Summary
Formålet med denne teknik er ex vivo visualisering af lungearteriale netværk af tidlige postnatal og voksne mus gennem lungeinflation og injektion af en radio-uigennemsigtig polymer-baseret forbindelse via lungearterien. Potentielle anvendelser for støbt væv er også drøftet.
Abstract
Blodkar danner indviklede netværk i 3-dimensionelle rum. Derfor er det vanskeligt visuelt at forstå, hvordan vaskulære netværk interagerer og opfører sig ved at observere overfladen af et væv. Denne metode giver et middel til at visualisere den komplekse 3-dimensionelle vaskulære arkitektur i lungen.
For at opnå dette indsættes et kateter i lungepulsåren, og vaskulaturen skylles samtidig af blod og forstørres kemisk for at begrænse resistens. Lungerne er derefter oppustet gennem luftrøret ved et standardtryk og polymerforbindelsen infunderes i den vaskulære seng ved en standard strømningshastighed. Når hele arterielt netværk er fyldt og lov til at helbrede, lunge vaskulaturen kan visualiseres direkte eller afbildet på en mikro-CT (μCT) scanner.
Når det udføres med succes, kan man sætte pris på lungearterie netværk i mus lige fra tidlige postnatal aldre til voksne. Derudover, mens demonstreret i lungearterie seng, denne metode kan anvendes på enhver vaskulær seng med optimeret kateter placering og slutpunkter.
Introduction
Fokus for denne teknik er visualisering af lungearterial arkitektur ved hjælp af en polymer-baseret forbindelse i mus. Mens omfattende arbejde er blevet udført på systemiske vaskulære senge såsom hjerne, hjerte og nyre1,2,3,4,5, mindre information er til rådighed om forberedelse og påfyldning af lungearterial netværk. Formålet med denne undersøgelse er derfor at uddybe tidligerearbejde 6,,7,8 oggive en detaljeret skriftlig og visuel reference, at efterforskerne nemt kan følge for at producere billeder i høj opløsning af lungearterietræet.
Mens der findes mange metoder til mærkning og billeddannelse lunge vaskulatur, såsom magnetisk resonans imaging, ekkokardiografi, eller CT angiografi9,10, mange af disse modaliteter undlader at tilstrækkeligt fylde og / eller fange de små fartøjer, begrænse omfanget af, hvad der kan studeres. Metoder som seriel sektionsopdeling og genopbygning giver høj opløsning , men er tids-/arbejdskrævende11,12,13. Omgivende bløddelsintegritet er kompromitteret i traditionel korrosionsstøbning10,13,14,15,16. Selv dyrs alder og størrelse bliver faktorer, når de forsøger at indføre et kateter eller, opløsningen mangler. Polymerindsprøjtningsteknikken fylder derimod arterierne til kapillærniveau, og når den kombineres med μCT, giver den mulighed for uovertruffen opløsning5. Prøver fra muselunger så unge som postnatal dag 14 er blevet støbt8 og behandlet i løbet af få timer. Disse kan scannes på ubestemt tid, eller endda sendes til histologisk forberedelse / elektronmikroskopi (EM) uden at gå på kompromis med den eksisterende bløde væv17. De vigtigste begrænsninger ved denne metode er de indledende omkostninger ved CT-udstyr/software, udfordringer med nøjagtig overvågning af intravaskulært tryk og manglende evne til at indsamle data i længderetningen hos det samme dyr.
Dette papir bygger på eksisterende arbejde for yderligere at optimere lungearterie injektion teknik og skubbe alder / størrelse relaterede grænser ned til postnatal dag 1 (P1) for at give slående resultater. Det er mest nyttigt for teams, der ønsker at studere arteriel vaskulære netværk. Derfor giver vi ny vejledning til kateterplacering/stabilisering, øget kontrol over påfyldningshastighed/volumen og fremhæver bemærkelsesværdige faldgruber for øget støbningssucces. Resulterende kaster kan derefter bruges til fremtidig karakterisering og morfologisk analyse. Måske endnu vigtigere, dette er den første visuelle demonstration, at vores viden, der fører brugeren gennem denne indviklede procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee (ACUC) af National Heart Lung and Blood Institute.
1. Forberedelse
- Injicer musen intraperitoneally med heparin (1 enhed/g mus kropsvægt) og lad den ambulate i 2 min.
- Aflive dyret i et CO2 kammer.
- Arranger musen i en liggende position på et kirurgisk bord og fastgør alle fire lemmer til brættet med tape. Brug forstørrelse til fin dissektion.
2. Udsætter lunger og luftrør
- Spray den ventrale side af musen med 70% ethanol for at minimere hår interferens.
- Tag fat i bughulen med snævler og lav et lille snit med en saks i navlestrengen. Skub spidsen af saks i fascial lag mellem abdominal muskulatur og hud og begynde at adskille de to lag. Arbejde rostrally, fjerne huden fra maven, brystkasse, og hals.
- Åbn bugmuskulaturen med en saks og skær side om side på begge sider, indtil mellemgulvet er udsat.
