés et évitez la sur-inflation, car cela peut entraîner une rupture des voies respiratoires. Enfin, n’enlevez pas les poumons de la cavité thoracique jusqu’à ce que la post-fixation soit terminée. La trachée, les poumons et le cœur doivent être retirés en bloc des parties restantes de la cavité thoracique.
Le remplissage inégal (figure 5D) ou incomplète (figure 5E) peut résulter d’un « sas », dans lequel l’air est introduit dans le système vasculaire par l’intermédiaire du cathéter, bloquant le flux en aval du composé. Pour réduire au minimum le risque d’un sas, purger avec vigilance l’air de l’extrémité du cathéter avant l’insertion (étape 3.4) et pendant la transition de la seringue du SNP/PBS au composé polymère. Si la pouliche reste inégale ou incomplète, elle pourrait être une indication d’une résistance vasculaire accrue en raison de la sténose focale/long segment ou de la tortuasité. Les caillots sanguins peuvent également conduire à un remplissage incomplet et sont facilement évités en utilisant l’héparine avant la procédure.
Un volume d’injection inadéquat entraînera un sous-remplissage ou un remplissage excessif. Le sous-remplissage se produit lorsque trop peu de composé est introduit dans la vascularisation (figure 5F). Alternativement, le remplissage excessif ou l’introduction trop rapide de composés polymères peuvent causer soit une rupture artérielle (figure 5G)soit, plus généralement, le transit veineux (figure 5H). Les deux problèmes peuvent être atténués à l’aide d’une pompe à seringues. Les enquêteurs doivent respecter attentivement les restrictions proposées en fonction des tarifs et du volume ou établir leurs propres tarifs en fonction de leur modèle et de leur optimisation spécifiques. La surveillance de la perfusion composée de polymère en temps réel sous grossissement est essentielle, et le remplissage des petits artérioles/capillaires doit être utilisé comme point de terminaison.
L’avancement du cathéter trop loin dans le tronc pulmonaire peut causer la pointe de coin dans une branche de l’artère pulmonaire et de créer un déséquilibre dans le flux. En conséquence, un côté se remplit plus rapidement que l’autre (figure 5I), ce qui conduit souvent à surfiser dans un poumon et sous-remplir dans l’autre. Bien que le mariage des cathéters soit la raison la plus probable dans ce scénario, le « sas » et le manque d’héparine peuvent également être des facteurs contributifs.
Enfin, les petits animaux présentent leur propre ensemble d’obstacles supplémentaires. Les animaux plus jeunes exigent des mains stables et les petites erreurs sont moins indulgentes. Les instruments de haute qualité, spécialement conçus pour la microchirurgie, deviennent plus importants aux premiers délais postnatals. L’utilisation d’un micromanipulateur aide grandement non seulement dans le placement, mais la prévention de la dislocation du cathéter. Il est également essentiel d’utiliser la pompe à seringues sur les petits animaux pour contrôler et gérer avec précision les points de terminaison.
Bien que spécifiquement montré pour la vascularisation pulmonaire, cette procédure peut facilement être appliquée aux lits vasculaires cibles systémiques ainsi (tableau 1). En plus des défis énumérés ci-dessus, le choix du bon point d’entrée est crucial. Le moulage par l’intermédiaire de l’aorte thoracique produit d’excellents résultats pour la plupart des lits vasculaires. Il convient toutefois de noter que l’insertion du cathéter aussi proximale que possible au site cible et le ligature non ciblée aide à contrôler le débit et le volume. Ces améliorations combinées à une surveillance directe appropriée des critères d’évaluation vasculaires distales (figure 6A-F) et des taux d’infusion standard optimisent le remplissage. De nombreux exemples de telles méthodes de casting existent dans la littérature et sont trop nombreux pour le référencement complet. Toutefois, des détails supplémentaires peuvent être trouvés dans le texte spécifique de l’organe tels que ces4,5,7,18,19,20,21.
