Summary
Målet med denne teknikken er ex vivo visualisering av lungearteriale nettverk av tidlige postnatale og voksne mus gjennom lungeinflasjon og injeksjon av en radio-ugjennomsiktig polymerbasert forbindelse via lungearterien. Potensielle anvendelser for støpt vev diskuteres også.
Abstract
Blodkar danner intrikate nettverk i 3-dimensjonal plass. Følgelig er det vanskelig å visuelt sette pris på hvordan vaskulære nettverk samhandler og oppfører seg ved å observere overflaten av et vev. Denne metoden gir et middel til å visualisere den komplekse 3-dimensjonale vaskulære arkitekturen i lungene.
For å oppnå dette settes et kateter inn i lungearterien, og vaskulaturen skylles samtidig av blod og kjemisk utvides for å begrense motstanden. Lungene blåses deretter opp gjennom luftrøret ved et standardtrykk, og polymerforbindelsen infunderes i vaskulær seng med en standard strømningshastighet. Når hele arterielt nettverk er fylt og lov til å kurere, lunge vaskulaturen kan visualiseres direkte eller avbildet på en mikro-CT (μCT) skanner.
Når det utføres vellykket, kan man sette pris på lungearterialt nettverk hos mus som spenner fra tidlig postnatal alder til voksne. I tillegg, mens demonstrert i lungearteriesengen, kan denne metoden brukes på en vaskulær seng med optimalisert kateterplassering og endepunkter.
Introduction
Fokuset for denne teknikken er visualiseringen av lungearterial arkitektur ved hjelp av en polymerbasert forbindelse hos mus. Mens omfattende arbeid har blitt utført på systemiske vaskulære senger som hjerne, hjerte og nyre1,2,3,4,5, er mindre informasjon tilgjengelig om preparat og fylling av lungearterialnettet. Målet med denne studien er derfor å utvide på tidligere arbeid6,7,8 og gi en detaljert skriftlig og visuell referanse som etterforskerne enkelt kan følge for å produsere høyoppløselige bilder av lungearterietreet.
Mens mange metoder finnes for merking og avbildning lunge vaskulatur, for eksempel magnetisk resonans avbildning, ekkokardiografi, eller CT angiografi9,10, mange av disse modaliteter ikke klarer å tilstrekkelig fylle og / eller fange de små fartøyene, begrense omfanget av hva som kan studeres. Metoder som seriell snitting og rekonstruksjon gir høy oppløsning, men er tids-/arbeidsintensive11,,12,,13. Omkringliggende bløtvev integritet er kompromittert i tradisjonell korrosjonstøping 10,13,14,15,16. Selv dyr alder og størrelse blir faktorer når du prøver å innføre et kateter eller, oppløsningen mangler. Polymerinjeksjonsteknikken fyller derimot arterier til kapillærnivået, og når den kombineres med μCT, gir det mulighet for enestående oppløsning5. Prøver fra muselunger så unge som postnatal dag 14 har blitt vellykket kastet8 og behandlet i løpet av noen timer. Disse kan skannes på nytt på ubestemt tid, eller til og med sendes til histologisk preparat/elektronmikroskopi (EM) uten at det eksisterende bløtvevet17 går på bekostningav det eksisterende bløtvevet 17 . De viktigste begrensningene for denne metoden er forhåndskostnaden for CT-utstyr/programvare, utfordringer med nøyaktig overvåking av intravaskulært trykk og manglende evne til å skaffe data langsgående i samme dyr.
Dette papiret bygger på eksisterende arbeid for å ytterligere optimalisere lungearterie injeksjon teknikk og presse alder / størrelse relaterte grenser ned til postnatal dag 1 (P1) for å gi slående resultater. Det er mest nyttig for lag som ønsker å studere arterielle vaskulære nettverk. Derfor gir vi ny veiledning for kateterplassering/stabilisering, økt kontroll over fyllfrekvens/volum, og fremhever bemerkelsesverdige fallgruver for økt castingsuksess. Resulterende kaster kan deretter brukes til fremtidig karakterisering og morfologisk analyse. Kanskje enda viktigere, dette er den første visuelle demonstrasjonen, så vidt vi vet, som går brukeren gjennom denne intrikate prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) fra National Heart Lung and Blood Institute.
1. Forberedelse
- Injiser musen intraperitoneally med heparin (1 enhet / g mus kroppsvekt) og la den ambulate i 2 min.
- Euthanize dyret i et CO2 kammer.
- Ordne musen i en liggende posisjon på et kirurgisk bord og fest alle fire lemmer til brettet med tape. Bruk forstørrelse for fin disseksjon.
2. Utsette lunger og luftrør
- Spray ventral side av musen med 70% etanol for å minimere hårforstyrrelser.
- Grip bukhuden med tang og lag et lite snitt med saks i navlestrengen. Skyv saksspissene inn i det fasciale laget mellom magemuskulaturen og huden og begynn å skille de to lagene. Arbeid rostrally, fjerne huden fra magen, brystkassen og nakken.