- Forsigtigt forstå xiphoid processen og lidt løfte brystkassen maksimere udsigten over hale lungerne gennem den tynde, halvgennemsigtige membran. Lav forsigtigt et lille snit i mellemgulvet lige under xiphoid processen. Lungerne vil kollapse og trække sig væk fra mellemgulvet. Dissekere mellemgulvet væk fra brystkassen, passe på ikke at nick lungen parenkym.
- Find og afskære ringere vena cava (IVC) og spiserøret, hvor de passerer gennem mellemgulvet. Brug gaze til at rense enhver pooling blod i brysthulen, undgå kontakt med lungerne.
- Tag fat i xiphoid igen og forsigtigt løft. Skær brystkassen bilateralt (ca. ved midterlinjen) for at undgå kontakt med lungerne. Fjern den forreste brystkasse helt, hvilket gør det endelige snit langs brystbenet vinkel lige før manubrium.
- Ved hjælp af en fyldt sprøjte, liberalt våd lungerne med fosfat-buffer salt (PBS, pH 7.4) for at forhindre udtørring. Fortsæt denne rutine under hele proceduren.
- Brug scener, forstå manubrium og forsigtigt ophøje væk fra kroppen. Brug saks, skæres 1-2 mm lateral til manubrium, afskære kraveben, og fjern. Dette vil udsætte thymus nedenunder.
- Tag fat i hver lap af thymus, trække fra hinanden, og fjerne. Gentag denne procedure med submandibulære kirtel. Endelig fjerne muskelvæv overlejring af luftrøret.
BEMÆRK: Efter dissektion, hjertet, stigende aorta (AA), pulmonal arteriel kuffert (PAT), og luftrør bør være synlige. Sørg for, at de primære arterielle grene fra stammen ikke er delt eller skadet.
3. PA kateterisation og blodperfusion
- For at samle enhed 1 skal du tråd 15 cm PE-10 slanger på navet på en 30 G-kanyle og fastgøres til en 1 ml sprøjte fyldt på forhånd med 10-4 M natriumnitrtroprusside (SNP) i PBS. Primer slangen ved at fremrykke stemplet, indtil al luften er udrult fra denne enhed ( Figur 1).
FORSIGTIG: SNP er giftig ved indtagelse. Undgå kontakt med hud og øjne. Vask huden grundigt efter håndtering. Bær passende personlige værnemidler.- Alternativt kan du samle enhed 2. For mus postnatal dag 7 (P7) og yngre, skal du bruge en hæmostat til at frigøre en ekstra 30 G nål fra navet og tråd nålen på den åbne ende af slangen på enhed 1 (Figur 1).
- I stedet for en nål, bruge buede skarpe kraftbecer til at gribe den ene ende af en 10 cm længde på 7-0 silke. Trænge ind i spidsen af hjertet ind fra den ene side og passerer spidsen af stænt gennem musklen og ud af den anden side. Tag fat i silke med et andet sæt af scer og træk ca. en 2 cm længde igennem og bindes af. Tag de resterende 8 cm ende af suturen, slæbe hjertet caudally, og tape enden på det kirurgiske bord.
BEMÆRK: Dette vil skabe spænding, yderligere udsætter de store fartøjer og tøjring hjertet på plads, giver mulighed for lettere placering af kateteret i lungepulsåren. - Krog spidsen af buede snævn under både AA og PAT. Træk en 3 cm længde på 7-0 silke tilbage gennem åbningen og skabe en enkelt-kast løs sutur.
- Brug saks foretage en 1-2 mm snit mod spidsen af hjertet, gennemtrængende den tyndvæggede højre hjertekammer (RV), for at give mulighed for indsættelse af kateteret (Enhed 1). Før indføring skal det bekræftes, at der ikke er luft i systemet. Indfør primet slange i højre hjertekammer og forsigtigt forhånd i den halvtransparent tyndvæggede PAT.
- Visuelt kontrollere, at kateteret ikke har avancerede i enten venstre eller højre lunge grene og ikke støder op til lungepulsåren branchpoint. Ved hjælp af tape, fastgør den distale del af slangen til det kirurgiske bord.
BEMÆRK: Brug vicessklæde til at klemme højre side af hjertet for at identificere RV'en. I modsætning til venstre hjertekammer, bør den relativt tynde fri væg rv let gribes. - For mus yngre end P7 fastgøres enhed 2 til en mikromanipulator, og nålenden af enheden indføres i PAT som beskrevet ovenfor ved hjælp af manipulatoren.
- Visuelt kontrollere, at kateteret ikke har avancerede i enten venstre eller højre lunge grene og ikke støder op til lungepulsåren branchpoint. Ved hjælp af tape, fastgør den distale del af slangen til det kirurgiske bord.
- Stram forsigtigt den løse sutur omkring både store kar og skær den 8 cm lange suturlængde, der er skabt i trin 3.2, for at vende hjertet tilbage til en naturlig hvileposition. Kateteret er nu solidt fastgjort i PAT.