Après la coulée, les échantillons peuvent être traités pour l’analyse μCT (figure 7A,B). Pour le post-traitement, un logiciel commercial (voir Tableau des matériaux)a produit un rendu en volume 3D de l’arbre vasculaire pulmonaire présenté sous forme d’images fixes (figure 7C),ou de films. D’autres analyses statistiques explorant les caractéristiques vasculaires telles que la longueur et le nombre de segments, la tortorosité, l’ordre (génération ou rang), le volume et la longueur des arcades peuvent également être effectuées. En plus de la numérisation μCT, les échantillons coulés peuvent également être effacés pour obtenir des images brutes ou traités et coupés pour l’analyse histologique8.
Figure 1: Configuration du cathéter et de l’aiguille. Les seringues sont représentées avec des tubes et des aiguilles attachés (Unit1 et Unit2). Encart : plan rapproché de l’aiguille et des tubes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Configuration de l’inflation pulmonaire. Support d’anneau, pince, une seringue remplie de formaline, et tube avec un cathéter attaché. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Pré-balayage de l’échantillon de micro-CT. (A) Ici, le spécimen était centré sur une base de film de paraffine, (B) Ici, l’échantillon était centré et couvert sur la base du parafilm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Poumons à fonte vasculaire à différents stades de développement de 3 mois à 1 jour. Vue dorsale des poumons, (A) P90, (B) P30, (C) P7, et (D) P1 Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Exemples de remplissage idéal et d’erreurs courantes lors de l’infusion de composés polymères. (A) Lorsque le point d’évaluation du remplissage a été atteint, un réseau vasculaire robuste et fin a été observé. (B) Les poumons perfusés de formaline entièrement gonflés sont représentés par une ligne blanche en pointillés, (C) Les poumons sous-gonflés/dégonflés sont montrés. Ceci a été observé en raison d’une voie aérienne pulmonaire compromise. La position gonflée d’origine est représentée par une ligne en pointillés blanc et la position dégonflée est représentée par une ligne pointillée noire, (D) remplissage inégal: la vascularisation des parties du lobe reste non remplie tandis que d’autres zones ont été entièrement remplies, (E) Remplissage incomplet : le composé polymère n’a pas réussi à pénétrer des sections entières du poumon, (F) Sous-remplissage : le composé polymère n’a pas réussi à remplir la vasculature distale, (G) Rupture : la flèche pointe vers le composé polymère extrudé de la vasculature, (H) Remplissage veineux : notez la flèche pointant vers les segments artériels entièrement remplis et s’étendant dans le système veineux. Les veines et les veines étaient de calibre significativement plus grand, (I) coin de cathéter : Ici le cathéter a été shunted dans une artère empêchant la vascularisation des lobes droits de remplir complètement tandis que le lobe gauche était surchargé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6. Coulée vasculaire et extrémités dans des organes supplémentaires. (A) Rein : l’aspect punctate du composé polymère dans le glomerulus a fourni le point d’évaluation. (B) Foie : noter les petits vaisseaux visibles aux bords de l’organe. (C) Estomac : les petits vaisseaux étaient visibles et entièrement remplis. (D) Gros intestin : Les petits vaisseaux sont facilement identifiables et remplis. (E) Diaphragme: le muscle ici est mince et translucide avec de petits vaisseaux remplis apparentes. (F). Cerveau : de petits vaisseaux étaient visibles dans le cortex. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7. Images ct et rendu de volume 3D des poumons remplis de composés polymères. (A) Une seule tranche de poumon reconstruite à l’échelle grise, (B) Il s’agissait d’une projection d’intensité maximale d’une tomodensitométrie produite à partir de poumons remplis de polymères, (C) Un rendu de volume 3D de l’arcade vasculaire a été généré à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Lit vasculaire artériel cible | Placement de cathéter | Direction de perfusion | Taux d’infusion | Notes |
| Cerveau | Aorte thoracique pointant cranialement | Rétrograder dans les carotides | .05ml/min | Aorte thoracique cannulate, retourner la souris à la position couchée, ouvrir le cuir chevelu, et surveiller visuellement la progression du polymère à travers le crâne. |
| Diaphragme | Ventrical gauche | Anterograde en thoracique interne, phrénique et intercostal | .05ml/min | Ouvrez une fenêtre sur le côté de la cage thoracique, en laissant intacte la majorité de la cage thoracique et du diaphragme. Cannuler ventrical gauche, clip atrium droit, et surveiller la progression du côté caudal du diaphragme. |
