Summary
El objetivo de esta técnica es la visualización ex vivo de redes arteriales pulmonares de ratones postnatales y adultos tempranos a través de la inflación pulmonar y la inyección de un compuesto radioopaco a base de polímeros a través de la arteria pulmonar. También se discuten las posibles aplicaciones para los tejidos fundidos.
Abstract
Los vasos sanguíneos forman redes intrincadas en el espacio tridimensional. Por lo tanto, es difícil apreciar visualmente cómo interactúan y se comportan las redes vasculares observando la superficie de un tejido. Este método proporciona un medio para visualizar la compleja arquitectura vascular tridimensional del pulmón.
Para lograr esto, se inserta un catéter en la arteria pulmonar y la vasculatura se enjuaga simultáneamente de sangre y se dilata químicamente para limitar la resistencia. Los pulmones se inflan a través de la tráquea a una presión estándar y el compuesto del polímero se infunde en el lecho vascular a un caudal estándar. Una vez que toda la red arterial se llena y se le permite curar, la vasculatura pulmonar puede visualizarse directamente o ser imagen en un escáner de micro-CT .
Cuando se realiza con éxito, se puede apreciar la red arterial pulmonar en ratones que van desde edades posnatales tempranas hasta adultos. Además, mientras se demuestra en el lecho arterial pulmonar, este método se puede aplicar a cualquier lecho vascular con la colocación optimizada del catéter y puntos finales.
Introduction
El enfoque de esta técnica es la visualización de la arquitectura arterial pulmonar utilizando un compuesto a base de polímeros en ratones. Si bien se ha realizado un trabajo extenso en lechos vasculares sistémicos como el cerebro, el corazón y los riñones1,2,3,4,5, se dispone de menos información sobre la preparación y llenado de la red arterial pulmonar. El objetivo de este estudio, por lo tanto, es ampliar el trabajo anterior6,7,8 y proporcionar una referencia detallada escrita y visual que los investigadores pueden seguir fácilmente para producir imágenes de alta resolución del árbol arterial pulmonar.
Si bien existen numerosos métodos para etiquetar y tomar imágenes de vasculatura pulmonar, como la resonancia magnética, la ecocardiografía o la angiografía por TC9,10, muchas de estas modalidades no logran llenar y/o capturar adecuadamente los vasos pequeños, lo que limita el alcance de lo que se puede estudiar. Métodos tales como sección en serie y reconstrucción proporcionan alta resolución, pero son intensivos en tiempo/trabajo11,12,13. La integridad de los tejidos blandos circundantes se ve comprometida en la fundición de corrosión tradicional10,13,14,15,16. Incluso la edad y el tamaño de los animales se convierten en factores al intentar introducir un catéter o, la resolución es deficiente. La técnica de inyección de polímero, por otro lado, llena las arterias al nivel capilar y cuando se combina con el TCT, permite una resolución sin igual5. Las muestras de los pulmones de ratón tan jóvenes como el día 14 postnatal se han echado con éxito8 y se han procesado en cuestión de horas. Estos pueden ser reencaneados indefinidamente, o incluso enviados para preparación histológica / microscopía electrónica (EM) sin comprometer el tejido blando existente17. Las principales limitaciones de este método son el costo inicial de los equipos/software de TC, los desafíos con el monitoreo preciso de la presión intravascular y la incapacidad de adquirir datos longitudinalmente en el mismo animal.
Este documento se basa en el trabajo existente para optimizar aún más la técnica de inyección de la arteria pulmonar y empujar los límites relacionados con la edad/tamaño hasta el día posnatal 1 (P1) para producir resultados sorprendentes. Es más útil para los equipos que quieren estudiar redes vasculares arteriales. En consecuencia, proporcionamos nuevas directrices para la colocación/estabilización del catéter, un mayor control sobre la tasa de llenado/volumen y destacamos los notables escollos para un mayor éxito de fundición. Los moldes resultantes se pueden utilizar para futuras caracterizaciones y análisis morfológicos. Tal vez lo más importante, esta es la primera demostración visual, a nuestro conocimiento, que guía al usuario a través de este intrincado procedimiento.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (ACUC) del Instituto Nacional de Pulmón Cardíaco y Sangre.
1. Preparación
- Inyecte el ratón por vía intraperitoneal con heparina (1 unidad/g de peso corporal del ratón) y permita que se ambula durante 2 min.
- Eutanasia al animal en una cámara deCO2.
- Coloque el ratón en una posición supina en una placa quirúrgica y asegure las cuatro extremidades a la placa con cinta adhesiva. Utilice la ampliación para la disección fina.
2. Exposición de pulmones y tráquea
- Rocíe el lado ventral del ratón con 70% de etanol para minimizar la interferencia del cabello.
- Agarre la piel abdominal con fórceps y haga una pequeña incisión con tijeras en la región umbilical. Deslice las puntas de las tijeras en la capa fascial entre la musculatura abdominal y la piel y comience a separar las dos capas. Trabaje rostralmente, eliminando la piel del abdomen, la caja torácica y el cuello.
