Summary
والهدف من هذه التقنية هو تصور الجسم الحي السابق لشبكات الشرايين الرئوية للفئران المبكرة بعد الولادة والفئران البالغة من خلال تضخم الرئة وحقن مركب قائم على البوليمرات غير الشفافة لاسلكيًا عبر الشريان الرئوي. كما تناقش التطبيقات المحتملة للأنسجة المصبوبة.
Abstract
تشكل الأوعية الدموية شبكات معقدة في الفضاء ثلاثي الأبعاد. وبالتالي، من الصعب أن نقدر بصريا كيف تتفاعل الشبكات الوعائية والتصرف من خلال مراقبة سطح الأنسجة. توفر هذه الطريقة وسيلة لتصور بنية الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد المعقدة للرئة.
لتحقيق ذلك، يتم إدخال قسطرة في الشريان الرئوي ويتم في وقت واحد مسح الأوعية الدموية من الدم ومتوسع كيميائيا للحد من المقاومة. ثم يتم تضخيم الرئتين من خلال القصبة الهوائية في ضغط قياسي ويتم غرس مركب البوليمر في سرير الأوعية الدموية بمعدل تدفق قياسي. بمجرد ملء الشبكة الشريانية بأكملها والسماح للعلاج ، يمكن تصور الأوعية الدموية الرئة مباشرة أو صورة على ماسح ضوئي ميكرو CT (μCT).
عند تنفيذها بنجاح، يمكن للمرء أن نقدر شبكة الشرايين الرئوية في الفئران تتراوح بين أوائل سن ما بعد الولادة للبالغين. بالإضافة إلى ذلك، في حين أظهرت في السرير الشرياني الرئوي، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي سرير الأوعية الدموية مع وضع القسطرة الأمثل ونقاط النهاية.
Introduction
التركيز من هذه التقنية هو تصور بنية الشرايين الرئوية باستخدام مركب البوليمر القائم في الفئران. في حين تم تنفيذ أعمال واسعة النطاق على الأسرة الأوعية الدموية الجهازية مثل الدماغ والقلب والكلى1،2،3،4،5، تتوفر معلومات أقل فيما يتعلق بإعداد وملء شبكة الشرايين الرئوية. الهدف من هذه الدراسة، لذلك، هو التوسع في العمل السابق6،,7،,8 وتقديم مرجع مفصل مكتوب وبصري يمكن للمحققين متابعته بسهولة لإنتاج صور عالية الدقة لشجرة الشرايين الرئوية.
في حين توجد العديد من الطرق لوضع العلامات وتصوير الأوعية الدموية الرئة, مثل التصوير بالرنين المغناطيسي, صدى القلب, أو CT angiography9,10, العديد من هذه الطرائق تفشل في ملء و / أو التقاط الأوعية الصغيرة بشكل كاف, الحد من نطاق ما يمكن دراسته. توفر أساليب مثل اقسام المسلسل وإعادة الاعمار دقة عالية ولكن الوقت / العمالة الكثيفة11،12،13. سلامة الأنسجة اللينة المحيطة للخطر في صب التآكل التقليدية10،13،14،15،16. حتى عمر الحيوان وحجمه يصبحان عاملين عند محاولة إدخال قسطرة أو عدم وجود القرار. تقنية حقن البوليمر، من ناحية أخرى، يملأ الشرايين إلى مستوى الشعيرات الدموية وعندما يقترن μCT، ويسمح لقرار لا مثيل لها5. وقد تم بنجاح إلقاء عينات من الرئتين الماوس لا تتجاوز سن 14 يوم بعد الولادةومعالجتها في غضون ساعات. ويمكن إعادة النظر في هذه إلى أجل غير مسمى، أو حتى إرسالها لإعداد الأنسجة النسيجية / المجهر الإلكتروني (EM) دون المساس الأنسجة الرخوة الموجودة17. القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هي التكلفة مقدما من معدات / برامج CT، والتحديات مع مراقبة بدقة الضغط داخل الأوعية الدموية، وعدم القدرة على الحصول على البيانات طوليا في نفس الحيوان.
هذه الورقة يبني على العمل القائم لتحسين تقنية حقن الشريان الرئوي ودفع العمر / حجم الحدود ذات الصلة وصولا الى اليوم بعد الولادة 1 (P1) لتحقيق نتائج مذهلة. وهو مفيد للغاية للفرق التي ترغب في دراسة شبكات الأوعية الدموية الشريانية. وبناءً على ذلك، فإننا نقدم إرشادات جديدة لوضع القسطرة/تثبيتها، وزيادة التحكم في معدل التعبئة/الحجم، وتسليط الضوء على المزالق البارزة لزيادة نجاح الصب. ثم يمكن استخدام اللقيم الناتجة عن ذلك في التوصيف والتحليل المورفولوجي في المستقبل. ولعل الأهم من ذلك، أن هذا هو أول مظاهرة بصرية، على حد علمنا، التي تسير في المستخدم من خلال هذا الإجراء المعقد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه (ACUC) من المعهد الوطني للرئة القلب والدم.
1- الإعداد
- حقن intraperitoneally الماوس مع الهيبارين (1 وحدة / ز وزن الجسم الماوس) والسماح لها ambulate لمدة 2 دقيقة.
- القتل الرحيم الحيوان في غرفة CO2.
- ترتيب الماوس في موقف supine على لوحة جراحية وتأمين جميع الأطراف الأربعة إلى المجلس مع الشريط. استخدام التكبير لتشريح غرامة.
2. تعريض الرئتين والقصبة الهوائية
- رش الجانب البطني من الماوس مع الإيثانول 70٪ لتقليل تداخل الشعر.
- فهم جلد البطن مع ملقط وجعل شق صغير مع مقص في المنطقة السرّية. حرك نصائح المقص إلى الطبقة الفاتية بين عضلات البطن والجلد والبدء في فصل الطبقتين. العمل على نحو مُجَرّد، وإزالة الجلد من البطن، والقفص الصدري، والرقبة.
- افتح عضلات البطن بمقص وقطع بشكل جانبي على كلا الجانبين حتى يتعرض الحجاب الحاجز.