- Klip hjertets venstre aurikel, så perfusate kan forlade systemet.
- Fastgør SNP-holdige sprøjter (enhed 1 eller enhed 2, størrelsesafhængig) i sprøjtepumpen, og gennemspørg opløsningen med en hastighed på 0,05 ml/min for at skylle blodet og maksimalt spile vaskulaturen. Blod/perfusat vil afslutte via den klippede aurikel. Fortsæt perfusion, indtil perfusate løber klart (~ 200 μL i en voksen mus, mindre for yngre dyr).
BEMÆRK: Ved perfusion af pbs/SNP med lav viskositet blev der anvendt en relativt højere infusionshastighed for at spare tid. Jo mere tyktflydende polymer forbindelse er infunderes i et langsommere tempo for at forhindre overfyldning, brud, og maksimere kontrollen over distale endepunkter.
4. Tracheostomi og lungeinflation
- Konstruere lungeinflationsenheden( Figur 2).
- Tilslut et fleksibelt 24 G intravenøst (IV) kateter (nålen fjernes)/butterfly infusion indstillet til en stophane, fastgjort til en åben 50 ml sprøjte (ingen stemplet). Hæng sprøjten fra et ringstand.
- Tilsæt 10% buffered formalin til sprøjten. Åbn stophanen, så formalin kan komme ind i slangen og rense al luft fra systemet. Stophanen lukkes, og sprøjten hæves, indtil menisken er 20 cm over luftrøret8.
FORSIGTIG: Formalin er brandfarlig, kræftfremkaldende, akut giftig, når det indtages, og forårsager hudirritation, alvorlige øjenskader, hudsensibilisering og kimcelle mutagenicitet. Undgå indtagelse og kontakt med hud og øjne. Undgå indånding af damp eller tåge. Opbevares væk fra antændelseskilder. Bær passende personlige værnemidler.
- Placer to løse suturer ringere end cricoid brusk 2-4 mm fra hinanden.
- Ved hjælp af en saks, lave et lille snit i cricothyroid ledbånd overlegen i forhold til suturer.
- Sæt IV kateteret ind i åbningen og før spidsen ud over de to løse suturer.
- Stram suturerne omkring luftrøret og åbn stophanen. Lad formalin at komme ind i lungerne ved tyngdekraften og vente i 5 minutter for lungerne til fuldt ud at puste. Hvis lungerne klæber til brystkassen under oppustning, gribe ydersiden af brystkassen med stumpe spidse snæv og bevæge sig i alle retninger for at hjælpe med at frigøre lapper. Må ikke komme i direkte kontakt med lungerne.
- Efter 5 min, tilbage IV kateteret ud over den første sutur og ligate. Gentag for den anden sutur. Lungerne er nu oppustet i lukket, tryktilstand.
5. Støbning af vaskulaturen
- I et 1,5 ml rør klargørs 1 ml af en 8:1:1opløsning 8 polymer:fortyndingsmiddel: hærdningsmiddel og inverteres forsigtigt flere gange for at sikre god blanding.
- Fjern stemplet fra en 1 cc sprøjte, dække den modsatte ende med en behandsket finger, og hæld polymerforbindelsen i sprøjten. Sæt forsigtigt stemplet i igen, inverter og fremskret forsigtigt stemplet for at fjerne al luft og danne en menisk på spidsen af sprøjten.
- Fjern SNP/PBS-sprøjten fra nålens nav og dryp ekstra PBS ind i navet for at skabe en menisk. Kontroller omhyggeligt navet for fanget luft, løsne hvis det er nødvendigt, og reformere menisken. dig til navet til sprøjten fyldt med polymerforbindelsen.
BEMÆRK: Oprettelse af en menisk i begge ender reducerer muligheden for luft til at komme ind i systemet. - Fastgør polymerforbindelsen fyldt sprøjten til sprøjtepumpen og indgyde ved 0,02 ml/min.
BEMÆRK: For mindre lunger, en langsommere sats kan være nyttigt at forhindre overfyldning, men, er ikke afgørende. - Overvåg forbindelsen, når det bevæger sig frit ned i PE-slangen, og noter sprøjtevolumenet, når det kommer ind i PAT. Fortsæt påfyldningen, indtil alle lapper er fyldt helt ned til kapillærniveauet, og stop sprøjtepumpen. Kontroller sprøjtens volumen igen.
BEMÆRK: Efter flere kørsler kan et anslået volumen bruges til at måle et omtrentligt slutpunkt (~35 μL for en voksen mus og ~5 μL for en P1-hvalp). Efter pumpen er standset, vil det resterende tryk i systemet fortsætte med at skubbe polymerforbindelsen ind i lungearterierne. Alle lungelapper skal fyldes med samme hastighed. - Dæk lungerne med en fiberoptisk rengøring tørre, liberalt anvende PBS, og lad slagtekroppen til at sidde uforstyrret i 30-40 min ved stuetemperatur. I denne periode vil polymerforbindelsen hærde og hærde.