- Abra la musculatura abdominal con tijeras y corte lateralmente en ambos lados hasta que el diafragma quede expuesto.
- Sujete suavemente el proceso de xifoide y levante ligeramente la caja torácica maximizando la vista de los pulmones caudales a través del diafragma delgado y semitransparente. Haga cuidadosamente una pequeña incisión en el diafragma justo debajo del proceso de xifoide. Los pulmones colapsarán y se alejarán del diafragma. Diseccionar el diafragma lejos de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar el parénquima pulmonar.
- Localice y corta la vena cava inferior (IVC) y el esófago por donde pasan a través del diafragma. Use gasas para limpiar cualquier acumulación de sangre en la cavidad torácica, evitando el contacto con los pulmones.
- Sujete el xifoide una vez más y levante suavemente. Cortar la caja torácica bilateralmente (aproximadamente en la línea axilar media) evitando el contacto con los pulmones. Retire la caja torácica anterior por completo, haciendo el corte final a lo largo del ángulo esternal justo antes del manubrio.
- Usando una jeringa precargada, humedezca liberalmente los pulmones con solución salina tamponada por fosfato (PBS, pH 7.4) para evitar el secado. Continúe con esta rutina durante todo el procedimiento.
- Usando fórceps, agarre el manubrio y aléjese suavemente del cuerpo. Usando tijeras, corte 1-2 mm lateralmente al manubrio, cortando las clavículas y retírelas. Esto expondrá el timo debajo.
- Agarre cada lóbulo del timo, tire de separarse y retírelo. Repita este procedimiento con la glándula submandibular. Finalmente, retire el tejido muscular superponiendo la tráquea.
NOTA: Después de la disección, el corazón, la aorta ascendente (AA), el tronco arterial pulmonar (PAT) y la tráquea deben ser visibles. Asegúrese de que las ramas arteriales primarias del tronco no estén divididas ni lesionadas.
3. Cateterismo PA y perfusión de sangre
- Para montar la unidad 1, enhebrar 15 cm de tubo PE-10 en el cubo de una aguja de 30 G y fijar a una jeringa de 1 ml precargada con nitroprusido sódico (SNP)de 10 -4 M en PBS. En primer lugar, el tubo avanzando el émbolo hasta que se purgue todo el aire de esta unidad (Figura 1).
ADVERTENCIA: SNP es tóxico si se ingiere. Evite el contacto con la piel y los ojos. Lávese bien la piel después de manipularla. Use el equipo de protección personal adecuado.- Alternativamente, monte la unidad 2. Para ratones del día 7 (P7) y menores, utilice un hemostat para separar una aguja adicional de 30 G de su cubo e enhebrar la aguja en el extremo abierto del tubo de la Unidad 1 (Figura 1).
- En lugar de una aguja, utilice fórceps afilados curvados para agarrar un extremo de una longitud de 10 cm de seda de 7-0. Penetra el ápice del corazón entrando por un lado y pasando las puntas de los fórceps a través del músculo y fuera del otro lado. Sujete la seda con otro conjunto de fórceps y tire de aproximadamente 2 cm de longitud a través y atar. Tome el extremo restante de 8 cm de la sutura, tirando del corazón caudalmente, y pegue el extremo de la placa quirúrgica.
NOTA: Esto creará tensión, exponiendo aún más los grandes vasos y atando el corazón en su lugar, lo que permite una colocación más fácil del catéter en la arteria pulmonar. - Enganchar las puntas de los fórceps curvos bajo el AA y PAT. Tire de una longitud de 3 cm de seda 7-0 hacia atrás a través de la abertura y cree una sutura suelta de un solo tiro.
- Usando tijeras hacer una incisión de 1-2 mm hacia el ápice del corazón, penetrando el ventrículo derecho de paredes delgadas (RV), para permitir la inserción del catéter (Unidad 1). Antes de la inserción, confirme que no hay aire en el sistema. Introducir el tubo cebado en el ventrículo derecho y avanzar suavemente en la SEMItransparente PAT de paredes delgadas.
- Verifique visualmente que el catéter no ha avanzado hacia las ramas pulmonares izquierda o derecha y no se encuentra con la rama de la arteria pulmonar. Con cinta adhesiva, fije la parte distal del tubo a la placa quirúrgica.
NOTA: Para identificar la RV, utilice fórceps para pellizcar el lado derecho del corazón. A diferencia del ventrículo izquierdo, la pared libre relativamente delgada de la RV debe ser fácilmente agarrada. - Para ratones menores que P7, conecte la unidad 2 a un micromanipulador e introduzca el extremo de la aguja de la unidad en la PALMADITA como se ha descrito anteriormente utilizando el manipulador.
- Verifique visualmente que el catéter no ha avanzado hacia las ramas pulmonares izquierda o derecha y no se encuentra con la rama de la arteria pulmonar. Con cinta adhesiva, fije la parte distal del tubo a la placa quirúrgica.
- Apriete suavemente la sutura suelta alrededor de ambos grandes recipientes y corte la longitud de 8 cm de sutura creada en el paso 3.2 para devolver el corazón a una posición de reposo natural. El catéter ahora está firmemente asegurado dentro de la PAT.