| Musculature des membres supérieurs | Aorte thoracique pointant cranialement | Rétrograde dans le brachiocephalic et subclavian gauche | .02ml/min | Pour optimiser le débit des membres, attachez les artères carotides et retirez la peau des membres pour permettre une surveillance visuelle du transit polymère dans la musculature des membres. |
| Rein | Aorte thoracique pointant caudally | Antérograde dans les artères rénales | .05ml/min | La vascularisation interne est remplie aveuglément. Pour éviter le transit veineux, arrêtez de vous injecter lorsque le polymère est visible dans un motif de punctate uniforme sur les reins. |
| Système de portail | Veine de portail | Anterograde dans le système de portail | .02ml/min | Pliez doucement le foie pour exposer la veine du portail. |
| Hépatique | Aorte thoracique pointant caudally | Anterograde dans l’artère hépatique | .05ml/min | Attachez la veine du portail avant l’infusion pour éviter le transit veineux de l’intestin qui coule dans le foie. |
| Estomac/ Intestin | Aorte thoracique pointant caudally | Antérograde dans le mésentérique, mésentérique supérieur et/ou inférieur | .05ml/min | Certaines régions de l’intestin sont fournies par plusieurs artères et peuvent se remplir à des moments différents. Pour éviter le transit veineux, attachez les artères qui ne sont pas nécessaires pour les zones d’intérêt et surveillez visuellement la progression du polymère. |
| Coussinets de graisse intra-abdominaux | Aorte thoracique pointant caudally | Antérograde mais navire dépend de la graisse tampon à l’étude | .05ml/min | Les coussinets de graisse sont fournis par plusieurs artères et peuvent se remplir à des moments différents. Pour éviter le transit veineux, attachez les artères non nécessaires pour une zone d’intérêt précise et surveillez visuellement la progression du polymère. |
| Musculature des membres inférieurs | Aorta infrarénale pointant caudally | Anterograde dans les artères fémorales | .02ml/min | Enlever la peau des membres pour permettre une surveillance visuelle du transit polymère dans la musculature des membres. |
Tableau 1. Coulée lits vasculaires alternatifs.
| Paramètres CT | |
| Kvp | 90 |
| Matériel cible | Tungstène |
| Pouvoir | 8w |
| Filtration | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Numéro de projection | 6424 |
| Taille du détecteur | Panneau plat CMOS - 2944 x 2352 pixels |
| Champ de vision (FOV) | 36 mm |
| Taille Voxel | 72 μm |
| Résolution spatiale | voxel taille x 1,5 |
| Temps d’acquisition | 14 min |
| Reconstruction | FBP et algorithme commercial |
| Binning | 1x1 |
Tableau 2. μCT Paramètres de numérisation.
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Discussion
Exécutée correctement, cette méthode donne des images saisissantes des réseaux artériels pulmonaires, permettant la comparaison et l’expérimentation dans les modèles de rongeurs. Plusieurs étapes critiques en cours de route assurent le succès. Tout d’abord, les chercheurs doivent hépariniser l’animal dans l’étape préparatoire pour empêcher les caillots sanguins de se former dans la vascularisation pulmonaire et les chambres du cœur. Cela permet le transit artériel complet du composé polymère. Deuxièmement, lorsque vous percez le diaphragme et enlevez la cage thoracique, prenez soin de protéger les poumons contre les dommages involontaires, les coupures ou les blessures. Toute fuite dans les voies respiratoires permettra d’éviter une inflation totale et de rendre les comparaisons entre les échantillons inexactes. Troisièmement, attacher le cœur à l’apex aide le placement du cathéter. Quatrièmement, l’utilisation d’un vasodilatateur fort tel que le SNP aidera à la fois à l’enlèvement du sang et au remplissage complet des artérioles et des capillaires5,8. Cinquièmement, lorsque vous placez le cathéter dans le PAT, prenez soin de ne pas enterrer la pointe dans la bifurcation. Cela provoquera un déséquilibre dans le débit, shunting composé polymère à gauche ou à droite, produisant un gradient de pression inégale. Sixièmement, l’utilisation d’une pompe à seringues permettra à l’utilisateur de contrôler la vitesse et de réduire le volume à la fois à la souche de souris et à l’âge. Enfin, laissez le cœur/poumons attaché au reste de la cavité thoracique, fixez-vous pendant la nuit et retirez le lendemain. Les poumons seront bien fixés et le risque de déflation dû à des entailles accidentelles pendant la séparation sera réduit au minimum.