- فهم بلطف عملية xiphoid ورفع قليلا القفص الصدري تعظيم وجهة نظر الرئتين السد من خلال الحجاب الحاجز رقيقة وشبه شفافة. بعناية إجراء شق صغير في الحجاب الحاجز فقط تحت عملية xiphoid. ستنهار الرئة وتتراجع عن الحجاب الحاجز. تشريح الحجاب الحاجز بعيدا عن القفص الصدري، مع الحرص على عدم parenchyma الرئة.
- تحديد مكان وقطع الكافا السفلية (IVC) والمريء حيث تمر من خلال الحجاب الحاجز. استخدم الشاش لتنظيف أي دم متجمع في تجويف الصدر، وتجنب ملامسة الرئتين.
- فهم xiphoid مرة أخرى ورفع بلطف. قطع القفص الصدري ثنائيا (تقريبا في خط منتصف الساكس) تجنب الاتصال مع الرئتين. إزالة القفص الصدري الأمامي تماما، مما يجعل قطع النهائي على طول زاوية القصية قبل مانوبيوم.
- باستخدام حقنة مملوءة مسبقا، الرطب بتحرر الرئتين مع المالحة الفوسفات المخزنة (PBS، 7.4 pH) لمنع الجفاف. متابعة هذا الروتين خلال الإجراء.
- باستخدام ملقط، فهم مانوبيوم ورفع بلطف بعيدا عن الجسم. باستخدام مقص، وقطع 1-2 ملم الجانبي إلى مانوبيوم، وقطع الترقوة، وإزالة. هذا سيكشف الغدة الصعترية تحتها
- فهم كل فص من الغدة الصعترية، وسحب بعيدا، وإزالة. كرر هذا الإجراء مع الغدة دون المهاوية. وأخيراً، قم بإزالة الأنسجة العضلية التي تتراكب على القصبة الهوائية.
ملاحظة: بعد تشريح, القلب, الشريان الأورطي التصاعدي (AA), جذع الشريان الرئوي (بات), وينبغي أن تكون الرغامية مرئية. ضمان فروع الشرايين الأولية قبالة الجذع لا تنقسم أو المصابين.
3. السلطة الفلسطينية القسطرة وضخ الدم
- لتجميع الوحدة 1، خيط 15 سم من أنابيب PE-10 على محور إبرة 30 G وإرفاقها بحقنة 1 مل مملوءة مسبقاً بـ 10-4 M نيتروسروسسايد صوديوم (SNP) في PBS. رئيس الأنابيب عن طريق النهوض المكبس حتى يتم تطهير كل الهواء من هذه الوحدة ( الشكل 1).
تنبيه: SNP سام إذا ابتلع. تجنب ملامسة الجلد والعينين. غسل الجلد جيدا بعد المناولة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.- بدلا من ذلك، تجميع وحدة 2. بالنسبة للفئران بعد الولادة اليوم 7 (P7) والأصغر سنا، واستخدام الهيموستات لفصل إضافية 30 غ إبرة من محورها والخيط الإبرة على الطرف المفتوح من أنابيب الوحدة 1(الشكل 1).
- بدلاً من إبرة، استخدم ملقطًا حادًا منحنيًا لفهم أحد طرفي طول 10 سم من 7-0 حرير. اختراق قمة القلب دخول من جانب واحد وتمرير نصائح من ملقط من خلال العضلات والخروج من الجانب الآخر. فهم الحرير مع مجموعة أخرى من ملقط وسحب ما يقرب من 2 سم من خلال طول وربطة عنق قبالة. اتخاذ ما تبقى من نهاية 8 سم من خياطة، التجاذبات القلب caudally، وشريط نهاية المجلس الجراحي.
ملاحظة: هذا سيخلق التوتر، وزيادة تعريض الأوعية العظيمة وربط القلب في مكان، مما يسمح لوضع أسهل من القسطرة في الشريان الرئوي. - ربط نصائح من ملقط منحني تحت كل من AA وبات. سحب طول 3 سم من الحرير 7-0 مرة أخرى من خلال فتح وخلق خياطة فضفاضة رمية واحدة.
- باستخدام مقص جعل شق 1-2 ملم نحو قمة القلب، واختراق البطين الأيمن رقيقة الجدران (RV)، للسماح لإدراج القسطرة (الوحدة 1). قبل الإدراج، تأكد من عدم وجود هواء في النظام. أدخل الأنابيب المُجهزة في البطين الأيمن وتقدم بلطف إلى بات الرقيق شبه الشفاف.
- تحقق بصرياً من أن القسطرة لم تتقدم إلى أي من الفروع الرئوية اليسرى أو اليمنى ولا تُثبِت نقطة الشريان الرئوي الفرعية. باستخدام الشريط، وتأمين الجزء من أنابيب إلى المجلس الجراحي.
ملاحظة: لتحديد RV، استخدم ملقط لقرص الجانب الأيمن من القلب. على عكس البطين الأيسر، وينبغي أن يتم بسهولة استيعاب الجدار الحر رقيقة نسبيا من RV. - بالنسبة للفئران الأصغر من P7 ، قم بإرفاق الوحدة 2 بمترجم دقيق وإدخال نهاية الإبرة للوحدة في بات كما هو موضح أعلاه باستخدام المتلاعب.
- تحقق بصرياً من أن القسطرة لم تتقدم إلى أي من الفروع الرئوية اليسرى أو اليمنى ولا تُثبِت نقطة الشريان الرئوي الفرعية. باستخدام الشريط، وتأمين الجزء من أنابيب إلى المجلس الجراحي.
- تشديد بلطف خياطة فضفاضة حول كل من السفن كبيرة وقطع طول 8 سم من خياطة التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.2 لإعادة القلب إلى وضعية الراحة الطبيعية. القسطرة الآن مؤمنة بقوة داخل بات.
- قص auricle الأيسر من القلب للسماح perfusate للخروج من النظام.