- Recorte la aurícula izquierda del corazón para permitir que perfusate salga del sistema.
- Asegure la jeringa que contiene SNP (Unidad 1 o Unidad 2, dependiente del tamaño) en la bomba de la jeringa y perfunda la solución a una velocidad de 0,05 ml/min para vaciar la sangre y dilatar al máximo la vasculatura. La sangre/perfuto saldrá a través de la aurícula recortada. Continúe con la perfusión hasta que la perfusión quede clara (200 ml en un ratón adulto, menos para los animales más jóvenes).
NOTA: Al perfunde la baja viscosidad PBS/SNP, se utilizó una tasa de perfusión relativamente más alta en aras de ahorrar tiempo. El compuesto de polímero más viscoso se infunde a un ritmo más lento para evitar el sobrellenado, la ruptura y maximizar el control sobre los puntos finales distales.
4. Traqueotomía e inflación pulmonar
- Construir la unidad de inflado pulmonar (Figura 2).
- Conecte un catéter de plástico flexible de 24 G por vía intravenosa (IV) (se extrae la aguja)/un conjunto de perfusión de mariposa a un tapón, unido a una jeringa abierta de 50 ml (sin émbolo). Cuelgue la jeringa de un soporte de anillo.
- Añadir 10% de formalina tamponada a la jeringa. Abra la llave, permitiendo que el formol entre en el tubo y purgue todo el aire del sistema. Cierre el llave y levante la jeringa hasta que el menisco esté 20 cm por encima de la tráquea8.
ADVERTENCIA: Formalin es inflamable, cancerígeno, agudamente tóxico cuando se ingiere, y causa irritación de la piel, daño ocular grave, sensibilización de la piel y mutagenicidad de las células germinales. Evite la ingestión y el contacto con la piel y los ojos. Evite la inhalación del vapor o la niebla. Mantener alejado de fuentes de ignición. Use el equipo de protección personal adecuado.
- Coloque dos suturas sueltas inferiores al cartílago cricoide 2-4 mm de separación.
- Usando tijeras, haz una pequeña incisión en el ligamento cricotiroido superior a las suturas.
- Inserte el catéter IV en la abertura y avance la punta más allá de las dos suturas sueltas.
- Apriete las suturas alrededor de la tráquea y abra el llave. Permita que la formalina entre en los pulmones por gravedad y espere 5 minutos para que los pulmones se inflan completamente. Si los pulmones se adhieren a la caja torácica durante la inflación, agarre el exterior de la caja torácica con fórceps con puntas contundentes y muévase en todas las direcciones para ayudar a liberar los lóbulos. No haga contacto directo con los pulmones.
- Después de 5 minutos, retroceda el catéter IV más allá de la primera sutura y el ligato. Repita para la segunda sutura. Los pulmones ahora están inflados en un estado cerrado y presurizado.
5. Fundición de la vasculatura
- En un tubo de 1,5 ml, prepare 1 ml de unasolución 8:1:1 de polímero:diluir:agente de curado e invierta suavemente varias veces para asegurar una buena mezcla.
- Retire el émbolo de una jeringa de 1 cc, cubra el extremo opuesto con un dedo enguantado y vierta el compuesto de polímero en la jeringa. Vuelva a insertar cuidadosamente el émbolo, invierta y avance el émbolo para eliminar todo el aire y formar un menisco en la punta de la jeringa.
- Retire la jeringa SNP/PBS del cubo de la aguja y gotee PBS adicional en el cubo para crear un menisco. Revise cuidadosamente el cubo en busca de aire atrapado, desalojar si es necesario, y reformar el menisco. Unir el cubo a la jeringa llena con el compuesto de polímero.
NOTA: La creación de un menisco en ambos extremos reduce significativamente la posibilidad de que el aire entre en el sistema. - Fije la jeringa llena de compuesto de polímero a la bomba de la jeringa e infunda a 0,02 ml/min.
NOTA: Para los pulmones más pequeños, una velocidad más lenta puede ser útil para prevenir el sobrellenado, pero no es esencial. - Supervise el compuesto a medida que se mueve libremente por el tubo de PE y observe el volumen de la jeringa al entrar en la PAT. Continúe llenando hasta que todos los lóbulos se llenen completamente hasta el nivel capilar y detenga la bomba de la jeringa. Compruebe de nuevo el volumen de la jeringa.
NOTA: Después de varias corridas, se puede utilizar un volumen estimado para medir un punto final aproximado (35 oL para un ratón adulto y 5 ml para un cachorro de P1). Después de detener la bomba, la presión residual en el sistema continuará empujando el compuesto del polímero en las arterias pulmonares. Todos los lóbulos pulmonares deben llenarse a una velocidad similar. - Cubra los pulmones con una toallita limpiadora de fibra óptica, aplique liberalmente PBS y deje que la carcasa se siente intacta durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Durante este período, el compuesto de polímero se curará y endurecerá.
- Retire el catéter, corta los brazos/la mitad inferior del ratón y coloca la cabeza/tórax en una cónica de 50 ml llena de formalina tamponada al 10% durante la noche.