- Åpne bukmuskulaturen med saks og skjær sidealt på begge sider til membranen er utsatt.
- Ta forsiktig tak i xiphoidprosessen og løft litt brystkassen som maksimerer synet på de kaudale lungene gjennom den tynne, halvgjennomsiktige membranen. Lag forsiktig et lite snitt i membranen like under xiphoidprosessen. Lungene vil kollapse og trekke seg tilbake fra membranen. Disseker membranen vekk fra brystkassen, og ta vare på å ikke nicke lungeparenchyma.
- Finn og bryte den dårligere vena cava (IVC) og spiserøret hvor de passerer gjennom membranen. Bruk gasbind til å rydde opp i ethvert pooling blod i thoraxhulen, unngå kontakt med lungene.
- Ta tak i xiphoid igjen og løft forsiktig. Skjær brystkassen bilateralt (omtrent ved midtaksillærlinjen) for å unngå kontakt med lungene. Fjern fremre brystkassen helt, noe som gjør det endelige kuttet langs sternal vinkel like før manubrium.
- Ved hjelp av en ferdigfylt sprøyte tør du lungene liberalt med fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7.4) for å hindre uttørking. Fortsett denne rutinen gjennom hele prosedyren.
- Bruk tang, ta tak i manubrium og løft forsiktig bort fra kroppen. Bruk saks, kutt 1-2 mm lateral til manubrium, kutte clavicles, og fjerne. Dette vil avsløre thymus under.
- Grip hver flik av thymus, trekk fra hverandre og fjern. Gjenta denne prosedyren med submandibulær kjertel. Til slutt fjerner du muskelvevet som overlegger luftrøret.
MERK: Etter disseksjonen skal hjertet, stigende aorta (AA), lungearterialstamme (PAT) og luftrør være synlige. Sørg for at de primære arterielle grenene av stammen ikke er delt eller skadet.
3. PA kateterisering og blodperfusjon
- For å montere enhet 1, tråd 15 cm PE-10 rør på navet på en 30 G nål og fest til en 1 ml sprøyte forhåndsfylt med 10-4 M natriumnitroprusside (SNP) i PBS. Prime slangen ved å gå frem stempelet til all luft er renset fra denne enheten ( figur 1).
FORSIKTIG: SNP er giftig ved svelging. Unngå kontakt med hud og øyne. Vask huden grundig etter håndtering. Bruk egnet personlig verneutstyr.- Du kan også montere enhet 2. For mus postnatal dag 7 (P7) og yngre, bruk en hemostat til å løsne en ekstra 30 G nål fra navet og tre nålen på den åpne enden av slangen av enhet 1 (figur 1).
- I stedet for en nål, bruk buede skarpe tang for å gripe den ene enden av en 10 cm lengde på 7-0 silke. Trenge inn i toppen av hjertet inn fra den ene siden og passerer spissene av tang gjennom muskelen og ut av den andre siden. Grip silke med et annet sett med tang og trekk ca 2 cm lengde gjennom og bind av. Ta de resterende 8 cm enden av suturen, dra hjertet caudally, og tape enden til kirurgisk bord.
MERK: Dette vil skape spenning, ytterligere utsette de store fartøyene og tethering hjertet på plass, slik at det lettere plassering av kateteret i lungearterien. - Hekt tuppene av buede tang under både AA og PAT. Trekk en 3 cm lengde på 7-0 silke tilbake gjennom åpningen og lag en enkeltkast løs sutur.
- Ved hjelp av saks gjøre en 1-2 mm snitt mot toppen av hjertet, penetrere tynnvegget høyre ventrikkel (RV), for å tillate innsetting av kateteret (Enhet 1). Før innsettingen må du kontrollere at det ikke er luft i systemet. Introder de primede slangene i høyre ventrikkel og gå forsiktig inn i den halvgjennomsiktige tynnveggede PAT.
- Kontroller visuelt at kateteret ikke har avansert i grenene til venstre eller høyre, og ikke ligger ved siden av lungearterien. Bruk tape til å feste den distale delen av slangen til operasjonsbrettet.
MERK: For å identifisere bobilen, bruk tang til å klemme på høyre side av hjertet. I motsetning til venstre ventrikkel, bør den relativt tynne frie veggen på bobilen lett gripes. - For mus yngre enn P7, fest enhet 2 til en mikromanipulator og introdusere nåleenden av enheten i PAT som beskrevet ovenfor ved hjelp av manipulatoren.
- Kontroller visuelt at kateteret ikke har avansert i grenene til venstre eller høyre, og ikke ligger ved siden av lungearterien. Bruk tape til å feste den distale delen av slangen til operasjonsbrettet.
- Stram forsiktig den løse suturen rundt begge de store karene og kutt den 8 cm lange suturen som ble opprettet i trinn 3.2 for å returnere hjertet til en naturlig hvilestilling. Kateteret er nå godt festet i PAT.