- آمنة SNP التي تحتوي على حقنة (وحدة 1 أو وحدة 2، حجم تعتمد) في مضخة الحقنة و perfuse الحل بمعدل 0.05 مل / دقيقة لطرد الدم وتمدد الأوعية الدموية إلى أقصى حد. سوف يخرج الدم / perfusate عن طريق auricle قص. استمر في التسريب حتى يتم اضحة perfusate (~ 200 ميكرولتر في فأرة الكبار، أقل للحيوانات الأصغر سنا).
ملاحظة: عند الضخ اللزوجة المنخفضة PBS/SNP، تم استخدام معدل ضخ أعلى نسبيًا في مصلحة توفير الوقت. يتم غرس مركب البوليمر الأكثر لزوجة بمعدل أبطأ لمنع الملء الزائد والتمزق وتعظيم السيطرة على نقاط النهاية البعيدة.
4- غرم القصبة الهوائية وتضخم الرئة
- بناء وحدة تضخم الرئة(الشكل 2).
- توصيل البلاستيك مرنة 24 G الوريدي (IV) قسطرة (إبرة إزالة) / فراشة ضخ مجموعة إلى stopcock، تعلق على حقنة مفتوحة 50 مل (لا المكبس). اعلّق الحقنة من منصة للحلقة
- إضافة 10% buffered formalin إلى الحقنة. فتح stopcock، مما يسمح formalin لدخول أنابيب وتطهير جميع الهواء من النظام. أغلق الـ stopcock وارفع الحقنة حتى يكون الغضروف المفصلي 20 سم فوق القصبة الهوائية8.
تنبيه: الـ"أوفورمين" قابل للاشتعال، مسرطنة، سامّة بشكل حاد عند تناولها، ويسبّب تهيج الجلد، وتلفاً خطيراً للعين، وحساسية الجلد، وطفرات الخلايا الجرثومية. تجنب الابتلاع والاتصال مع الجلد والعينين. تجنب استنشاق البخار أو الضباب. الابتعاد عن مصادر الاشتعال. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- وضع اثنين من الغرز فضفاضة أدنى من الغضروف cricoid 2-4 مم عن بعضها البعض.
- باستخدام مقص، وجعل شق صغير في الرباط cricothyroid متفوقة على الغرز.
- أدخل القسطرة IV في الفتحة وتقدم الطرف وراء الغرزين الفضفاضين.
- تشديد الغرز حول القصبة الهوائية وفتح stopcock. السماح للفورمين لدخول الرئتين عن طريق الجاذبية والانتظار لمدة 5 دقائق الرئتين لتضخيم تماما. إذا كانت الرئتين تلتزم القفص الصدري أثناء التضخم، فهم خارج القفص الصدري مع ملقط مقلمة والتحرك في جميع الاتجاهات للمساعدة في تحرير الفصوص. لا تقم بالاتصال المباشر مع الرئتين.
- بعد 5 دقائق، والعودة القسطرة الرابع وراء خياطة الأولى وligate. كرر للخياطة الثانية. الرئتان الآن متضخمتان في حالة مغلقة مضغوطة.
5. صب الأوعية الدموية
- في أنبوب 1.5 مل، إعداد 1 مل من 8:1:1 حل8 من البوليمر: diluent:وكيل المعالجة وعكس بلطف عدة مرات لضمان خلط جيد.
- إزالة المكبس من حقنة 1 سم مكعب، وتغطية الطرف المقابل بإصبع قفاز، وصب مركب البوليمر في الحقنة. إعادة إدخالها بعناية المكبس، عكس، وتقدم المكبس لإزالة كل الهواء وتشكيل الغضروف المفصلي في غيض من الحقنة.
- إزالة حقنة SNP / برنامج تلفزيوني من محور الإبرة والتنقيط برنامج تلفزيوني إضافي في المحور لإنشاء الغضروف المفصلي. تحقق بعناية من محور الهواء المحاصرين، طرد إذا لزم الأمر، وإصلاح الغضروف المفصلي. الانضمام إلى مركز للحقنة مليئة مركب البوليمر.
ملاحظة: إنشاء الغضروف المفصلي على كلا الطرفين يقلل بشكل كبير من فرصة دخول الهواء إلى النظام. - إرفاق مركب البوليمر شغل حقنة إلى مضخة حقنة وضخ في 0.02 مل / دقيقة.
ملاحظة: بالنسبة للرئتين الأصغر، يمكن أن يكون معدل أبطأ مفيدًا لمنع الملء الزائد، ولكن ليس ضروريًا. - مراقبة المجمع كما يتحرك بحرية أسفل أنابيب PE ولاحظ حجم الحقنة كما يدخل بات. استمر في ملء حتى يتم ملء جميع الفصوص تماما وصولا الى مستوى الشعيرات الدموية ووقف ضخ الحقنة. تحقق من حجم الحقنة مرة أخرى.
ملاحظة: بعد عدة أشواط، يمكن استخدام وحدة تخزين مقدرة لقياس نقطة نهاية تقريبية (~ 35 ميكرولتر للماوس البالغ و5 ميكرولتر تقريبًا لجرو P1). بعد توقف المضخة، سوف يستمر الضغط المتبقي في النظام لدفع مركب البوليمر في الشرايين الرئوية. وينبغي ملء جميع فصوص الرئة بمعدل مماثل. - تغطية الرئتين مع مسح تنظيف الألياف البصرية، وتطبيق برنامج تلفزيوني بتحرر، والسماح للذبيحة للجلوس دون عائق لمدة 30-40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذه الفترة، فإن مركب البوليمر علاج وتصلب.
- إزالة القسطرة، وقطع الذراعين / النصف السفلي من الماوس، ووضع الرأس / الصدر في 50 مل مخروطية مليئة 10٪ buffered formalin بين عشية وضحاها.
- بعد التثبيت، فهم القصبة الهوائية وفصل بلطف وحدة القلب / الرئة من القفص الصدري المتبقية والصدر. وضع كتلة القلب / الرئة في قارورة متألقة مملوءة. تجاهل الباقي.
6- أسرّة الأوعية الدموية البديلة للصب (الجدول 1)
ملاحظة: قد يتطلب كل سرير من الأوعية الدموية الهدف مواضع مختلفة من القسطرة، ومعدلات التسريب، وأوقات التعبئة المثلى. وبالتالي، سوف يكون من الضروري أن يلقي عدة.