- Después de la fijación, agarre la tráquea y separe suavemente la unidad del corazón/pulmón de la caja torácica y el tórax restantes. Coloque el bloqueo del corazón/pulmón en un vial de centelleo lleno de formol. Desecha el resto.
6. Camas vasculares alternativas para fundición (Tabla 1)
NOTA: Cada lecho vascular objetivo puede requerir diferentes colocaciones de catéter, tasas de perfusión y tiempos de llenado óptimos. Por lo tanto, varios animales serán necesarios para lanzar múltiples órganos.
- Para las camas vasculares sistémicas superiores o inferiores al diafragma siga los pasos 1.1-2.5 como se indica arriba. Véanse las notas adicionales sobre el sistema del portal y el diafragma (Tabla 1).
- Agarre el proceso de xifoide con un hemostat y corte la caja torácica bilateralmente (aproximadamente en la línea media axilar) justo antes de las arterias torácias internas.
- Doblar la caja torácica todavía conectada sobre tal manera que está descansando sobre el cuello / cabeza del animal, exponiendo completamente la cavidad torácica.
- Siga el paso 3.1 anterior y, a continuación, retire los pulmones. Una vez que la aorta torácica (TA) es visible, enganchar las puntas de los fórceps curvos debajo de ella, 10 mm superior al diafragma. Agarre una longitud de 3 cm de seda 7-0, tire hacia atrás a través de la abertura debajo del TA y cree una sutura suelta de un solo tiro. Repita este procedimiento 8 mm por encima del diafragma.
- Para estructuras superiores al diafragma, utilice tijeras de resorte para crear un pequeño agujero (30% de la circunferencia total) en la porción ventral del TA, inferior a las suturas sueltas colocadas en el paso 6.4.
- Para las estructuras inferiores al diafragma, en su lugar, cree un pequeño agujero de 2 mm superior a las suturas sueltas.
- Dependiendo del tamaño del animal, introduzca la Unidad 1 o 2 en el recipiente, avance más allá de las suturas sueltas y liga suavemente el recipiente.
- Siga el paso 3.7, ajustando la bomba de la jeringa a una velocidad de 1,0 ml/min y perfundiendo un mínimo de 5 ml. Persate saldrá a través del CIV.
- Siga los pasos 5.1 - 5.4 ajustando la velocidad de perfusión a 0,05 ml/min, monitoreando visualmente el tejido objetivo en tiempo real.
NOTA: El volumen de perfusión será específico de la edad de órganos y animales. El volumen puede limitarse aún más mediante la ligadura de ramas arteriales que conducen a lechos vasculares no objetivo (es decir, cerebro, hígado, riñón, intestino). - Siga 5.6 y luego retire el tejido objetivo y colóquelo en formalina.
7. Montaje de muestras, escaneo y reconstrucción para micro-CT
- Usando película de parafina, cree una superficie plana en la cama de escaneo y centre la muestra húmeda en esta superficie (Figura 3A).
NOTA: Si se detecta un artefacto de movimiento, es posible que la muestra requiera una estabilización adicional. - Ligeramente tentar / cubrir la muestra con película de parafina adicional para prevenir la deshidratación. Tenga especial cuidado de no apoyar la película de parafina en la muestra causando deformación en el tejido (Figura 3B).
- Escanee el ejemplo utilizando la configuración descrita en la Tabla 2 y estandarice estos parámetros dentro de un experimento determinado.
NOTA: Esto depende del experimento/punto final. Estandarice los parámetros elegidos para facilitar la comparación entre muestras. - Transfiera los escaneos reconstruidos para el postprocesamiento y el análisis.
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Representative Results
Un molde exitoso exhibirá un llenado uniforme de toda la red arterial pulmonar. Lo demostramos en ratones C57Bl/6J que varían en edad: día posnatal P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) y P1 (Figura 4D). Mediante el control de la velocidad de flujo y la supervisión visual del relleno en tiempo real, se lograron puntos finales fiables de la vasculatura más distal (Figura 5A).
Los desafíos comunes incluyen daño a los pulmones, llenado incompleto, llenado o sobrellenado, desbaste del catéter y tamaño animal.
Si hay daño en el pulmón/vía aérea, pequeñas fugas evitarán que los pulmones mantengan presión (Figura 5B,C). En ausencia de inflación completa, se hace difícil hacer comparaciones cuantitativas y espaciales precisas entre muestras. Para minimizar el riesgo para el parénquima pulmonar, evite cortar demasiado de cerca a los pulmones al extraer la caja torácica y mantener los pulmones húmedos con PBS durante todo el procedimiento para evitar la deshidratación y la adherencia a las estructuras circundantes. Si un lóbulo se adhiere a la caja torácica durante la inflación, agarre suavemente el exterior de la caja torácica (lejos del pulmón) con fórceps y muévalo en una dirección para liberar los lóbulos. Alternativamente, un instrumento contundente, como una espátula, con un borde liso se puede utilizar para levantar o empujar el pulmón inflado lejos de la caja torácica. Al inflar los pulmones, adherirse a los parámetros de presión sugeridos y evitar la sobreinflación, ya que esto puede conducir a la ruptura de las vías respiratorias. Por último, no retire los pulmones de la cavidad torácica hasta que se haya completado la post-fijación. La tráquea, los pulmones y el corazón deben extirparse en bloque de las porciones restantes de la cavidad torácica.