- Klip venstre auricle av hjertet for å tillate perfusate å gå ut av systemet.
- Sikre DEN SNP-inneholdende sprøyten (enhet 1 eller enhet 2, størrelsesavhengig) i sprøytepumpen og tilbe som oppløsningen med en hastighet på 0,05 ml/min for å skylle blodet og maksimalt utvide vaskulaturen. Blod/perfusat vil gå ut via den avkuttede auricleen. Fortsett perfusjonen til perfusat går klart (~ 200 μL i en voksen mus, mindre for yngre dyr).
MERK: Ved perfusing av lav viskositet PBS / SNP, ble en relativt høyere infusjonshastighet brukt i interesse av å spare tid. Jo mer viskøs polymerforbindelse er infundert i en langsommere hastighet for å forhindre overfylling, brudd og maksimere kontrollen over distale endepunkter.
4. Trakeostomi og lungeinflasjon
- Konstruer lungeinflasjonsenheten (figur 2).
- Koble et fleksibelt plast 24 G intravenøst (IV) kateter (nål fjernet)/butterfly infusjon satt til en stoppekran, festet til en åpen 50 ml sprøyte (ingen stempel). Heng sprøyten fra et ringstativ.
- Tilsett 10% bufret formalin i sprøyten. Åpne stoppekranen, slik at formalin kan gå inn i slangen og rense all luft fra systemet. Lukk stoppekranen og løft sprøyten til menisken er 20 cm over luftrøret8.
FORSIKTIG: Formalin er brannfarlig, kreftfremkallende, akutt giftig ved inninntak, og forårsaker hudirritasjon, alvorlig øyeskade, hudsensibilisering og bakteriecellemutagenitet. Unngå inntak og kontakt med hud og øyne. Unngå innånding av damp eller tåke. Holdes vekk fra antennelseskilder. Bruk egnet personlig verneutstyr.
- Plasser to løse suturer som er dårligere enn den cricoid brusk 2-4 mm fra hverandre.
- Ved hjelp av saks, gjør et lite snitt i cricothyroid ligament overlegen suturer.
- Sett IV-kateteret inn i åpningen og før spissen utover de to løse suturene.
- Stram suturene rundt luftrøret og åpne stoppekranen. La formalinen komme inn i lungene ved tyngdekraften og vente i 5 min for lungene å blåse helt opp. Hvis lungene holder seg til brystkassen under inflasjonen, ta tak i utsiden av brystkassen med stumpe spisse tang og beveger seg i alle retninger for å bidra til å frigjøre flene. Ikke ta direkte kontakt med lungene.
- Etter 5 min, tilbake IV kateteret utover den første sutur og ligate. Gjenta for den andre suturen. Lungene er nå oppblåst i en lukket, trykksatt tilstand.
5. Støping av vaskulaturen
- I et 1,5 ml rør, klargjør 1 ml av en 8:1:1-løsning8 polymer: fortynningsmiddel: herdingsmiddel og forsiktig invertere flere ganger for å sikre god blanding.
- Fjern stempelet fra en 1 cc sprøyte, dekk motsatt ende med en hanskefinger, og hell polymerforbindelsen i sprøyten. Sett stempelet forsiktig inn igjen, snu og før stempelet for å fjerne all luft og danne en menisk på spissen av sprøyten.
- Fjern SNP/PBS-sprøyten fra nålens nav og drypp ekstra PBS inn i navet for å lage en menisk. Kontroller forsiktig navet for fanget luft, løsne om nødvendig, og reformer menisken. Bli med navet til sprøyten fylt med polymerforbindelsen.
MERK: Oppretting av en menisk i begge ender reduserer sjansen for luft til å komme inn i systemet betydelig. - Fest polymerforbindelsen fylt sprøyte til sprøytepumpen og infuse på 0,02 ml / min.
MERK: For mindre lunger kan en langsommere hastighet være nyttig for å forhindre overfylling, men er ikke avgjørende. - Overvåk forbindelsen når den beveger seg fritt ned i PE-slangen og noterer sprøytevolumet når det kommer inn i PAT. Fortsett å fylle til alle fliker fylles helt ned til kapillærnivået og stopp sprøytepumpen. Kontroller sprøytevolumet igjen.
MERK: Etter flere kjøringer kan et estimert volum brukes til å måle et omtrentlig endepunkt (~ 35 μL for en voksen mus og ~ 5 μL for en P1-valp). Etter at pumpen er stoppet, vil gjenværende trykk i systemet fortsette å presse polymerforbindelsen inn i lungearteriene. Alle lungeflipper skal fylles i samme hastighet. - Dekk lungene med en fiberoptisk rengjøringsserviett, påfør PBS liberalt, og la sitte uforstyrret i 30-40 min ved romtemperatur. I løpet av denne perioden vil polymerforbindelsen kurere og herde.
- Fjern kateteret, sever armene / nedre halvdel av musen, og plasser hodet / thorax i en 50 ml konisk fylt med 10% bufret formalin over natten.