- بالنسبة للأسرّة الوعائية النظامية الأعلى أو الأدنى من الحجاب الحاجز اتبع الخطوات 1.1-2.5 كما هو أعلى. انظر ملاحظات إضافية على نظام البوابة والحجاب الحاجز (الجدول 1).
- فهم عملية xiphoid مع الهيموستات وقطع القفص الصدري ثنائيا (تقريبا في خط منتصف الساكس) قبل الشرايين الصدرية الداخلية.
- أضعاف القفص الصدري لا يزال متصلا على هذا النحو أنه يستريح على عنق الحيوان / الرأس، وفضح تماما تجويف الصدر.
- اتبع الخطوة 3.1 أعلاه، ثم إزالة الرئتين. مرة واحدة في الشريان الأورطي الصدري (TA) مرئيا، ربط نصائح من ملقط منحنية تحته، ~ 10 مم متفوقة على الحجاب الحاجز. استوعب 3 سم طول 7-0 حرير، اسحبها من خلال الفتحة تحت TA، وأنشئ خياطة فضفاضة من رمية واحدة. كرر هذا الإجراء ~ 8 مم فوق الحجاب الحاجز.
- للهياكل متفوقة على الحجاب الحاجز، استخدم مقص الربيع لخلق ثقب صغير (~ 30٪ من محيط مجموع) على الجزء البطني من TA، ~ 2 مم أدنى من خياطة فضفاضة وضعت في الخطوة 6.4.
- للهياكل أدنى من الحجاب الحاجز، بدلا من ذلك، إنشاء ثقب صغير ~ 2 مم متفوقة على الغرز فضفاضة.
- اعتمادا على حجم الحيوان، أدخل الوحدة 1 أو 2 في السفينة، تقدم وراء الغرز فضفاضة، وligate بلطف السفينة.
- اتبع الخطوة 3.7، ووضع مضخة حقنة بمعدل 1.0 مل / دقيقة وضخ ما لا يقل عن 5 مل. سيتم الخروج Perfusate عبر IVC.
- اتبع الخطوات 5.1 - 5.4 ضبط معدل التسريب إلى 0.05 مل / دقيقة، ورصد بصريا الأنسجة المستهدفة في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: سيكون حجم التسريب من عمر العضو والحيوان محددًا. يمكن أن يكون حجم أكثر محدودية من قبل ربط فروع الشرايين مما يؤدي إلى الأسرة الوعائية غير المستهدفة (أي الدماغ والكبد والكلى والأمعاء). - اتبع 5.6 ثم إزالة الأنسجة المستهدفة ومكان في formalin.
7. عينة جبل، والمسح الضوئي، وإعادة الإعمار لmicro-CT
- باستخدام فيلم البارافين، إنشاء سطح مستو على السرير المسح ومركز العينة الرطبة على هذا السطح (الشكل 3A).
ملاحظة: إذا تم الكشف عن الحركة أثرية، قد تتطلب العينة المزيد من التثبيت. - خيمة طفيفة / عينة تغطية مع فيلم البارافين إضافية لمنع الجفاف. خذ عناية خاصة بعدم بقية فيلم البارافين على العينة مما تسبب في تشوه الأنسجة (الشكل 3B).
- مسح العينة باستخدام الإعدادات الموضحة في الجدول 2 وتوحيد هذه المعلمات ضمن تجربة معينة.
ملاحظة: هذا هو التجربة/نقطة النهاية التابعة. توحيد المعلمات المختارة لسهولة المقارنة بين العينات. - نقل عمليات المسح المعاد بناؤها للمعالجة والتحليل اللاحق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سوف يلقي ناجحة يحمل ملء موحدة من شبكة الشرايين الرئوية بأكملها. ونحن نبرهن على ذلك في الفئران C57Bl/6J تتراوح في العمر: P90 يوم ما بعد الولادة (الشكل 4A) ، P30 (الشكل 4B) P7 (الشكل 4C) ، P1 (الشكل 4D). من خلال التحكم في معدل التدفق ومراقبة بصريا ملء في الوقت الحقيقي، تحققت نقاط النهاية موثوق بها من الأوعية الدموية الأكثر رقة(الشكل 5A).
وتشمل التحديات الشائعة تلف الرئتين، والتعبئة غير المكتملة، والملء، أو الملء الزائد، والتحوط من القسطرة، وحجم الحيوان.
إذا كان هناك ضرر في الرئة / مجرى الهواء، فإن التسريبات الصغيرة تمنع الرئتين من الضغط(الشكل 5B،C). وفي غياب التضخم الكامل، يصبح من الصعب إجراء مقارنات كمية و مكانية دقيقة عبر العينات. لتقليل خطر الإصابة بالرئتين، تجنب قطع عن كثب إلى الرئتين عند إزالة القفص الصدري والحفاظ على الرئة رطبة مع برنامج تلفزيوني طوال العملية لتجنب الجفاف والالتزام بالهياكل المحيطة. إذا كان الفص يتمسك القفص الصدري أثناء التضخم ، فهم بلطف خارج القفص الصدري (بعيدا عن الرئة) مع ملقط ونقله في اتجاه لتحرير الفصوص. بدلا من ذلك، يمكن استخدام أداة حادة، مثل ملعقة، مع حافة ناعمة لرفع أو دفع الرئة تضخم بعيدا عن القفص الصدري. عند تضخيم الرئتين، الالتزام ببارامترات الضغط المقترحة وتجنب التضخم المفرط لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تمزق مجرى الهواء. وأخيراً، لا تقم بإزالة الرئتين من تجويف الصدر حتى يكتمل التثبيت. وينبغي إزالة القصبة الهوائية والرئتين والقلب في كتلة من الأجزاء المتبقية من تجويف الصدر.