Patchy (Figura 5D) o incompleto (Figura 5E) relleno puede surgir de una "esclusa de aire", en la que el aire se introduce en el sistema vascular a través del catéter, bloqueando el flujo aguas abajo del compuesto. Para minimizar la posibilidad de una esclusa de aire, purgue de forma vigilante el aire de la punta del catéter antes de la inserción (paso 3.4) y durante la transición de la jeringa de SNP/PBS al compuesto de polímero. Si el relleno permanece irregular o incompleto, podría ser una indicación de aumento de la resistencia vascular como resultado de la estenosis o tortuosidad focal/segmento largo. Los coágulos sanguíneos también pueden conducir a un llenado incompleto y se evitan fácilmente mediante el uso de heparina antes del procedimiento.
El volumen de inyección incorrecto provocará subllenado o sobrellenado. El relleno inferior se produce cuando se introduce demasiado compuesto en la vasculatura (Figura 5F). Alternativamente, el sobrellenado, o la introducción de demasiado compuesto de polímero demasiado rápido puede causar ruptura arterial (Figura 5G) o, más comúnmente, tránsito venoso (Figura 5H). Ambos problemas se pueden aliviar mediante el uso de una bomba de jeringa. Los investigadores deben adherirse cuidadosamente a las restricciones de velocidad y volumen propuestas o establecer sus propias tasas en función de su modelo específico y optimización. La monitorización de la perfusión de compuestos poliméricos en tiempo real bajo aumento es fundamental, y el llenado de pequeñas arterias/capilares debe utilizarse como punto final.
Avanzar demasiado por el tronco pulmonar puede hacer que la punta se a cuña en una rama de la arteria pulmonar y crear un desequilibrio en el flujo. Como resultado, un lado se llena más rápido que el otro(Figura 5I), lo que con frecuencia conduce a sobrellenado en un pulmón y subllenado en el otro. Mientras que la cuñada con catéter es la razón más probable en este escenario, "bloqueo de aire" y la falta de heparina también pueden ser factores que contribuyen.
Por último, los animales más pequeños presentan su propio conjunto de obstáculos adicionales. Los animales más jóvenes exigen manos firmes y los pequeños errores son menos indulgentes. Los instrumentos de alta calidad, diseñados específicamente para la microcirugía, se vuelven más importantes en los primeros puntos de tiempo postnatales. El uso de un micromanipulador ayuda en gran medida no sólo en la colocación, sino también en la prevención de la luxación del catéter. También es esencial utilizar la bomba de jeringa en animales pequeños para controlar y gestionar con precisión los puntos finales.
Si bien se muestra específicamente para la vasculatura pulmonar, este procedimiento se puede aplicar fácilmente a los lechos vasculares de diana sistémica también(Tabla 1). Además de los desafíos mencionados anteriormente, elegir el punto de entrada correcto es crucial. La fundición a través de la aorta torácica produce excelentes resultados para la mayoría de los lechos vasculares. Cabe señalar, sin embargo, que la inserción del catéter tan proximal en el sitio objetivo como sea posible y ligar la vasculatura no objetivo ayuda en el control de flujo y volumen. Estos refinamientos combinados con la supervisión directa adecuada de los puntos finales vasculares distales(Figura 6A-F)y las tasas de perfusión estándar optimizan el llenado. Muchos ejemplos de estos métodos de casting existen en la literatura y son demasiado numerosos para la referencia completa. Sin embargo, se pueden encontrar detalles adicionales en textos específicos de órganos como estos4,5,7,18,19,20,21.
Después de la fundición, las muestras se pueden procesar para el escaneo de la TCT(Figura 7A,B). Para el postprocesamiento, un paquete de software comercial (véase Tabla de materiales)produjo una representación en volumen 3D del árbol vascular pulmonar presentado como imágenes fijas(Figura 7C)o películas. También se pueden realizar análisis estadísticos adicionales que exploran características vasculares como la longitud y el número del segmento, la tortuosidad, el orden (generación o rango), el volumen y la longitud del arcade. Además del escaneo de la TCT, las muestras fundidas también se pueden borrar para obtener imágenes brutas o procesadas y cortadas para análisis histológicos8.