- Etter fiksering, ta tak i luftrøret og forsiktig skille hjerte / lunge enhet fra de resterende ribbebur og thorax. Plasser hjerte-/lungeblokken i et formalinfylt hetteglass med scintillasjon. Kast resten.
6. Alternative vaskulære senger for støping (tabell 1)
MERK: Hver målvaskulær seng kan kreve forskjellige kateterplasseringer, infusjonshastigheter og optimale fylletider. Dermed vil flere dyr være nødvendig for å kaste flere organer.
- For systemiske vaskulære senger overlegen eller dårligere enn membranen, følg trinn 1.1-2.5 som ovenfor. Se flere merknader om portalsystemet og membranen (tabell 1).
- Ta tak i xiphoid prosessen med en hemostat og kutte brystkassen bilateralt (omtrent i midaxillary linjen) like før de interne thorax arteriene.
- Brett den fortsatt tilkoblede brystkassen over slik at den hviler på dyrets nakke / hode, og eksponerer brysthulen fullt ut.
- Følg trinn 3.1 ovenfor, og fjern deretter lungene. Når thorax aorta (TA) er synlig, hekt tuppene av buede tang under den, ~ 10 mm bedre enn membranen. Grip en 3 cm lengde på 7-0 silke, trekk tilbake gjennom åpningen under TA, og lag en enkelt kast løs sutur. Gjenta denne prosedyren ~ 8 mm over membranen.
- For strukturer som er bedre enn membranen, bruk vårsaks til å lage et lite hull (~ 30% av den totale omkretsen) på ventraldelen av TA, ~ 2 mm dårligere enn de løse suturene plassert i trinn 6.4.
- For strukturer som er dårligere enn membranen, i stedet, lag et lite hull ~ 2 mm bedre enn de løse suturene.
- Avhengig av dyrestørrelsen, introder enhet 1 eller 2 inn i fartøyet, gå utover løse suturer og fjern forsiktig fartøyet.
- Følg trinn 3,7, sett sprøytepumpen med en hastighet på 1,0 ml/min og perfusering av minst 5 ml. Perfusate vil avslutte via IVC.
- Følg trinn 5.1 - 5.4 justere infusjonshastigheten til 0,05 ml / min, visuelt overvåke målvevet i sanntid.
MERK: Infusjonsvolumet vil være organ- og dyrealdersspesifikt. Volumet kan begrenses ytterligere ved å ligaere arterielle grener som fører til ikke-målrettede vaskulære senger (det vil si hjerne, lever, nyre, tarm). - Følg 5.6 fjern deretter målvevet og plasser det i formalin.
7. Prøvemontering, skanning og rekonstruksjon for mikro-CT
- Bruk parafinfilm til å lage en flat overflate på skannesengen og sentrere den våte prøven på denne overflaten (figur 3A).
MERK: Hvis det oppdages bevegelsesartefakt, kan prøven kreve ytterligere stabilisering. - Lett telt/dekkprøve med ekstra parafinfilm for å forhindre dehydrering. Vær spesielt forsiktig så du ikke hviler parafinfilmen på prøven som forårsaker deformasjon til vevet (figur 3B).
- Skann eksemplet ved hjelp av innstillinger som er beskrevet i tabell 2, og standardiser disse parameterne i et gitt eksperiment.
MERK: Dette er eksperiment/endepunktavhengig. Standardiser de valgte parametrene for enkel sammenligning mellom prøver. - Overfør de rekonstruerte skanningene for etterbehandling og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vellykket støpt vil vise ensartet fylling av hele lungearterialnettet. Vi demonstrerer dette i C57Bl/6J mus i alderen: Postnatal dag P90 (Figur 4A), P30 (Figur 4B), P7 (Figur 4C) og P1 (Figur 4D). Ved å kontrollere strømningshastigheten og visuelt overvåke fyllet i sanntid, ble pålitelige endepunkter av de mest distale vaskulaturene oppnådd (figur 5A).
Vanlige utfordringer inkluderer skade på lungene, ufullstendig fylling, underfylling eller overfylling, veving av kateteret og dyrestørrelsen.
Hvis det er skade på lungene/luftveiene, vil små lekkasjer hindre lungene i å holde trykket (figur 5B,C). I fravær av fullstendig inflasjon blir det vanskelig å foreta nøyaktige kvantitative og romlige sammenligninger på tvers av prøver. For å minimere risikoen for lungeparenchyma, unngå å kutte for tett til lungene når du fjerner brystkassen og holder lungene fuktige med PBS gjennom hele prosedyren for å unngå dehydrering og overholdelse av omkringliggende strukturer. Hvis en flik holder seg til brystkassen under inflasjonen, ta forsiktig tak i utsiden av brystkassen (vekk fra lungene) med tang og flytt den i en retning for å frigjøre flene. Alternativt kan et sløvt instrument, for eksempel en slikkepott, med en jevn kant brukes til å løfte eller skyve den oppblåste lungen bort fra brystkassen. Når du blåser opp lungene, hold deg til foreslåtte trykkparametere og unngå overinflasjon, da dette kan føre til brudd på luftveiene. Til slutt, ikke fjern lungene fra thoraxhulen før etterfiksering er fullført. Luftrøret, lungene og hjertet bør fjernes en blokk fra de resterende delene av thoraxhulen.