غير مكتمل (الشكل 5D) أو غير كاملة (الشكل 5E) يمكن أن تنشأ التعبئة من "قفل الهواء" ، حيث يتم إدخال الهواء في نظام الأوعية الدموية عن طريق القسطرة ، ومنع تدفق المصب للمجمع. لتقليل فرصة قفل الهواء، يقظة تطهير الهواء من طرف القسطرة قبل الإدراج (الخطوة 3.4) وأثناء انتقال حقنة من SNP / برنامج تلفزيوني إلى مركب البوليمر. إذا كان ملء لا يزال غير مكتمل أو غير مكتملة، فإنه يمكن أن يكون مؤشرا على زيادة مقاومة الأوعية الدموية نتيجة لتضيق الجزء البؤري / طويل أو tortuosity. يمكن أن تؤدي الجلطات الدموية أيضًا إلى ملء غير مكتمل ويتم تجنبها بسهولة باستخدام الهيبارين قبل الإجراء.
سوف حجم الحقن غير لائق يؤدي إلى underfilling أو التعبئة. يحدث Underfilling عندما يتم إدخال القليل جدا من مركب في الأوعية الدموية(الشكل 5F). بدلا من ذلك، الملء الزائد، أو إدخال الكثير من مركب البوليمر بسرعة كبيرة جدا يمكن أن يسبب إما تمزق الشرايين(الشكل 5G)أو، أكثر شيوعا، العبور الوريدي(الشكل 5H). ويمكن تخفيف كل من المشاكل باستخدام مضخة حقنة. يجب على المحققين الالتزام بعناية بالمعدل المقترح والقيود المفروضة على الحجم أو تحديد معدلاتهم الخاصة بناء على نموذجهم المحدد والاستفادة من أمثلتهم. إن مراقبة تسريب مركب البوليمر في الوقت الحقيقي تحت التكبير أمر بالغ الأهمية، وينبغي استخدام ملء الشرايين الصغيرة/الشعيرات الدموية كنقطة نهاية.
يمكن أن يؤدي تقدم القسطرة بعيداً جداً إلى أسفل الجذع الرئوي إلى حدوث دقّة في فرع شريان رئوي واحد وخلق خلل في التدفق. ونتيجة لذلك، يملأ أحد الجانبين أسرع من الآخر(الشكل 5I)،مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى الملء الزائد في رئة واحدة والملء في الرئة الأخرى. في حين أن القسطرة التحوط هو السبب الأكثر احتمالا في هذا السيناريو، "قفل الهواء" وعدم وجود الهيبارين يمكن أيضا أن تكون العوامل المساهمة.
وأخيرا، فإن الحيوانات الصغيرة تقدم مجموعة خاصة بها من العقبات الإضافية. الحيوانات الأصغر سنا الطلب أيدي ثابتة والأخطاء الصغيرة هي أقل تسامحا. الأدوات عالية الجودة، والمصممة خصيصا للجراحة المجهرية، تصبح أكثر أهمية في نقاط ما بعد الولادة المبكرة. استخدام ميكرومانيبولاتور يساعد كثيرا في وضع ليس فقط ولكن منع خلع القسطرة. ومن الضروري أيضا استخدام مضخة الحقن على الحيوانات الصغيرة للتحكم بدقة وإدارة نقاط النهاية.
في حين تبين على وجه التحديد الأوعية الدموية الرئوية، يمكن بسهولة تطبيق هذا الإجراء على الأسرة الأوعية الدموية المستهدفة النظامية كذلك(الجدول 1). وبالإضافة إلى التحديات المذكورة أعلاه، فإن اختيار نقطة الدخول الصحيحة أمر بالغ الأهمية. الصب عن طريق الشريان الأورطي الصدري تنتج نتائج ممتازة لمعظم الأسرة الوعائية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن إدخال القسطرة كحجم قريب إلى الموقع المستهدف قدر الإمكان، واللبل غير الهدف من أوعية الأوعية يساعد في التحكم في التدفق والسيطرة على مستوى الصوت. هذه التحسينات جنبا إلى جنب مع الرصد المباشر المناسب من نقاط النهاية الأوعية الدموية (الشكل 6A-F) ومعدلات التسريب القياسية تحسين التعبئة. يتواجد كثير أمثلة من هذا صب طرق في الأدب وكثيرة أيضا ل يرجع كاملة. ومع ذلك، يمكن العثور على تفاصيل إضافية في نص محدد الجهاز مثل هذه4،,5،,7،,18،,19،,20،,21.
بعد الصب، يمكن معالجة العينات لمسح ميكروت (الشكل 7A،B). للمعالجة اللاحقة، حزمة البرمجيات التجارية (انظر جدول المواد)أنتجت حجم 3D تقديم شجرة الأوعية الدموية الرئوية المقدمة كصور ثابتة (الشكل 7C)، أو الأفلام. ويمكن أيضا إجراء مزيد من التحليلات الإحصائية استكشاف خصائص الأوعية الدموية مثل طول الجزء وعدد، tortuosity، النظام (جيل أو رتبة)، وحجم، وطول الممرات. بالإضافة إلى المسح الضوئي للميكCT، يمكن أيضا مسح العينات المصبوبة للحصول على صور إجمالية أو معالجتها وقطع للتحليل النسيجي8.