Figura 1: Configuración del catéter y de la aguja. Las jeringas se muestran con tubos y agujas conectados (Unit1 y Unit2). Inicio: primer plano de la aguja y el tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Configuración de inflado pulmonar. Soporte de anillo, abrazadera, jeringa llena de formalina y tubo con un catéter unido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pre-escaneo de preparación de la muestra micro-CT. (A) Aquí la muestra se centró en una base de película de parafina, (B) Aquí la muestra se centró y se cubrió en la base del parafilm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Pulmones de fundición vascular en diferentes etapas del desarrollo de 3 meses a 1 día de edad. Vista dorsal de los pulmones, (A) P90, (B) P30, (C) P7, y (D) P1 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplos de llenado ideal y errores comunes durante la infusión de compuestos poliméricos. (A) Cuando se alcanzó el punto final de llenado, se observó una red vascular robusta y fina. (B) Los pulmones perfundidos de formalín entrenada completamente inflados están representados por una línea blanca discontinua, (C) Se muestran los pulmones poco inflados/desinflados. Esto se observó debido a una vía respiratoria pulmonar comprometida. La posición inflada original está representada por una línea blanca discontinua y la posición desinflada está representada por una línea de puntos negra, (D) Relleno irregular: la vasculatura de porciones del lóbulo permanece sin llenar mientras que otras áreas estaban completamente llenas, (E) Relleno incompleto: el compuesto de polímero no penetró secciones enteras del pulmón, (F) Subllenado: el compuesto de polímero no pudo llenar la vasculatura distal, (G) Ruptura: la flecha está apuntando al compuesto de polímero extruido de vasculatura, (H) Relleno venoso: observe la flecha que apunta a los segmentos arteriales completamente llenos y extendiéndose en el sistema venoso. Las venas y las venas eran de calibre significativamente más grande, (I) Cuña de catéter: Aquí el catéter se des apartó en una arteria evitando que la vasculatura de los lóbulos derecho se llenara por completo mientras el lóbulo izquierdo estaba sobrellenado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Fundición vascular y puntos finales en órganos adicionales. (A) Riñón: la apariencia punctada del compuesto de polímero en el glomérulo proporcionó el punto final. (B) Hígado: observe los pequeños vasos visibles en los bordes del órgano. (C) Estómago: los vasos pequeños eran visibles y completamente llenos. (D) Intestino grueso: Los vasos pequeños son fácilmente identificables y llenos. (E) Diafragma: el músculo aquí es delgado y translúcido con pequeños vasos llenos aparentes. (F). Cerebro: pequeños vasos eran visibles en la corteza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Imágenes por TC y renderizado de volumen 3D de pulmones rellenos de compuestos poliméricos. (A) Una sola rebanada pulmonar reconstruida en escala de grises, (B) Esta fue una proyección de intensidad máxima de una tomografía computarizada producida a partir de pulmones llenos de polímero, (C) Se generó una representación de volumen 3D de la arcada vascular utilizando software disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Objetivo de lecho vascular arterial | Colocación del catéter | Dirección de la perfusión | Tasa de perfusión | Notas |
| Cerebro | Aorta torácica apuntando cránida | Retrógrado en las carótidas | .05ml/min | Cannulate aorta torácica, voltee el ratón a la posición propensa, abra el cuero cabelludo y visualmente monitoree el progreso del polímero a través del cráneo. |
| Diafragma | Ventrical izquierdo | Anterogrado en torácico interno, frénico e intercostal | .05ml/min | Abra una ventana en el lado de la caja torácica, dejando intacta la mayor parte de la caja torácica y el diafragma. Cannular ventrical izquierdo, sujetar la aurícula derecha y monitorear el progreso desde el lado caudal del diafragma. |
| Musculatura de las extremidades superiores | Aorta torácica apuntando cránida | Retrógrado en el subclaván braquiocéfalo izquierdo | .02ml/min | Para optimizar el flujo de las extremidades, ate las arterias carótidas y elimine la piel de las extremidades para permitir la monitorización visual del tránsito del polímero en la musculatura de las extremidades. |
| Riñón | Aorta torácica apuntando caudalmente | Anterogrado en arterias renales | .05ml/min | La vasculatura interna se llena a ciegas. Para evitar el tránsito venoso, deje de inyectarse cuando el polímero sea visible en un patrón de punctado uniforme a través del riñón. |
| Sistema de portal | Vena porta | Anrograde en el sistema del portal | .02ml/min | Dobla suavemente el hígado para exponer la vena porta. |
| Hepática | Aorta torácica apuntando caudalmente | Anterogrado en la arteria hepática | .05ml/min | Ate la vena porta antes de la perfusión para evitar el tránsito venoso del intestino que fluye hacia el hígado. |
| Estómago/Intesto | Aorta torácica apuntando caudalmente | Anterogrado en el celíaco, superior mesentérico y/o mesentérico inferior | .05ml/min | Algunas regiones del intestino son suministradas por múltiples arterias y pueden llenarse en diferentes momentos. Para evitar el tránsito venoso, ate las arterias no necesarias para las áreas de interés y supervise visualmente el progreso del polímero. |
| Almohadillas de grasa intraabdominal | Aorta torácica apuntando caudalmente | Anterogrado pero el vaso depende de la que se estudie la almohadilla de grasa | .05ml/min | Las almohadillas de grasa son suministradas por varias arterias y pueden llenarse en diferentes momentos. Para evitar el tránsito venoso, ate las arterias no necesarias para un área de interés precisa y supervise visualmente el progreso del polímero. |
| Musculatura de las extremidades inferiores | Aorta infrarroja apuntando caudalmente | Anterogrado en las arterias femorales | .02ml/min | Retire la piel de las extremidades para permitir la monitorización visual del tránsito del polímero en la musculatura de las extremidades. |
Tabla 1. Fundición de camas vasculares alternativas.