- Fjern kateteret, afspær armene/den nederste halvdel af musen, og placer hoved/brystkassen i en 50 ml konisk konisk fyldt med 10% bufferformøre natten over.
- Efter fikseringen skal luftrøret forsigtigt adskilles fra den resterende brystkasse og brystkasse. Anlæste hjerte-/lungeblokken i et formalinfyldt scintillationshætteglas. Kassér resten.
6. Alternative vaskulære senge til støbning (tabel 1)
BEMÆRK: Hver målvaskulær seng kan kræve forskellige kateterplaceringer, infusionshastigheder og optimale påfyldningstider. Således vil flere dyr være nødvendigt at kaste flere organer.
- For systemiske vaskulære senge overlegen eller ringere end mellemgulvet følge trin 1.1-2.5 som ovenfor. Se yderligere bemærkninger på portalsystemet og membran (tabel 1).
- Tag fat i xiphoid processen med en hemostat og skær brystkassen bilateralt (ca. i midterliniær linje) lige før de interne thorax arterier.
- Fold den stadig tilsluttede brystkasse over en sådan, at den hviler på dyrets hals/ hoved, hvilket er fuldt ud at udsætte brysthulen.
- Følg trin 3.1 ovenfor, derefter fjerne lungerne. Når bryst-aorta (TA) er synlig, krog spidsen af buede kraftbefædre nedenunder, ~ 10 mm overlegen i forhold til mellemgulvet. Tag fat i en 3 cm længde på 7-0 silke, træk dig tilbage gennem åbningen under TA, og lav en enkeltkastløs sutur. Gentag denne procedure ~ 8 mm over mellemgulvet.
- For strukturer overlegen i forhold til mellemgulvet, skal du bruge foråret saks til at skabe et lille hul (~ 30% af den samlede omkreds) på ventrale del af TA, ~ 2 mm ringere end de løse suturer placeret i trin 6,4.
- For strukturer ringere end mellemgulvet, i stedet, skabe et lille hul ~ 2 mm overlegen i forhold til de løse suturer.
- Afhængigt af dyrets størrelse indføres enhed 1 eller 2 i beholderen, fremføre ud over løse suturer, og beholderen skal forsigtigt pareres.
- Følg trin 3.7, hvor sprøjtepumpen indstilles til en hastighed på 1,0 ml/min. og perfusere mindst 5 ml. Perfusate vil forlade via IVC.
- Følg trin 5.1 - 5.4 justering af infusionshastigheden til 0,05 ml/min. og overvågning visuelt målvævet i realtid.
BEMÆRK: Infusionsvolumen vil være organ- og dyrealderspecifikt. Volumenet kan yderligere begrænses af ligating arterielle grene, der fører til ikke-mål vaskulære senge (dvs. hjerne, lever, nyre, tarm). - Følg 5,6 derefter fjerne målet væv og sted i formalin.
7. Prøvemontering, scanning og rekonstruktion til mikro-CT
- Ved hjælp af paraffinfilm skal du oprette en flad overflade på scanningssengen og centrere den våde prøve på denne overflade(Figur 3A).
BEMÆRK: Hvis der registreres bevægelsesartefakt, kan prøven kræve yderligere stabilisering. - Let telt/ dække prøve med ekstra paraffin film for at forhindre dehydrering. Vær særlig forsigtig med ikke at hvile paraffinfilmen på prøven, der forårsager deformation af vævet (Figur 3B).
- Scan eksemplet ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet i tabel 2, og standardisere disse parametre i et givet eksperiment.
BEMÆRK: Dette er eksperiment/slutpunkt afhængig. Standardisere de valgte parametre for at lette sammenligningen mellem prøverne. - Overfør de rekonstruerede scanninger til efterbehandling og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket stemmer vil udstille ensartet påfyldning af hele lungepulsåre netværk. Vi demonstrerer dette i C57Bl/6J mus i alderen: Postnatal dag P90 (Figur 4A), P30 (Figur 4B),P7 (Figur 4C), og P1 (Figur 4D). Ved at kontrollere strømningshastigheden og visuelt overvåge fylde i realtid, pålidelige endepunkter af de mest distale vaskulatur blev opnået (Figur 5A).
Almindelige udfordringer omfatter skader på lungerne, ufuldstændig påfyldning, underfyldning, eller overfyldning, wedging kateteret, og dyrs størrelse.