الشكل 1: القسطرة وإعداد إبرة. وتظهر المحاقن مع الأنابيب والإبر المرفقة (Unit1 و Unit2). Inset: إغلاق الإبرة والأنابيب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد تضخم الرئة. موقف حلقة، المشبك، حقنة مليئة بالفورمينين، والأنابيب مع القسطرة المرفقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصغرى CT عينة إعداد قبل المسح الضوئي. (A)هنا تم تمركز العينة على قاعدة فيلم البارافين، (B) هنا تركزت العينة وغطت على قاعدة البارا فيلم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الرئتين التي يلقيها الأوعية الدموية في مراحل النمو متفاوتة من 3 أشهر إلى 1 يوم من العمر. عرض الظهري للرئتين، (A) P90، (B) P30، (C) P7، و (D) P1 الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة على التعبئة المثالية والأخطاء الشائعة أثناء ضخ مركب البوليمر. (A)عندما تم الوصول إلى نقطة النهاية للتعبئة ، لوحظت شبكة قوية وغرامة الأوعية الدموية. (ب) يتم تمثيل رئتين نفخ بشكل كامل من قبل خط أبيض متقطع،(C) تظهر الرئتين المنتفخة/المنتفخة. وقد لوحظ هذا بسبب اختراق مجرى الهواء الرئوي. يتم تمثيل الموقف الأصلي المتضخم بخط أبيض متقطع ويتم تمثيل الموقف المجزئ بخط أسود منقط ، (D) ملء غير مكتمل: لا تزال الأوعية الدموية لأجزاء من الفص شاغرة بينما كانت مناطق أخرى ممتلئة تمامًا ، (E) ملء غير مكتمل: فشل مركب البوليمر في اختراق أجزاء كاملة من الرئة ، (F) Underfilling : فشل مركب البوليمر في ملء الأوعية الدموية البعيدة ، (G) التمزق: يشير السهم إلى مركب البوليمر مقذوف من الأوعية الدموية ،( H) Venous filling : لاحظ السهم الذي يشير إلى الأجزاء الشريانية المملوءة بالكامل وتمتد إلى النظام الوريدي. كانت الأوردة والزهرة من عيار أكبر بكثير ، (I) إسفين القسطرة: هنا تم تحويل القسطرة إلى شريان واحد يمنع الأوعية الدموية من الفصوص اليمنى من الملء تمامًا بينما كان الفص الأيسر ممتلئًا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 الصب الوعائي ونقاط النهاية في أجهزة إضافية. (أ)الكلى: مظهر منقطة من مركب البوليمر في كبيباتولس قدمت نقطة النهاية. (ب) الكبد: لاحظ الأوعية الصغيرة المرئية على حواف الجهاز. (C) المعدة: كانت السفن الصغيرة مرئية ومليئة بالكامل. (D) الأمعاء الغليظة: يمكن التعرف على السفن الصغيرة بسهولة وملئها. (E) الحجاب الحاجز: العضلات هنا رقيقة وشفافة مع السفن الصغيرة شغل واضح. (F).الدماغ: كانت الأوعية الصغيرة مرئية في القشرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7 صور CT و 3D حجم جعل من بوليمر مركب شغل الرئتين. ( A) واحد رمادي الحجم شريحة الرئة المعاد بناؤها، (B) وكان هذا الإسقاط كثافة القصوى من الأشعة المقطعية المنتجة من الرئتين شغل البوليمر، (C) تم إنشاء حجم 3D جعل الممرات الأوعية الدموية باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الهدف سرير الأوعية الدموية الشريانية | وضع القسطرة | اتجاه التسريب | معدل التسريب | تلاحظ |
| الدماغ | الشريان الأورطي الصدري مشيرا كرانيايلي | الرجعية في السباتي | .05ml / دقيقة | Cannulate الشريان الأبهر الصدري، الوجه الماوس إلى موقف عرضة، فروة الرأس مفتوحة، ورصد بصريا التقدم المحرز في البوليمر من خلال الجمجمة. |
| الحجاب الحاجز | الجانب الأيسر من الجانب البطيني | Anterograde في الصدر الداخلي، والفينية، وال intercostal | .05ml / دقيقة | فتح نافذة في جانب القفص الصدري، وترك غالبية القفص الصدري والحجاب الحاجز سليمة. Cannulate البطين الأيسر، مقطع الأذين الأيمن، ورصد التقدم من الجانب السدالي من الحجاب الحاجز. |
| عضلات الأطراف العلوية | الشريان الأورطي الصدري مشيرا كرانيايلي | التراجع في brachiocephalic وترك subclavian | .02ml / دقيقة | لتحسين تدفق الأطراف، التعادل قبالة الشرايين السباتي وإزالة الجلد الطرف للسماح للرصد البصرية من البوليمر العبور في العضلات الطرف. |
| الكلي | الشريان الأورطي الصدري مشيرا caudally | Anterograde في الشرايين الكلوية | .05ml / دقيقة | يتم ملء الأوعية الدموية الداخلية بشكل أعمى. لتجنب العبور الوريدي، توقف عن الحقن عندما يكون البوليمر مرئيًا في نمط منتظم من الدقات عبر الكلى. |
| نظام البوابة | الوريد المدخل | Anterograde في نظام البوابة | .02ml / دقيقة | أضعاف بلطف الكبد حتى لفضح الوريد المدخل. |
| الكبدي | الشريان الأورطي الصدري مشيرا caudally | Anterograde في الشريان الكبدي | .05ml / دقيقة | التعادل قبالة الوريد المدخل قبل التسريب لتجنب العبور الوريدي من الأمعاء المتدفقة إلى الكبد. |
| المعدة / الأمعاء | الشريان الأورطي الصدري مشيرا caudally | Anterograde في الاضطرابات الهضمية ، متيرقة متفوقة و / أو أدنى mesenteric | .05ml / دقيقة | يتم توفير بعض المناطق من الأمعاء من قبل شرايين متعددة، ويمكن أن تملأ في أوقات مختلفة. لتجنب العبور الوريدي، ربط الشرايين غير المطلوبة للمناطق ذات الاهتمام ورصد بصريا التقدم المحرز في البوليمر. |
| منصات الدهون داخل البطن | الشريان الأورطي الصدري مشيرا caudally | Anterograde ولكن السفينة تعتمد على وسادة الدهون التي يجري دراستها | .05ml / دقيقة | يتم توفير منصات الدهون من قبل الشرايين متعددة، ويمكن أن تملأ في أوقات مختلفة. لتجنب العبور الوريدي، ربط الشرايين غير المطلوبة لمنطقة محددة من الاهتمام ورصد بصريا التقدم المحرز في البوليمر. |
| عضلات الأطراف السفلية | الشريان الأورطي إينفرارينا يشير caudally | Anterograde في الشرايين الفخذية | .02ml / دقيقة | إزالة جلد الأطراف للسماح للرصد البصرية من البوليمر العبور في عضلات الأطراف. |
الجدول 1- الانبعاثات 1000 صب الأسرة الوعائية البديلة.