Ujevn (figur 5D) eller ufullstendig (figur 5E) fylling kan oppstå fra en "luftslus", der luft innføres i det vaskulære systemet via kateteret, blokkerer nedstrøms strømning av forbindelsen. For å minimere sjansen for en luftslus, må du forsiktig rense luft fra spissen av kateteret før innsetting (trinn 3.4) og under sprøyteovergangen fra SNP/PBS til polymerforbindelse. Hvis fyllet forblir usammenhengende eller ufullstendig, kan det være en indikasjon på økt vaskulær motstand som følge av fokal/lang segmentstenose eller tortuositet. Blodpropper kan også føre til ufullstendig fylling og unngås lett ved å bruke heparin før prosedyren.
Feil injeksjonsvolum vil føre til underfylling eller overfylling. Underfylling oppstår når for lite forbindelse innføres i vaskulaturen (figur 5F). Alternativt kan overfylling eller innføring av for mye polymerforbindelse for raskt forårsake enten arteriell brudd (figur 5G) eller, oftere, venøs transitt (figur 5H). Begge problemene kan lindres ved hjelp av en sprøytepumpe. Etterforskerne bør nøye følge de foreslåtte sats- og volumbegrensningene eller etablere sine egne priser basert på deres spesifikke modell og optimalisering. Overvåking av polymerforbindelsesperfusjon i sanntid under forstørrelse er kritisk, og fylling av små arterioler / kapillærer bør brukes som et endepunkt.
Fremme kateteret for langt ned lungestammen kan føre til at spissen kiler inn i en lungearterie gren og skape en ubalanse i strømmen. Som et resultat fyller den ene siden raskere enn den andre (figur 5I), noe som ofte fører til overfylling i den ene lungene og underfylling i den andre. Mens kateter wedging er den mest sannsynlige årsaken i dette scenariet, "luftslusen" og mangel på heparin kan også være medvirkende faktorer.
Til slutt presenterer mindre dyr sitt eget sett med ekstra hindringer. Yngre dyr krever stødige hender og små feil er mindre tilgivende. Instrumenter av høy kvalitet, spesielt designet for mikrokirurgi, blir viktigere ved tidlige postnatale tidsrammer. Bruk av en mikromanipulator hjelper sterkt i ikke bare plassering, men hindrer kateter forvridning. Det er også viktig å bruke sprøytepumpen på små dyr for å nøyaktig kontrollere og administrere endepunkter.
Selv om det er spesielt vist for lungevaskulaturen, kan denne prosedyren enkelt påføres systemiske målvaskulære senger også (tabell 1). I tillegg til utfordringene som er nevnt ovenfor, er det avgjørende å velge riktig inngangspunkt. Støping via thorax aorta gir gode resultater for de fleste vaskulære senger. Det bør imidlertid bemerkes at det å sette inn kateteret så proksimalt til målstedet som mulig og ligating ikke-mål vaskulatur bistår i flyt og volumkontroll. Disse forbedringene kombinert med passende direkte overvåking av distale vaskulære endepunkter (figur 6A-F) og standard infusjonshastigheter optimaliserer fyllingen. Mange eksempler på slike castingmetoder finnes i litteraturen og er for mange for fullstendig referanse. Imidlertid kan flere detaljer bli funnet i organ spesifikk tekst som disse4,5,7,18,19,20,21.
Etter støping kan prøvene behandles for μCT-skanning (figur 7A,B). For etterbehandling produserte en kommersiell programvarepakke (se Materialstabell ) en 3D-volumgjengivelse av lungevaskulært tre presentert som stillbilder (figur 7C) eller filmer. Ytterligere statistiske analyser som utforsker vaskulære egenskaper som segmentlengde og tall, tortuosity, orden (generasjon eller rang), volum og arkadelengde kan også utføres. I tillegg til μCT-skanning kan de støpte prøvene også ryddes for å få bruttobilder eller behandlet og kuttes for histologisk analyse8.
