Summary
Bu tekniğin amacı, erken postnatal ve erişkin farelerin pulmoner arter ağlarının akciğer şişmesi yoluyla ex vivo görselleştirilmesi ve pulmoner arter yoluyla radyoopak polimer bazlı bileşiğin enjeksiyonudur. Döküm dokular için potansiyel uygulamalar da tartışılmıştır.
Abstract
Kan damarları 3 boyutlu uzayda karmaşık ağlar oluştururlar. Sonuç olarak, vasküler ağların bir dokunun yüzeyini gözlemleyerek nasıl etkileştiğini ve nasıl etkileştiğini görsel olarak anlamak zordur. Bu yöntem akciğerin karmaşık 3 boyutlu vasküler mimarisini görselleştirmek için bir araç sağlar.
Bunu başarmak için pulmoner artere bir kateter yerleştirilir ve vaskülatür aynı anda kandan atılır ve direnci sınırlamak için kimyasal olarak genişlenir. Akciğerler daha sonra standart bir basınçta trakea ile şişirilir ve polimer bileşik standart bir akış hızında vasküler yatağa aşılanır. Tüm arteriyel ağ doldurulduktan ve tedavisine izin verildikten sonra, akciğer vaskülatürü doğrudan görüntülenebilir veya mikro-CT (μCT) tarayıcıda görüntülenebilir.
Başarılı bir şekilde yapıldığında, erken doğum sonrası yaşlardan erişkinlere kadar farelerde pulmoner arteriyel ağ takdir edebilirsiniz. Ayrıca pulmoner arter yatağında gösterildiği gibi, bu yöntem optimize edilmiş kateter yerleşimi ve uç noktaları ile herhangi bir vasküler yatak uygulanabilir.
Introduction
Bu tekniğin odak noktası farelerde polimer bazlı bir bileşik kullanılarak pulmoner arter mimarisinin görselleştirilmesidir. Beyin, kalp ve böbrek1,2,,3,4,5gibi sistemik vasküler yataklarda kapsamlı çalışmalar yapılırken, pulmoner arter ağının hazırlanması ve doldurulması ile ilgili daha az bilgi mevcuttur. Bu çalışmanın amacı, bu nedenle, önceki çalışma6üzerine genişletmek için,7,8 ve araştırmacılar kolayca pulmoner arter ağacının yüksek çözünürlüklü görüntüleri üretmek için takip edebilirsiniz ayrıntılı bir yazılı ve görsel referans sağlamaktır.
Manyetik rezonans görüntüleme, ekokardiyografi veya BT anjiyografi9,,10gibi akciğer vaskülatürünün etiketlenmesi ve görüntülenmesi için çok sayıda yöntem mevcut olmakla birlikte, bu yöntemlerin çoğu küçük damarları yeterince doldurup/veya yakalayamamaktadır, incelenebilenin kapsamını sınırlandırmaktadır. Seri kesit ve rekonstrüksiyon gibi yöntemler yüksek çözünürlük sağlar, ancak zaman/emek yoğun11,12,13. Çevreleyen yumuşak doku bütünlüğü geleneksel korozyon döküm10,13,,14,15,16tehlikeye girer. Hatta hayvan yaşı ve boyutu bir kateter tanıtmak için çalışırken faktörler haline ya da, çözünürlük eksiktir. Polimer enjeksiyon tekniği, diğer taraftan, kapiller seviyesine arterler doldurur ve μCT ile kombine edildiğinde, benzersiz çözünürlüksağlar 5. Doğum sonrası 14.8 Bunlar süresiz olarak yeniden taranabilir, hatta mevcut yumuşak doku17ödün vermeden histolojik hazırlık / elektron mikroskobu (EM) için gönderilebilir. Bu yöntemin ana sınırlamaları CT ekipman / yazılım ön maliyet, doğru intravasküler basınç izleme ile zorluklar, ve aynı hayvan uzunlamasına veri elde etmek için yetersizlik vardır.