Hvis der er skader på lungerne/luftvejene, vil små lækager forhindre lungerne i at holde trykket (Figur 5B,C). I mangel af fuldstændig inflation bliver det vanskeligt at foretage nøjagtige kvantitative og rumlige sammenligninger på tværs af stikprøver. For at minimere risikoen for lungeparenkym skal du undgå at skære for tæt på lungerne, når du fjerner brystkassen, og holde lungerne fugtige med PBS under hele proceduren for at undgå dehydrering og overholdelse af de omkringliggende strukturer. Hvis en lap klæber til brystkassen under oppustning, forsigtigt gribe ydersiden af brystkassen (væk fra lungerne) med scef og flytte den i en retning for at frigøre lapper. Alternativt kan et stumpt instrument, såsom en spatel, med en glat kant bruges til at løfte eller skubbe den oppustede lunge væk fra brystkassen. Når oppumpning lungerne, overholde foreslåede trykparametre og undgå over-inflation, da dette kan føre til brud på luftvejene. Endelig må lungerne ikke fjernes fra brysthulen, før efter fikseringen er afsluttet. Luftrøret, lungerne og hjertet skal fjernes en bloc fra de resterende dele af brysthulen.
Patchy (Figur 5D) eller ufuldstændig (Figur 5E) påfyldning kan opstå fra en "luftsluse", hvor luft føres ind i det vaskulære system via kateteret, blokerer nedstrøms strømmen af forbindelsen. For at minimere risikoen for en luftsluse skal du forsigtigt rense luft fra spidsen af kateteret før indføring (trin 3.4) og under sprøjteovergangen fra SNP/PBS til polymerforbindelse. Hvis fyldet forbliver uensartet eller ufuldstændigt, kan det være en indikation af øget vaskulær resistens som følge af fokal/lang segmentstenose eller tortuositet. Blodpropper kan også føre til ufuldstændig påfyldning og er let undgås ved hjælp af heparin forud for proceduren.
Forkert injektion volumen vil føre til underfyldning eller overfyldning. Underfyldning opstår, når for lidt forbindelse indføres i vaskulaturen (Figur 5F). Alternativt kan overfyldning eller indførelse af for meget polymerforbindelse for hurtigt forårsage enten arteriel brud (Figur 5G) eller, mere almindeligt, venøs transit (Figur 5H). Begge problemer kan afhjælpes ved hjælp af en sprøjtepumpe. Efterforskere bør nøje overholde den foreslåede sats og volumen restriktioner eller fastsætte deres egne satser baseret på deres specifikke model og optimering. Overvågning polymer forbindelse perfusion i realtid under forstørrelse er kritisk, og påfyldning af små arterioler / kapillærer bør anvendes som et endepunkt.
Fremrykning kateteret for langt ned lungestammen kan forårsage spidsen til kile i en lungearterie gren og skabe en ubalance i strømmen. Som følge heraf fyldes den ene side hurtigere end den anden (figur 5I), hvilket ofte fører til overfyldning i den ene lunge og underfyldning i den anden. Mens kateter wedging er den mest sandsynlige årsag i dette scenario, "luftsluse" og mangel på heparin kan også være medvirkende faktorer.
Endelig udgør mindre dyr deres egne yderligere hindringer. Yngre dyr kræver stabile hænder og små fejl er mindre tilgivende. Instrumenter af høj kvalitet, der er specielt designet til mikrokirurgi, bliver vigtigere ved tidlige postnatale tidspunkter. Brug af en mikromanipulator hjælper i høj grad i ikke kun placering, men forhindrer kateter dislokation. Det er også vigtigt at udnytte sprøjtepumpen på små dyr til præcist at kontrollere og styre endepunkter.
Mens specielt vist for lunge vaskulaturen, denne procedure kan nemt anvendes på systemiske mål vaskulære senge samt (Tabel 1). Ud over de udfordringer, der er anført ovenfor, er det afgørende at vælge det rigtige indgangspunkt. Støbning via thorax aorta giver fremragende resultater for de fleste vaskulære senge. Det skal dog bemærkes, at indsættelse af kateteret så proksimale til målstedet som muligt og ligating ikke-mål vaskulatur hjælper med flow og volumenkontrol. Disse forbedringer kombineret med passende direkte overvågning af distale vaskulære endepunkter (figur 6A-F-F) og standardinfusionshastigheder optimerer fyldet. Mange eksempler på sådanne støbning metoder findes i litteraturen og er for mange til fuldstændig henvisninger. Yderligere oplysninger kan dog findes i organspecifik tekst som disse4,5,7,18,19,20,21.
Efter støbning kan prøverne behandles til μCT-scanning (Figur 7A,B). Til efterbehandling producerede en kommerciel softwarepakke (se tabel over materialer)en 3D-volumengengivelse af det lungevaskulære træ, der præsenteres som stillbilleder (Figur 7C) eller film. Yderligere statistiske analyser udforske vaskulære egenskaber såsom segment længde og antal, tortuosity, orden (generation eller rang), volumen, og arkade længde kan også udføres. Ud over μCT-scanning kan de støbte prøver også ryddes for at opnå bruttobilleder eller forarbejdes og skæres til histologisk analyse8.