Bien que cette méthodologie atteigne les résultats souhaités, d’autres techniques peuvent être utiles à certains utilisateurs. Pour faciliter le placement du cathéter, un micromanipulateur peut être utilisé. Nous avons choisi une version avec un petit profil et une base magnétique pour minimiser l’empiétement dans une zone de travail déjà limitée tout en fournissant une base stable (si l’utilisation d’une base magnétique assurez-vous de placer une plaque d’acier sous l’espace de travail pour permettre à l’aimant de s’engager). Cela permet à l’utilisateur de placer précisément la pointe du cathéter dans le PAT à un angle qui suit la trajectoire naturelle de l’artère. En outre, le cathéter est sécurisé et moins à risque d’être délogé. Une autre option est l’utilisation d’un tuyau de cathéter trompette8. Bien qu’il ne soit pas anodin à créer, un cathéter à trompette est beaucoup plus sûr et moins enclin à glisser accidentellement hors du PAT. Changer le rapport de polymère: diluant altère la viscosité et la facilité avec laquelle les petits vaisseaux sont remplis. Selon la vascularisation cible et les critères d’évaluation expérimentaux, cela peut être une considération précieuse. L’euthanasie par CO2 peut provoquer une hémorragie pulmonaire chez un petit pourcentage d’animaux et est dépendante de la souche22. Envisager un protocole d’euthanasie alternatif si cela a un impact sur les critères d’évaluation expérimentaux. Lors du gonflement des poumons, l’utilisation de la formaline facilite la fixation de l’organe en place à la pression donnée. Un tampon physiologiquement neutre peut être remplacé si les vaisseaux périphériques doivent être remplis dans un état non fixé. Si le taux d’infusion et le contrôle sont moins importants pour une expérience donnée, la perfusion à la main est également possible. L’injection de main nécessite une surveillance pratique et en temps réel sous grossissement pour éviter le remplissage excessif ou la rupture du navire8. Enfin, la montée/conditions tissulaires, les paramètres de numérisation et le peu de post-traitement que nous avons utilisé pour ce document devraient servir simplement de point de départ. Différents scanners, tissus, critères d’évaluation expérimentaux/besoins des utilisateurs peuvent exiger des paramètres alternatifs.
Bien que les images vasculaires générées par cette technique soient impressionnantes, il y a des limites. Principalement, la méthode ci-dessus est sous-optimale pour mesurer le calibre vasculaire en raison de l’incapacité de surveiller et de contrôler la pression intravasculaire pendant l’infusion. D’autres groupes ont réussi à aborder quelque peu ces préoccupations de pression dans la vascularisation systémique en surveillant la pression de conduite4,23, cependant, ces préoccupations sont encore amplifiées sur le côté pulmonaire en raison des parois relativement minces de l’artère pulmonaire qui sont facilement extensibles avec de petits changements dans les pressions24 et l’incapacité de mesurer avec précision et de contrôler statiquement la pression intravasculaire pulmonaire.
Une deuxième limite à cette méthode est qu’elle reste une expérience post mortem, point de temps unique, limitant son utilité dans les études qui nécessitent des conditions vraiment physiologiques ou un cours de temps. D’autres mesures animales vivantes, telles que l’angiographie pulmonaire de CT (CTPA) ou le μCT (CE-CT) amélioré par le contraste offrent la possibilité de mesures fonctionnelles et morphologiques. Scans répétés / études longitudinales ainsi que des mesures à différents points dans le cycle cardiaque / pulmonaire, peut être explorée10,25,26,27,28. Ces méthodes peuvent être utilisées de manière fiable, en plus de l’échocardiographie, pour mesurer le calibre artériel. Cependant, les mesures de CTPA et d’échocardiographie sont actuellement limitées à l’évaluation de la vasculature proximale. Pour l’échocardiogramme, l’évaluation est limitée au tronc pulmonaire tandis que ctpa permet un calcul adéquat du calibre de l’artère pulmonaire de branche potentiellement 1-2 ordres plus loin, mais la résolution est limitée, obscurcissant des parties distales de la vasculature7. La dose de rayonnement est également une préoccupation qui doit être soigneusement surveillée lors de l’utilisation de CT en particulier dans les études longitudinales multi-scan29,30. Pour l’une ou l’autre de ces applications, l’équipement μCT, le temps de numérisation et les logiciels d’analyse peuvent être coûteux et nécessiter une formation spécialisée du personnel. Les installations de base d’imagerie animale dans certaines institutions peuvent alléger ce fardeau.