| إعدادات CT | |
| kVp | 90 |
| المواد الهدف | التنغستن |
| السلطه | 8 وات |
| الترشيح | Cu 0.06 مم + آل 0.5 مم |
| رقم الإسقاط | 6424 |
| حجم الكاشف | لوحة مسطحة CMOS - 2944 × 2352 بكسل |
| مجال الرؤية (FOV) | 36 ملم |
| حجم فوكسيل | 72 ميكرومتر |
| دقة المكان | حجم voxel × 1.5 |
| وقت الاستحواذ | 14 دقيقة |
| اعاده الاعمار | FBP والخوارزميات التجارية |
| بينينغ | 1x1 |
الجدول 2- μCT المعلمات المسح الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تنفيذ هذه الطريقة بشكل صحيح ، وتسفر عن صور مذهلة لشبكات الشرايين الرئوية ، مما يسمح بالمقارنة والتجريب في نماذج القوارض. العديد من الخطوات الحاسمة على طول الطريق ضمان النجاح. أولاً، يجب على المحققين تهشيع الحيوان في المرحلة التحضيرية لمنع جلطات الدم من التشكل في الأوعية الدموية الرئوية وغرف القلب. وهذا يسمح لعبور الشريان الكامل لمركب البوليمر. ثانياً، عند ثقب الحجاب الحاجز وإزالة القفص الصدري، احرص على حماية الرئتين من التلف غير المقصود أو الجروح أو الإصابة. أي تسرب في مجرى الهواء سيمنع التضخم الكامل ويجعل المقارنات بين العينات غير دقيقة. ثالثاً، ربط القلب في قمة الإيدز وضع القسطرة. رابعا ، استخدام توسع الأوعية قوية مثل SNP سوف تساعد في كل من إزالة الدم وملء كاملة من الشرايين والشعيراتالدموية 5،8. خامساً، عند وضع القسطرة في بات، الحرص على عدم دفن طرف في التشعب. وهذا سوف يسبب خللا في التدفق، تحويل مركب البوليمر إلى الجانب الأيسر أو الأيمن، مما يؤدي إلى التدرج ضغط غير متكافئ. سادسا ، واستخدام مضخة حقنة تسمح للمستخدم للسيطرة على معدل وتكيتر حجم كل من سلالة الماوس والعمر. وأخيرا، ترك القلب / الرئتين تعلق على ما تبقى من تجويف الصدر، وإصلاح بين عشية وضحاها، وإزالة في اليوم التالي. وسوف تكون ثابتة بشكل جيد الرئتين، وسوف يقلل احتمال حدوث انكماش بسبب الشقوق عرضي أثناء الفصل.
وفي حين أن هذه المنهجية تحقق النتائج المرجوة، فإن التقنيات البديلة قد تكون مفيدة لبعض المستخدمين. للمساعدة في وضع القسطرة ، قد يتم استخدام ميكرومانبولاتور. اخترنا نسخة مع لمحة صغيرة وقاعدة مغناطيسية لتقليل التعدي في منطقة عمل محدودة بالفعل مع توفير قاعدة مستقرة (إذا كان استخدام قاعدة مغناطيسية تأكد من وضع لوحة من الصلب تحت مساحة العمل للسماح للمغناطيس للمشاركة). وهذا يسمح للمستخدم لوضع بالضبط غيض من القسطرة في بات في زاوية تتبع المسار الطبيعي للشريان. بالإضافة إلى ذلك، القسطرة آمنة وأقل عرضة لخطر طرد. خيار آخر هو استخدام بقطرة بوق تلميح8. في حين لا تافهة لخلق، قسطرة بوق هو أكثر أمنا بكثير وأقل ميلا إلى الانزلاق بطريق الخطأ للخروج من بات. تغيير نسبة البوليمر:diluent يغير اللزوجة وسهولة التي تمتلئ السفن الصغيرة. اعتمادا على vasculature المستهدفة والنقاط النهائية التجريبية وهذا يمكن أن يكون اعتبارا قيما. القتل الرحيم عن طريق CO2 قد يسبب نزيف رئوي في نسبة صغيرة من الحيوانات و هي سلالة تعتمد22. النظر في بروتوكول القتل الرحيم البديل إذا كان هذا التأثير على نقاط النهاية التجريبية. عند تضخيم الرئتين، واستخدام تثبيت الإيدز الشكلي للجهاز في مكان في الضغط المعطى. ويمكن استبدال عازلة محايدة من الناحية الفسيولوجية ينبغي أن السفن الطرفية تحتاج إلى شغلها في حالة غير مثبت. إذا كان معدل التسريب والسيطرة أقل أهمية لتجربة معينة ، فإن التسريب باليد ممكن أيضًا. حقن اليد يتطلب ممارسة ورصد في الوقت الحقيقي تحت التكبير لتجنب الملء الزائد أو تمزق السفينة8. وأخيراً، فإن تركيب الأنسجة/ظروفها، وبارامترات المسح الضوئي، والحد الأدنى من المعالجة اللاحقة التي استخدمناها لهذه الورقة ينبغي أن تكون مجرد نقطة انطلاق. قد تتطلب الماسحات الضوئية المختلفة والأنسجة ونقاط النهاية التجريبية/احتياجات المستخدم معلمات بديلة.
في حين أن الصور الوعائية التي تم إنشاؤها من هذه التقنية مثيرة للإعجاب ، هناك قيود. في المقام الأول ، فإن الطريقة المذكورة أعلاه هي دون المستوى الأمثل لقياس العيار الوعائي بسبب عدم القدرة على مراقبة والتحكم في الضغط داخل الأوعية الدموية أثناء التسريب. تمكنت مجموعات أخرى إلى حد ما من معالجة هذه المخاوف الضغط في الأوعية الدموية الجهازية من خلال مراقبة ضغط القيادة4،23، ومع ذلك ، يتم تضخيم هذه المخاوف بشكل أكبر على الجانب الرئوي بسبب جدران الشرايين الرئوية الرقيقة نسبيًا التي يمكن دحضها بسهولة مع التغيرات الصغيرة في الضغوط24 وعدم القدرة على قياس الضغط داخل الأوعية الرئوية والتحكم فيه بشكل ثابت.