Figur 1: Kateter og nåleopsætning. Sprøjterne vises med påsatte slanger og nåle (Unit1 og Unit2). Indsat: nærbillede af nål og slanger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opsætning af lungeinflation. Ring stativ, klemme, en sprøjte fyldt med formalin, og slanger med et kateter fastgjort. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mikro-CT prøvepræparering forskansning. (A) Her var prøven centreret på en paraffinfilmbase, ( B )Hervar prøven centreret og dækket på parafilmbasen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Vaskulære lunger i varierende udviklingsstadier fra 3 måneder til 1 dag gamle. Dorsal visning af lunger, (A) P90, (B) P30, (C) P7, og (D) P1 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Eksempler på ideel påfyldning og almindelige fejlunderpolymerblandingsinfusion. (B) Fuldt oppustede formalinperfunderede lunger repræsenteres af en hvid stipletlinje,( C ) Underoppustede/deflaterede lunger vises. Dette blev observeret på grund af en kompromitteret lungeluftveje. Den oprindelige oppustede position repræsenteres af en hvid stiplet linje, og den deflaterede position repræsenteres af en sort stiplet linje,(D) Patchy filling: vaskulaturen af dele af lapmen forbliver ubefyldt, mens andre områder var helt fyldt, (E) Ufuldstændig fyldning: Polymerforbindelsen trængede ikke ind i hele dele af lungerne, (F) Underfyldning: Polymerforbindelsen kunne ikke fylde distale vaskulatur, (G) Brud: pilen peger på polymerforbindelsen ekstruderet fra vaskulatur, (H) Venøs fyldning: Noter pilen, der peger helt på de arterielle segmenter og strækker sig ind i det venøse system. Vener og venekler var af betydeligt større kaliber, (I) Kateter kile: Her kateteret blev shunted i en arterie forhindrer vaskulaturen af de højre lapper fra påfyldning helt, mens den venstre lap var overfyldt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Vaskulær støbning og endepunkter i yderligere organer. (A) Nyre: det punktformulerede udseende af polymerforbindelse i glomerulus forudsat endepunktet. BB) Lever: Noter de små kar, der er synlige i organets kanter. CC) Mave: Små fartøjer var synlige og fyldte. D) Tyktarm: Små kar er lette at identificere og fylde. (E)Membran: musklen her er tynd og gennemskinnelig med små fyldte fartøjer tilsyneladende. (F). Hjernen: små fartøjer var synlige i cortex. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. CT-billeder og 3D volumen gengivelse af polymer sammensatte fyldte lunger. (A) En enkelt gråskaleret rekonstrueret lungeskive, (B) Dette var en maksimal intensitetsprojektion af en CT-scanning fremstillet af polymerfyldte lunger, ( C )En3D-volumengengivelse af den vaskulære arkade blev genereret ved hjælp af kommercielt tilgængelig software (se Tabel over materialer). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Mål arteriel vaskulær seng | Placering af kateter | Infusionsretning | Infusionshastighed | Noter |
| Hjernen | Thorax aorta peger kranielly | Retrograd i carotis | .05ml/min. | Cannulate thorax aorta, flip musen til den udsatte position, åben hovedbund, og visuelt overvåge udviklingen af polymer gennem kraniet. |
| Mellemgulvet | Venstre Ventrical | Anterograde til intern thorax, phrenic og intercostal | .05ml/min. | Åbn et vindue i siden af brystkassen, så størstedelen af brystkassen og mellemgulvet intakt. Kannulate venstre ventrical, klip højre atrium, og overvåge fremskridt fra caudal side af mellemgulvet. |
| Muskulatur i overekstremiteterne | Thorax aorta peger kranielly | Retrograd i brachiocephalic og venstre subclavia | .02ml/min. | For at optimere lemmer flow, binde halspulsårerne og fjerne lemmer hud til at tillade visuel overvågning af polymer transit i lemmer muskulaturen. |
| Nyre | Thorax aorta peger caudally | Anterograde i nyrearterier | .05ml/min. | Den interne vaskulatur er fyldt blindt. For at undgå venøs transit, stoppe injektion, når polymer er synlig i en ensartet punktformigt mønster på tværs af nyrerne. |
| Portalsystem | Portal vene | Anterograde ind i portalsystem | .02ml/min. | Fold forsigtigt leveren op for at eksponere portalvenen. |
| Hepatisk | Thorax aorta peger caudally | Anterograde ind i leverpulsåren | .05ml/min. | Bind portalvene før infusion for at undgå venøs transit fra tarmen, der strømmer ind i leveren. |
| Mave/ Tarm | Thorax aorta peger caudally | Anterograde ind i cøliaki, overlegen mesenteric og / eller ringere mesenteric | .05ml/min. | Nogle regioner i tarmen leveres af flere arterier og kan fylde på forskellige tidspunkter. For at undgå venøs transit, binde arterier ikke er nødvendige for områder af interesse og visuelt overvåge udviklingen af polymeren. |
| Intra-abdominal fedt puder | Thorax aorta peger caudally | Anterograde men fartøjet afhænger af fedt pad bliver undersøgt | .05ml/min. | Fedt puder leveres af flere arterier og kan fylde på forskellige tidspunkter. For at undgå venøs transit, binde arterier ikke er nødvendige for præcist område af interesse og visuelt overvåge udviklingen af polymeren. |
| Underekstremiteterne muskulatur | Infrarød aorta peger caudally | Anterograde ind i lårbensarterierne | .02ml/min. | Fjern lemmer hud til at tillade visuel overvågning af polymer transit ind i lemmerne muskulatur. |
Tabel 1. Casting alternative vaskulære senge.