| Ajustes de TC | |
| Kvp | 90 |
| Material objetivo | Tungsteno |
| Poder | 8w |
| Filtración | Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm |
| Número de proyección | 6424 |
| Tamaño del detector | Pantalla plana CMOS - 2944 x 2352 píxeles |
| Campo de visión (FOV) | 36 mm |
| Tamaño de Voxel | 72 m |
| Resolución espacial | tamaño de voxel x 1.5 |
| Tiempo de adquisición | 14 min |
| Reconstrucción | FBP y algoritmo comercial |
| Binning | 1x1 |
Cuadro 2. Parámetros de escaneo de CT.
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Discussion
Ejecutado correctamente, este método produce imágenes impactantes de redes arteriales pulmonares, lo que permite la comparación y experimentación en modelos de roedores. Varios pasos críticos en el camino aseguran el éxito. En primer lugar, los investigadores deben heparinizar al animal en la etapa preparatoria para evitar que se formen coágulos de sangre en la vasculatura pulmonar y las cámaras del corazón. Esto permite el tránsito arterial completo del compuesto de polímero. En segundo lugar, al perforar el diafragma y quitar la caja torácica, tenga cuidado de proteger los pulmones de daños involuntarios, cortes o lesiones. Cualquier fuga en las vías respiratorias evitará la inflación completa y hará que las comparaciones entre muestras sean inexactas. En tercer lugar, el atadura del corazón en el ápice ayuda a la colocación del catéter. En cuarto lugar, el uso de un vasodilatador fuerte como SNP ayudará tanto en la extracción de sangre y el llenado completo de arteriolas y capilares5,8. En quinto lugar, al colocar el catéter en la PAT, tenga cuidado de no enterrar la punta en la bifurcación. Esto causará un desequilibrio en el flujo, desviando el compuesto del polímero al lado izquierdo o derecho, produciendo un gradiente de presión desigual. Sexto, el uso de una bomba de jeringa permitirá al usuario controlar la velocidad y el volumen tanto a la tensión del ratón como a la edad. Por último, deje el corazón/pulmones unidos al resto de la cavidad torácica, fije durante la noche y retírelo al día siguiente. Los pulmones estarán bien fijados y se minimizará el potencial de deflación debido a golpes accidentales durante la separación.
Si bien esta metodología logra los resultados deseados, las técnicas alternativas pueden ser útiles para algunos usuarios. Para ayudar en la colocación del catéter, se puede emplear un micromanipulador. Elegimos una versión con un perfil pequeño y una base magnética para minimizar la invasión en un área de trabajo ya limitada mientras proporcionamos una base estable (si se utiliza una base magnética asegúrese de colocar una placa de acero debajo del espacio de trabajo para permitir que el imán se enganche). Esto permite al usuario colocar con precisión la punta del catéter en la PALMADITA en un ángulo que sigue la trayectoria natural de la arteria. Además, el catéter es seguro y tiene menos riesgo de ser desalojado. Otra opción es el uso de una punta de catéter trompeta8. Aunque no es trivial de crear, un catéter trompeta es mucho más seguro y menos inclinado a deslizarse accidentalmente fuera de la PAT. Cambiar la relación de polímero: diluyente altera la viscosidad y la facilidad con la que se llenan los vasos pequeños. Dependiendo de la vasculatura de destino y los puntos finales experimentales, esto puede ser una consideración valiosa. La eutanasia a través deCO2 puede causar hemorragia pulmonar en un pequeño porcentaje de animales y depende dela cepa 22. Considere un protocolo de eutanasia alternativo en caso de que esto afecte a los puntos finales experimentales. Al inflar los pulmones, el uso de formalina ayuda a la fijación del órgano en su lugar a la presión dada. Se puede sustituir un amortiguador fisiológicamente neutro en caso de que los vasos periféricos deban rellenarse en un estado no fijo. Si la velocidad de perfusión y el control son de menor importancia para un experimento dado, la perfusión a mano también es posible. La inyección manual requiere práctica y monitoreo en tiempo real bajo aumento para evitar el sobrellenado o la rotura del recipiente8. Por último, la montura/condiciones de tejido, los parámetros de escaneo y el postprocesamiento mínimo que empleamos para este papel deben servir simplemente como punto de partida. Diferentes escáneres, tejidos, puntos finales experimentales/necesidades del usuario pueden requerir parámetros alternativos.
Si bien las imágenes vasculares generadas a partir de esta técnica son impresionantes, hay limitaciones. Principalmente, el método anterior es subóptimo para medir el calibre vascular debido a la incapacidad para monitorear y controlar la presión intravascular durante la perfusión. Otros grupos han logrado abordar un poco estas preocupaciones de presión en la vasculatura sistémica mediante el control de la presión de conducción4,23, sin embargo, tales preocupaciones se amplifican aún más en el lado pulmonar debido a las paredes de la arteria pulmonar relativamente delgadas que son fácilmente distensibles con pequeños cambios en las presiones24 y la incapacidad para medir con precisión y controlar estáticamente la presión intravascular pulmonar.