Figur 1: Kateter- og nåleoppsett. Sprøyter er vist med vedlagte slanger og nåler (Unit1 og Unit2). Innslag: nærbilde av nål og rør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av lungeinflasjon. Ringstativ, klemme, en sprøyte fylt med formalin og slange med et kateter festet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3:Pre-scan for mikro-CT-prøveforberedelse. (A) Her var prøven sentrert på en parafinfilmbase, (B) Her var prøven sentrert og dekket på parafilmbasen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Vaskulære lunger på ulike utviklingsstadier fra 3 måneder til 1 dag gammel. Dorsal visning av lungene, (A) P90, (B) P30, (C) P7, og (D) P1 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på ideell fylling og vanlige feil under polymerforbindelsesinfusjon. (A) Ved fylling av endepunktet ble nådd, ble det observert et robust og fint vaskulært nettverk. (B)Fullstendig oppblåste formalin perfused lunger er representert av en hvit stiplet linje, (C) Underoppblåste / deflatert lunger er vist. Dette ble observert på grunn av en kompromittert lunge luftveier. Den opprinnelige oppblåste posisjonen er representert av en hvit stiplet linje, og den deflaterte posisjonen representeres av en svart stiplet linje, (D) Ujevn fylling: vaskulaturen av deler av loben forblir ufylt mens andre områder var helt fylt, (E) Ufullstendig fylling: polymerforbindelsen klarte ikke å trenge gjennom hele deler av lungene, (F) Underfylling: polymerforbindelsen klarte ikke å fylle distal vaskulatur, (G) Ruptur: pilen peker på polymerforbindelsen ekstrudert fra vaskulatur, (H) Venøs fylling: Legg merke til pilen som peker helt til arterielle segmenter helt fylt og strekker seg inn i venøssystemet. Årer og venler var av betydelig større kaliber, (I) Kateterkile: Her ble kateteret shunted inn i en arterie som hindrer vaskulaturen til høyre fliker fra å fylle helt mens venstre flik ble overfylt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Vaskulær støping og endepunkter i flere organer. (A)Nyre: det punktlige utseendet av polymerforbindelse i glomerulus gitt endepunktet. (B) Lever: Legg merke til de små fartøyene som er synlige på kantene av orgelet. (C)Mage: små fartøy var synlige og fullt utfylte. (D)Tykktarm: Små kar er lett identifiserbare og fylte. (E) Membran: muskelen her er tynn og gjennomskinnelig med små fylte fartøy tilsynelatende. (F). Hjerne: små kar var synlige i cortex. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. CT-bilder og 3D-volumgjengivelse av polymerforbindelse fylte lunger. (A)En enkelt gråskalert rekonstruert lungeskive, (B) Dette var en maksimal intensitetprojeksjon av en CT-skanning produsert av polymerfylte lunger, (C) En 3D-volumgjengivelse av den vaskulære arkaden ble generert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare (se Materials tabell). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mål arteriell vaskulær seng | Plassering av kateter | Infusjon retning | Infusjonshastighet | Notater |
| Hjernen | Thorax aorta peker kranielt | Retrograd inn i carotis | 0,05 ml/min | Kanyler thorax aorta, vend musen til utsatt posisjon, åpen hodebunn, og visuelt overvåke fremdriften av polymer gjennom skallen. |
| Membran | Venstre ventrikkel | Fortært til indre thorax, phrenic og interkostalrom | 0,05 ml/min | Åpne et vindu i siden av brystkassen, slik at mesteparten av brystkassen og membranen intakt. Cannulate venstre ventrical, klipp høyre atrium, og overvåke fremgang fra den kaudale siden av membranen. |
| Øvre lem muskulatur | Thorax aorta peker kranielt | Retrograd inn i brachiocephalic og venstre subklavian | 0,02 ml/min | For å optimalisere lemstrømmen, bind av halspulsårene og fjern lemhuden for å tillate visuell overvåking av polymertransitt i lemmuskulaturen. |
| Nyre | Thorax aorta peker caudally | Anterograde i nyrearterier | 0,05 ml/min | Den indre vaskulaturen fylles blindt. For å unngå venøs transitt, slutt å injisere når polymer er synlig i et jevnt punktatmønster over nyrene. |
| Portal System | Portal vene | Anterograde inn i portalsystemet | 0,02 ml/min | Brett leveren forsiktig opp for å eksponere portalvenen. |
| Hepatic | Thorax aorta peker caudally | Anterograde inn i leverarterien | 0,05 ml/min | Bind av portalvenen før infusjon for å unngå venøs transitt fra tarmen som strømmer inn i leveren. |
| Mage/ tarm | Thorax aorta peker caudally | Anterograde inn i cøliaki, overlegen mesenterisk og / eller dårligere mesenterisk | 0,05 ml/min | Noen regioner av tarmen leveres av flere arterier og kan fylle til forskjellige tider. For å unngå venøs transitt, bind av arterier som ikke er nødvendige for interesseområder og visuelt overvåke fremdriften av polymeren. |
| Intra-abdominal fett pads | Thorax aorta peker caudally | Anterograde men fartøyet avhenger av fett pad blir studert | 0,05 ml/min | Fett pads leveres av flere arterier og kan fylle på forskjellige tidspunkter. For å unngå venøs transitt, bind av arterier som ikke er nødvendige for presist interesseområde og visuelt overvåke fremdriften av polymeren. |
| Nedre lem muskulatur | Infrarenal aorta peker caudally | Anterograde inn i lårarteriene | 0,02 ml/min | Fjern lem hud for å tillate visuell overvåking av polymer transitt inn i lem muskulatur. |
Tabell 1. Støping av alternative vaskulære senger.