| CT-indstillinger | |
| kVP | 90 |
| Målmateriale | Wolfram |
| Magt | kr. |
| Filtrering | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Projektion nummer | 6424 |
| Detektorstørrelse | Cmos med fladskærm - 2944 x 2352 pixel |
| Synsfelt (FOV) | 36 mm |
| Voxel-størrelse | 72 μm |
| Rumlig opløsning | voxel størrelse x 1,5 |
| Anskaffelsestid | 14 min. |
| Genopbygning | FBP og kommerciel algoritme |
| Placering | 1x1 |
Tabel 2. μCT-scanningsparametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udført korrekt, denne metode giver slående billeder af lungearterial netværk, giver mulighed for sammenligning og eksperimenter i gnaver modeller. Flere kritiske skridt undervejs sikrer succes. For det første skal efterforskerne heparinisere dyret i den forberedende fase for at forhindre blodpropper i at danne i lungevaskulaturen og kamre i hjertet. Dette giver mulighed for fuldstændig arteriel transit af polymer sammensatte. For det andet, når punktering af mellemgulvet og fjerne brystkassen, passe på at beskytte lungerne mod utilsigtet skade, nedskæringer eller skade. Enhver lækage i luftvejene vil forhindre fuldstændig inflation og gøre sammenligninger mellem prøver unøjagtige. For det tredje, tøjring hjertet på spidsen hjælpemidler kateter placering. For det fjerde, brugen af en stærk vasodilatator såsom SNP vil hjælpe med både fjernelse af blod og fuldstændig påfyldning af arterioler og kapillærer5,8. For det femte, når du placerer kateteret i PAT, passe på ikke at begrave spidsen i bifurcation. Dette vil medføre en ubalance i flow, rangering polymer sammensatte til enten venstre eller højre side, hvilket giver en ulige trykgradient. Sjette, brugen af en sprøjte pumpe vil give brugeren mulighed for at styre hastigheden og titer volumen til både mus stamme og alder. Endelig, lad hjertet / lungerne knyttet til resten af brysthulen, fix natten over, og fjern den følgende dag. Lungerne vil være godt fast og potentialet for deflation på grund af utilsigtede rifter under separation vil blive minimeret.
Mens denne metode opnår de ønskede resultater, kan alternative teknikker være nyttige for nogle brugere. For at hjælpe med placeringen af kateteret kan der anvendes en mikromanipulator. Vi valgte en version med en lille profil og magnetisk base for at minimere indgreb i et allerede begrænset arbejdsområde, samtidig med at en stabil base (hvis du bruger en magnetisk base, skal du sørge for at placere en stålplade under arbejdsområdet, så magneten kan aktiveres). Dette gør det muligt for brugeren præcist at placere spidsen af kateteret i PAT i en vinkel, der følger arteriens naturlige bane. Derudover er kateteret sikkert og med mindre risiko for at blive løsnet. En anden mulighed er brugen af et trompetistkateterspids8. Selvom det ikke er trivielt at skabe, en trompetist kateter er langt mere sikker og mindre tilbøjelige til et uheld glide ud af PAT. Ændring af forholdet mellem polymer: fortyndingstyv ændrer viskositet og den lethed, hvormed små fartøjer er fyldt. Afhængigt af målet vaskulatur og eksperimentelle endepunkter dette kan være en værdifuld overvejelse. Eutanasi via CO2 kan forårsage lungeblødning hos en lille procentdel af dyrene og er stammeafhængig22. Overvej en alternativ eutanasi protokol bør denne indvirkning eksperimentelle endepunkter. Ved oppumpning af lungerne, brug af formalin hjælpemidler fiksering af organet på plads ved det givne tryk. En fysiologisk neutral buffer kan erstattes, hvis perifere fartøjer skal udfyldes i ikke-fast anbragt tilstand. Hvis infusionshastighed og kontrol er af mindre betydning for et givet eksperiment, er det også muligt at foretage en stigning i hånden. Håndindsprøjtning kræver praksis og overvågning i realtid under forstørrelse for at undgå overfyldning eller karbrud8. Endelig væv mount / betingelser, scanning parametre, og minimal efterbehandling vi ansat til dette papir bør tjene blot som udgangspunkt. Forskellige scannere, væv, eksperimentelle slutpunkter / brugerbehov kan kræve alternative parametre.
Mens de vaskulære billeder genereret fra denne teknik er imponerende, der er begrænsninger. Primært er ovenstående metode suboptimale til måling af vaskulær kaliber på grund af den manglende evne til at overvåge og kontrollere intravaskulært tryk under infusionen. Andre grupper har formået at noget løse disse pres bekymringer i systemisk vaskulatur ved at overvågekørselstryk 4,23, men sådanne bekymringer er yderligere forstærket på lungesiden på grund af den relativt tynde lungepulsåren vægge, der er let distensible med små ændringer itryk 24 og den manglende evne til præcist at måle og statisk kontrol lungeintrakarmiske tryk.