Una segunda limitación a este método es que sigue siendo un experimento postmortem, de un solo punto de tiempo, limitando su utilidad en estudios que requieren condiciones verdaderamente fisiológicas o un curso de tiempo. Otras medidas en animales vivos, como la angiografía pulmonar por TC (CTPA) o el TC mejorado por contraste (CE-CT), ofrecen la posibilidad de medidas funcionales y morfológicas. Exploraciones repetidas/estudios longitudinales, así como mediciones en diferentes puntos del ciclo cardiaco/pulmonar, se pueden explorar10,25,26,27,28. Estos métodos se pueden utilizar de forma fiable, además de la ecocardiografía, para medir el calibre arterial. Sin embargo, tanto el CTPA como las medidas de ecocardiografía se limitan actualmente a la evaluación de la vasculatura proximal. Para el ecocardiograma, la evaluación se limita al tronco pulmonar, mientras que la CTPA permite un cálculo adecuado del calibre de la arteria pulmonar de la rama potencialmente 1-2 órdenes más, pero la resolución es limitada, oscureciendo las porciones distales de la vasculatura7. La dosis de radiación es también una preocupación que debe ser cuidadosamente monitoreada cuando se utiliza TC especialmente en estudios longitudinales multi-escaneo29,30. Para cualquiera de estas aplicaciones, el equipo de EC, el tiempo de escaneo y el software de análisis pueden ser costosos y requerir capacitación especializada del personal. Las instalaciones básicas de imágenes de animales en algunas instituciones pueden aliviar esta carga.
Como alternativa a este compuesto, algunos grupos utilizan técnicas tradicionales de fundición por corrosión acompañadas de la eliminación de tejidos blandos31,32. Estos métodos producen resultados similares a este compuesto de polímero, pero el producto final es frágil, lo que conduce a un artefacto potencial15. Además, la eliminación de tejido blando elimina el potencial de histología futura33. Otra opción es dejar el tejido blando intacto y realizar un paso de seguimiento en el que el tejido blando se "despeja" haciendo que la muestra sea prácticamente transparente34,,35. La limpieza de tejido ofrece al usuario cierta capacidad para ver más profundamente dentro de una muestra, pero, en general, sigue siendo inferior a la TCT, ya que no puede proporcionar la misma visualización 3D. La sección histológica en serie y la tomografía por matriz son métodos que ofrecen una resolución excepcionalmente alta. Si bien esta técnica abre la puerta a nuevas y emocionantes posibilidades, la carga de trabajo es exponencialmente mayor y no es particularmente propicia para las grandes cohortes11,,12. La histología de rayos X 3D es un enfoque no destructivo que combina tanto la histología CT como la histología tradicional o incluso EM36,,37,,38. Se necesita una visión más de alto nivel de la patología mediante la utilización de la TCT para identificar globalmente y explorar con precisión las regiones de interés que luego se les sigue con la histología de rutina39. Sustituir los agentes de contraste de menor resolución (o en algunos casos ningún contraste) con compuesto de polímero en la vasculatura podría servir para elevar ambas técnicas cuando sea posible. Otro enfoque no destructivo que es computacionalmente intensivo todavía, potencialmente mejora el contraste, es la recuperación de fase de imágenes40,41. Este método puede ser valioso cuando se emplea en datos ruidosos donde el contraste es débil o no es posible42. El compuesto de polímero empleado en esta técnica, sin embargo, no sufre de esta limitación. Dicho esto, la recuperación de fase puede ser útil cuando el compuesto del polímero se diluye posiblemente, por ejemplo en la vasculatura distal43. Por último, la estereología ha sido un estándar en el análisis estructural cuantitativo pulmonar durante los años44. Utiliza muestreo aleatorio y sistemático en secciones transversales de tejido para hacer inferencias tridimensionales suponiendo que las muestras elegidas son suficientemente representativas. Mientras que una herramienta poderosa, tiene el potencial de conducir a errores y sesgos. La combinación de imágenes por TC con estereología, sin embargo, tiene una gran promesa45.
El método descrito es relativamente sencillo y con el entrenamiento se puede alcanzar una tasa de éxito de >90%. Una vez dominado, permite la fundición completa y confiable de la vasculatura pulmonar. En fijador, el tejido y el polímero permanecen estables indefinidamente para futuras exploraciones, histología potencial, o EM46,,47. Hemos demostrado que esta técnica se puede utilizar en animales tan jóvenes como P1 hasta la edad adulta y creemos que la fundición embrionaria, a través de la arteria pulmonar, está al alcance de la mano. Cabe señalar que esta técnica se puede aplicar a prácticamente cualquier otro lecho vascular simplemente alterando el punto de entrada del catéter y determinando los puntos finales apropiados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros NHLBI (DIR HL-006247). Nos gustaría dar las gracias a NIH Mouse Imaging Facility por orientación en la adquisición y análisis de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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