| CT-innstillinger | |
| kVp (andre medlemmer) | 90 |
| Målmateriale | Tungsten |
| Makt | 8W (andre siden 1999 |
| Filtrering | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Projeksjon Nummer | 6424 |
| Detektor størrelse | Flatskjerm CMOS - 2944 x 2352 piksler |
| Synsfelt (FOV) | 36 mm (andre enn 36 mm) |
| Voxel Størrelse | 72 μm |
| Romlig oppløsning | voxel størrelse x 1.5 |
| Anskaffelsestid | 14 min. |
| Gjenoppbygging | FBP og kommersiell algoritme |
| Binning | 1x1 (andre personer) |
Tabell 2. μCT Skanneparametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utført riktig, gir denne metoden slående bilder av lungearteriale nettverk, noe som åpner for sammenligning og eksperimentering i gnagermodeller. Flere kritiske skritt underveis sikrer suksess. Først må forskerne heparinisere dyret i det forberedende stadiet for å forhindre at blodpropper dannes i lungevaskulaturen og hjertekamrene. Dette gjør det mulig for fullstendig arteriell transitt av polymerforbindelse. For det andre, når du punkterer membranen og fjerner brystkassen, må du være forsiktig med å beskytte lungene mot utilsiktet skade, kutt eller skade. Enhver lekkasje i luftveiene vil forhindre fullstendig inflasjon og gjøre sammenligninger mellom prøvene unøyaktige. Tredje, tethering hjertet på apex hjelpemidler kateter plassering. Fjerde, bruk av en sterk vasodilator som SNP vil bistå i både fjerning av blod og fullstendig fylling av arterioler og kapillærer5,8. For det femte, når du plasserer kateteret i PAT, må du ikke begrave spissen inn i bifurcation. Dette vil føre til en ubalanse i flyten, shunting polymer sammensatte til enten venstre eller høyre side, noe som gir en ulik trykkgradient. For det sjette vil bruken av en sprøytepumpe tillate brukeren å kontrollere hastigheten og titere volumet til både musebelastning og alder. Til slutt, la hjertet / lungene være festet til resten av thoraxhulen, fest over natten og fjern neste dag. Lungene vil være godt fast og potensialet for deflasjon på grunn av utilsiktet nick under separasjon vil bli minimert.
Selv om denne metodikken oppnår de ønskede resultatene, kan alternative teknikker være nyttige for noen brukere. For å hjelpe til med plassering av kateteret, kan det benyttes en mikromanipulator. Vi valgte en versjon med en liten profil og magnetisk base for å minimere inngrep i et allerede begrenset arbeidsområde samtidig som vi gir en stabil base (hvis du bruker en magnetisk base, må du plassere en stålplate under arbeidsområdet slik at magneten kan engasjere seg). Dette gjør at brukeren nøyaktig kan plassere spissen av kateteret i PAT i en vinkel som følger arteriens naturlige bane. I tillegg er kateteret sikkert og med mindre risiko for å løsne. Et annet alternativ er bruk av en trompetert katetertips8. Selv om det ikke er trivielt å skape, er et trompetert kateter langt sikrere og mindre tilbøyelig til å skyve ut av PAT ved et uhell. Endre forholdet mellom polymer: fortynningsmiddel endrer viskositeten og hvor lett små fartøy er fylt. Avhengig av målvaskulaturen og eksperimentelle endepunkter kan dette være en verdifull vurdering. Eutanasi via CO2 kan forårsake lungeblødning hos en liten prosentandel av dyr og er belastningsavhengig22. Vurder en alternativ eutanasiprotokoll dersom dette påvirker eksperimentelle endepunkter. Ved oppblåsing av lungene, bruk av formalin hjelpemidler fiksering av orgelet på plass ved gitt trykk. En fysiologisk nøytral buffer kan erstattes dersom perifere kar må fylles i en ufast tilstand. Hvis infusjonshastighet og kontroll er av mindre betydning for et gitt eksperiment, er perfusjon for hånd også mulig. Håndinjeksjon krever praksis og sanntidsovervåking under forstørrelse for å unngå overfylling eller karbrudd8. Til slutt bør vevsmonteringen/betingelsene, skanneparametrene og minimal etterbehandling vi brukte for dette papiret, bare tjene som utgangspunkt. Ulike skannere, vev, eksperimentelle endepunkter / brukerbehov kan kreve alternative parametere.
Mens de vaskulære bildene generert fra denne teknikken er imponerende, er det begrensninger. Primært er ovennevnte metode suboptimal for måling av vaskulært kaliber på grunn av manglende evne til å overvåke og kontrollere intravaskulært trykk under infusjonen. Andre grupper har klart å håndtere disse trykkbekymringene i systemisk vaskulatur ved å overvåke kjøretrykk4,23, men slike bekymringer forsterkes ytterligere på lungesiden på grunn av de relativt tynne lungearterieveggene som er lett uenkbare med små endringer itrykk 24 og manglende evne til å nøyaktig måle og statisk kontrollere lungeinvaskulært trykk.