En anden begrænsning til denne metode er, at det forbliver en postmortem, enkelt timepoint eksperiment, begrænse dens nytte i undersøgelser, der kræver virkelig fysiologiske forhold eller et tidsforløb. Andre foranstaltninger til levende dyr, såsom CT-lungeangiografi (CTPA) eller kontrastforbedret μCT (CE-CT), giver mulighed for funktionelle og morfologiske foranstaltninger. Gentagne scanninger/langsgående undersøgelser samt målinger på forskellige steder i hjerte-/lungecyklussen kan undersøges10,,25,,26,,27,28. Disse metoder kan pålideligt anvendes, ud over ekkokardiografi, at måle arteriel kaliber. Både CTPA- og ekkokardiografiforanstaltningerne er imidlertid i øjeblikket begrænset til vurderingen af den proksimale vaskulatur. For ekkokardiografi er vurderingen begrænset til lungestammen, mens CTPA giver mulighed for tilstrækkelig beregning af grenpulsåren kaliber potentielt 1-2 ordrer yderligere, men opløsningen er begrænset, tilsløring distale dele af vaskulaturen7. Strålingsdosis er også et problem, der bør overvåges nøje, når du bruger CT, især i multi-scan langsgående undersøgelser29,30. For en af disse applikationer kan μCT-udstyr, scanningstid og analysesoftware være dyrt og kræve specialiseret personaleuddannelse. Dyrebilleddannelse kernefaciliteter på nogle institutioner kan lette denne byrde.
Som et alternativ til dette stof, nogle grupper udnytte traditionelle korrosion støbning teknikker ledsaget af blødt væv fjernelse31,32. Disse metoder giver resultater svarende til denne polymer forbindelse, men slutproduktet er skørt, fører til potentielle artefakt15. Desuden eliminerer fjernelsen af blødt væv potentialet for fremtidig histologi33. En anden mulighed er at lade det bløde væv være intakt og udføre et opfølgningstrin , hvor det bløde væv "renses", hvilket gør prøvennæsten gennemsigtig 34,35. Vævsclearing giver brugeren en vis evne til at se dybere i en prøve, men i det store og hele forbliver ringere end μCT, da det ikke kan give den samme 3D-visualisering. Seriedytomologisk sektionsografi og arraytomografi er metoder, der giver usædvanlig høj opløsning. Mens denne teknik åbner døren for spændende nye muligheder, arbejdsbyrden er eksponentielt højere og ikke særlig befordrende for storekohorter 11,12. 3D-røntgensyologi er en ikke-destruktiv tilgang , som parre både μCT og traditionel histologi eller endda EM36,37,38. Det tager et mere højt niveau opfattelse af patologi ved at udnytte μCT til globalt at identificere og præcist spejder regioner af interesse, som derefter følges op med rutinemæssig histologi39. At erstatte kontrastmidler med lavere opløsning (eller i nogle tilfælde ingen kontrast) med polymerforbindelse i vaskulaturen kan tjene til at hæve begge teknikker, når det er muligt. En anden ikke-destruktiv tilgang, der er beregningsmæssigt intensiv endnu, potentielt øger kontrasten, er fase-hentning μCT imaging40,41. Denne metode kan være værdifuld, når den anvendes på støjende data , hvor kontrasten er svag eller ikke mulig42. Den polymerforbindelse, der anvendes i denne teknik, lider dog ikke under denne begrænsning. Når det er sagt, kan faseudtagning være nyttig, hvor polymerforbindelsen muligvis fortyndes,f.eks. Endelig stereologi har været en standard i lunge kvantitative strukturelle analyse i år44. Den anvender stikprøver af systematiske prøver på tværsnit af væv til at foretage 3D-slutninger, forudsat at de udvalgte prøver er tilstrækkeligt repræsentative. Mens et kraftfuldt værktøj, det har potentiale til at føre til fejl og bias. Kombinere CT billedbehandling med stereologi, dog holder store løfte45.
Den skitserede metode er forholdsvis ligetil, og med uddannelse er det muligt at opnå en succesrate på >90%. Når mestrer, det giver mulighed for fuldstændig og pålidelig støbning af lunge vaskulatur. I fiksativ, væv og polymer forblive stabil på ubestemt tid for fremtidige scanninger, potentielle histologi, eller EM46,47. Vi har vist, at denne teknik kan bruges i dyr så unge som P1 gennem voksenalderen og tror embryonale støbning, via lungearterien, er inden for rækkevidde. Det skal bemærkes, at denne teknik kan anvendes på stort set alle andre vaskulære seng ved blot at ændre kateteret indgangspunkt og bestemmelse af passende endepunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). Vi vil gerne takke NIH Mouse Imaging Facility for vejledning i billederhvervelse og analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