Comme alternative à ce composé, certains groupes utilisent des techniques traditionnelles de coulée de corrosion accompagnées d’enlèvement des tissus mous31,32. Ces méthodes donnent des résultats similaires à ce composé polymère, mais le produit final est fragile, conduisant à l’artefact potentiel15. En outre, l’enlèvement des tissus mous élimine le potentiel d’histologie future33. Une autre option est de laisser le tissu mou intact et effectuer une étape de suivi dans la mesure dans la mesure où le tissu mou est « ér » rendant l’échantillon pratiquement transparent34,35. La compensation des tissus donne à l’utilisateur une certaine capacité de voir plus profondément dans un échantillon, mais, dans l’ensemble, reste inférieure à μCT car il ne peut pas fournir la même visualisation 3D. Les sections histologiques en série et la tomographie de tableau sont des méthodes qui offrent une résolution exceptionnellement élevée. Bien que cette technique ouvre la porte à de nouvelles possibilités passionnantes, la charge de travail est exponentiellement plus élevée et pas particulièrement propice aux grandes cohortes11,12. L’histologie 3D aux rayons X est une approche non destructive qui associe à la fois μCT et histologie traditionnelle ou même EM36,37,38. Il prend une vue de niveau plus élevé de la pathologie en utilisant μCT pour identifier globalement et repérer avec précision les régions d’intérêt qui sont ensuite suivies avec l’histologie de routine39. Le remplacement d’agents de contraste à résolution inférieure (ou, dans certains cas, aucun contraste) par un composé polymère dans la vascularisation pourrait servir à élever les deux techniques lorsque cela est possible. Une autre approche non destructive qui est intensive en calcul encore, améliore potentiellement le contraste, est phase-récupération μCT imagerie40,41. Cette méthode peut être utile lorsqu’elle est utilisée sur des données bruyantes où le contraste est faible ou pas possible42. Le composé polymère utilisé dans cette technique, cependant, ne souffre pas de cette limitation. Cela dit, la récupération de phase peut être utile lorsque le composé polymère est éventuellement dilué, par exemple dans la vasculature distale43. Enfin, la stéréologie est une norme dans l’analyse structurelle quantitative pulmonaire depuis des années44. Il utilise un échantillonnage aléatoire et systématique sur des sections transversales de tissus pour faire des inférences en 3-D en supposant que les échantillons choisis sont suffisamment représentatifs. Bien qu’il soit un outil puissant, il a le potentiel de conduire à l’erreur et à des biais. La combinaison de l’imagerie CT avec la stéréologie, cependant, est très prometteur45.
La méthode décrite est relativement simple et avec la formation un taux de réussite de >90% est réalisable. Une fois maîtrisé, il permet le moulage complet et fiable de la vascularisation pulmonaire. En fixatif, les tissus et les polymères restent stables indéfiniment pour les futurs scans, l’histologie potentielle, ou EM46,47. Nous avons montré que cette technique peut être utilisée chez des animaux aussi jeunes que P1 à l’âge adulte et nous croyons que le moulage embryonnaire, par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire, est à portée de main. Il convient de noter que cette technique peut être appliquée à pratiquement n’importe quel autre lit vasculaire en modifiant simplement le point d’entrée du cathéter et en déterminant les critères d’évaluation appropriés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Cette recherche a été appuyée en partie par le Programme de recherche intra-muros de la LNHBI (DIR HL-006247). Nous tenons à remercier le NIH Mouse Imaging Facility pour ses conseils en matière d’acquisition et d’analyse d’images.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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