En annen begrensning til denne metoden er at det forblir et postmortem, enkelt timepoint eksperiment, begrense verktøyet i studier som krever virkelig fysiologiske forhold eller et tidskurs. Andre levende dyrstiltak, som CT lungeangografi (CTPA) eller kontrastforbedret μCT (CE-CT), gir mulighet for funksjonelle og morfologiske tiltak. Gjentatte skanninger /langsgående studier samt målinger på ulike punkter i hjerte/lungesyklus, kan utforskes10,,25,,26,,27,,28. Disse metodene kan brukes pålitelig, i tillegg til ekkokardiografi, for å måle arteriell kaliber. Imidlertid er både CTPA og ekkokardiografitiltak for tiden begrenset til vurderingen av den proksimale vaskulaturen. For ekkokardiogram er vurderingen begrenset til lungestammen, mens CTPA tillater tilstrekkelig beregning av grenpulmonalarteriekaliberet potensielt 1-2 bestillinger videre, men oppløsningen er begrenset, og skjuler distale deler av vaskulaturen7. Strålingsdosering er også en bekymring som bør overvåkes nøye ved bruk av CT, spesielt i multi-scan langsgåendestudier 29,30. For en av disse programmene kan μCT-utstyr, skannetid og analyseprogramvare være dyrt og kreve spesialisert opplæring av ansatte. Dyreavbildningskjerneanlegg ved enkelte institusjoner kan lette denne byrden.
Som et alternativ til denne forbindelsen, noen grupper benytter tradisjonelle korrosjon støping teknikker ledsaget av bløtvevfjerning 31,32. Disse metodene gir resultater som ligner på denne polymerforbindelsen, men sluttproduktet er sprøtt, noe som fører til potensiell artefakt15. I tillegg eliminerer fjerning av bløtvev potensialet for fremtidig histologi33. Et annet alternativ er å forlate det myke vevet intakt og utføre et oppfølgingstrinn hvor det myke vevet er "ryddet" som gjengir prøven nesten gjennomsiktig34,35. Vevsrydding gir brukeren en viss evne til å se dypere i en prøve, men i det hele tatt forblir dårligere enn μCT, da det ikke kan gi samme 3D-visualisering. Serie histologiske snitting og arraytomografi er metoder som tilbyr eksepsjonelt høy oppløsning. Selv om denne teknikken åpner døren for spennende nye muligheter, er arbeidsmengden eksponentielt høyere og ikke spesielt bidrar til storekohorter 11,12. 3D x-ray histologi er en ikke-destruktiv tilnærming som par både μCT og tradisjonell histologi eller EM36,37,38. Det tar et mer høyt nivå syn på patologi ved å bruke μCT til å globalt identifisere og nøyaktig speide områder av interesse som deretter følges opp med rutinemessig histologi39. Erstatte kontrastmidler med lavere oppløsning (eller i noen tilfeller ingen kontrast) med polymerforbindelsen i vaskulaturen kan tjene til å heve begge teknikkene når det er mulig. En annen ikke-destruktiv tilnærming som er beregningsintensiv ennå, potensielt forbedrer kontrasten, er fasehenting μCT imaging40,,41. Denne metoden kan være verdifull når den brukes på støyende data der kontrasten er svak eller ikke mulig42. Polymerforbindelsen som brukes i denne teknikken, lider imidlertid ikke av denne begrensningen. Når det er sagt, kan fasehenting være nyttig der polymerforbindelsen muligens fortynnes, for eksempel i distal vaskulatur43. Endelig har stereologi vært en standard i lunge kvantitativ strukturanalyse i år44. Den bruker tilfeldig, systematisk prøvetaking på tverrsnitt av vev for å gjøre 3D slutninger forutsatt at de valgte prøvene er tilstrekkelig representative. Mens et kraftig verktøy, det har potensial til å føre til feil og bias. Kombinere CT imaging med stereology, men holder stort løfte45.
Den skisserte metoden er relativt grei og med trening er en suksessrate på > 90% oppnåelig. Når mestret, det gjør det mulig for fullstendig og pålitelig støping av lunge vaskulatur. I fikseringsmiddel forblir vev og polymer stabil på ubestemt tid for fremtidige skanninger, potensiell histologi eller EM46,,47. Vi har vist at denne teknikken kan brukes hos dyr så unge som P1 gjennom voksen alder og tror embryonal støping, via lungearterien, er innen rekkevidde. Det bør bemerkes at denne teknikken kan brukes på nesten alle andre vaskulære senger ved ganske enkelt å endre kateterinngangspunktet og bestemme passende endepunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis støttet av NHLBI Intramural Research Program (DIR HL-006247). Vi vil gjerne takke NIH Mouse Imaging Facility for veiledning i bildeoppkjøp og analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