وهناك قيد ثان على هذا الأسلوب هو أنه لا يزال بعد الوفاة ، وتجربة نقطة زمنية واحدة ، والحد من فائدتها في الدراسات التي تتطلب ظروف فسيولوجية حقا أو دورة زمنية. وتوفر تدابير الحيوانات الحية الأخرى، مثل تصوير الأوعية الرئوية المقطعية (CT) أو الميكCT المعزز على التباين (CE-CT) إمكانية اتخاذ تدابير وظيفية وتدابير كهربية. يمكن استكشاف عمليات المسح المتكررة / الدراسات الطولية وكذلك القياسات في نقاط مختلفة في دورة القلب / الرئة ،10،25،26،27،28. يمكن استخدام هذه الطرق بشكل موثوق ، بالإضافة إلى تخطيط صدى القلب ، لقياس العيار الشرياني. ومع ذلك، فإن كل من تدابير CTPA و قياس صدى القلب تقتصر حاليا على تقييم الأوعية الدموية القريبة. لتخطيط صدى القلب ، يقتصر التقييم على الجذع الرئوي بينما يسمح CTPA بحساب كافٍ لعيار الشريان الرئوي الفرعي المحتمل 1-2 أوامر أخرى ، ولكن القرار محدود ، مما يحجب أجزاءً من الأوعيةالدموية 7. الجرعة الإشعاعية هو أيضا مصدر قلق ينبغي رصدها بعناية عند استخدام CT خصوصا في الدراسات الطولية متعددة المسحالضوئي 29,30. بالنسبة لأي من هذه التطبيقات، قد تكون معدات ميكروت، ووقت المسح الضوئي، وبرامج التحليل باهظة الثمن وتتطلب تدريبًا متخصصًا من الموظفين. وقد تخفف المرافق الأساسية لتصوير الحيوانات في بعض المؤسسات من هذا العبء.
كبديل لهذا المركب، بعض المجموعات استخدام تقنيات الصب التآكل التقليدية يرافقه إزالة الأنسجة اللينة31،32. هذه الأساليب تعطي نتائج مماثلة لهذا المركب البوليمر، ولكن المنتج النهائي هش، مما يؤدي إلى التحف المحتملة15. وبالإضافة إلى ذلك، وإزالة الأنسجة الرخوة يزيل احتمال الانتمولوجيا المستقبلية33. خيار آخر هو ترك الأنسجة الرخوة سليمة وتنفيذ خطوة متابعة حيث يتم "مسح" الأنسجة الرخوة مما يجعل العينة شفافة تقريبا34،35. تنظيف الأنسجة يعطي المستخدم بعض القدرة على رؤية أعمق داخل عينة ولكن، على العموم، لا يزال أقل شأنا من μCT لأنه لا يمكن أن توفر نفس التصور 3D. إن الاحتياح التسلسلية والقطع المقطعي للصفيف هي أساليب توفر دقة عالية بشكل استثنائي. في حين أن هذه التقنية تفتح الباب أمام إمكانيات جديدة مثيرة ، فإن عبء العمل أعلى أضعافا مضاعفة وليس مواتيا بشكل خاص للأفواج الكبيرة11،12. 3D الأشعة السينية هو نهج غير المدمرة التي الأزواج على حد سواء μCT وعلم الأنسجة التقليدية أو حتى م36,37,38. فإنه يأخذ نظرة أكثر مستوى عال من علم الأمراض من خلال استخدام μCT لتحديد المناطق ذات الاهتمام بدقة والكشفية على الصعيد العالمي والتي تتم بعد ذلك متابعة مع علم الأنسجة الروتينية39. قد يؤدي استبدال عوامل التباين الأقل دقة (أو في بعض الحالات عدم وجود تباين) مع مركب البوليمر إلى الأوعية الدموية إلى رفع كلا التقنيتين عندما يكون ذلك ممكنًا. نهج آخر غير المدمرة التي هي مكثفة حسابيا حتى الآن، يحتمل أن يعزز التباين، هو المرحلة استرجاع μCT التصوير40،41. يمكن أن تكون هذه الطريقة ذات قيمة عند استخدامها على البيانات صاخبة حيث التباين ضعيفة أو غير ممكن42. ومع ذلك، فإن مركب البوليمر المستخدم في هذه التقنية لا يعاني من هذا القيد. مع ذلك ، قد يكون من المفيد استرداد المرحلة حيث ربما يتم تخفيف مركب البوليمر ، على سبيل المثال في الأوعية الدموية43. وأخيرا، stereology كان معيارا في تحليل الرئة الكمية الهيكلية لسنوات44. ويستخدم العينات العشوائية والمنهجية على أجزاء عرضية من الأنسجة لجعل الاستدلالات ثلاثية الأبعاد على افتراض أن العينات المختارة هي تمثيلية بما فيه الكفاية. في حين أن أداة قوية ، فإنه يمكن أن يؤدي إلى الخطأ والتحيز. الجمع بين التصوير المقطعي مع stereology، ومع ذلك، يحمل وعدا كبيرا45.
الأسلوب المبين هو بسيط نسبيا، مع التدريب نسبة نجاح من > 90٪ هو قابل للتحقيق. يتقن مرة واحدة، فإنه يسمح للصب كاملة وموثوق بها من الأوعية الدموية الرئة. في التثبيت، والأنسجة والبوليمر تبقى مستقرة إلى أجل غير مسمى لمسح المستقبل، الأنسجة المحتملة، أو م46،47. لقد أظهرنا أن هذه التقنية يمكن استخدامها في لا تتجاوز P1 خلال مرحلة البلوغ ونعتقد أن الصب الجنيني ، عبر الشريان الرئوي ، هو في متناول اليد. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية يمكن تطبيقها على أي سرير الأوعية الدموية الأخرى عن طريق مجرد تغيير نقطة دخول القسطرة وتحديد نقاط النهاية المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفونه
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث داخل الثقافات (DIR HL-006247). نود أن نشكر مرفق التصوير بالماوس NIH على التوجيه في الحصول على الصور وتحليلها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