Bu makale, pulmoner arter enjeksiyon tekniğini daha da optimize etmek ve yaş/boyutla ilgili sınırları doğum sonrası 1 (P1) gününe kadar itmek ve çarpıcı sonuçlar elde etmek için mevcut çalışmalara dayanmaktadır. Arteriyel damar ağlarını incelemek isteyen ekipler için en yararlıdır. Buna göre, kateter yerleştirme/stabilizasyonu, dolgu hızı/hacmi üzerinde daha fazla kontrol sağlamakta ve artan döküm başarısı için önemli tuzakları vurgulamaktadırk. Elde çıkan dökümler daha sonra gelecekteki karakterizasyon ve morfolojik analiz için kullanılabilir. Belki de daha da önemlisi, bu ilk görsel gösteri, bizim bilgimize göre, bu karmaşık prosedür ile kullanıcı yürür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlık
- Fareyi intraperitoneally heparin (1 birim/g fare vücut ağırlığı) ile enjekte edin ve 2 dakika boyunca ambulamasını bekleyin.
- Co2 odasında hayvan ötenazi.
- Bir cerrahi tahta üzerinde bir supine pozisyonda fare düzenleyin ve bant ile tahtaya dört uzuvları güvenli. İnce diseksiyon için büyütme kullanın.
2. Akciğerlerve trakea açığa
- Saç parazitini en aza indirmek için farenin ventral tarafını %70 etanol ile püskürtün.
- Forceps ile karın derisi kavramak ve göbek bölgesinde makas ile küçük bir kesi yapmak. Karın kas ve deri arasındaki fasyal tabaka içine makas uçları kaydırın ve iki tabaka ayırmaya başlar. Çalışma rostrally, karın, göğüs kafesi ve boyun deri çıkarmadan.
- Karın kaslarını makasla açın ve diyafram ortaya çıkana kadar her iki tarafı da yanal olarak kesin.
- Ksifoid işlemini hafifçe kavrayın ve ince, yarı saydam diyaframdan kaudal akciğerlerin görünümünü en üst düzeye çıkaran göğüs kafesini hafifçe kaldırın. Dikkatle ksifoid sürecinin hemen altında diyafram küçük bir kesi yapmak. Akciğerler çökecek ve diyaframdan uzaklaşacak. Diyaframı göğüs kafesinden ayırın, akciğer parankimini çalmamaya özen.
- Diyafragmdan geçtikleri inferior vena kava (IVC) ve yemek borusunu bulun ve ayırın. Akciğerlerile temas tan kaçınarak, göğüs boşluğunda herhangi bir havuz kan temizlemek için gazlı bez kullanın.
- Klisoidi bir kez daha kavrayın ve nazikçe kaldırın. Akciğerlerle temastan kaçınarak göğüs kafesini iki taraflı olarak (kabaca midaxillary hattında) kesin. Ön göğüs kafesini tamamen çıkarın, manubrium'dan hemen önce göğüs açısı boyunca son kesiği kesin.
- Önceden doldurulmuş bir şırınga kullanarak, kurumasını önlemek için akciğerleri fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile serbestçe ıslayın. Yordam boyunca bu yordamı devam edin.
- Forceps kullanarak, manubrium kavramak ve yavaşça vücuttan uzak yükseltmek. Makas kullanarak, manubrium 1-2 mm lateral kesilmiş, köprücük kemiği kesme, ve kaldırın. Bu, altındaki timusu ortaya çıkaracak.
- Timusun her lobu kavrayın, ayırın ve çıkarın. Submandibular bezi ile bu işlemi tekrarlayın. Son olarak, trakea böşenen kas dokusu kaldırın.
NOT: Diseksiyonu takiben kalp, yükselen aort (AA), pulmoner arteriyel gövde (PAT) ve trakea görülmelidir. Gövde kapalı birincil arterdalları bölünmüş veya yaralı olmadığından emin olun.
3. PA kateterizasyon ve kan perfüzyonu
- Ünite 1'i monte etmek için, 30 G iğnenin göbeğine 15 cm PE-10 boru iplik ve PBS'de 10-4 M sodyum nitroprusside (SNP) ile önceden doldurulmuş 1 mL şırıngaya takın. Tüm hava bu birimden temizlenir kadar piston ilerleyerek tüp prime (Şekil 1).
DİkKAT: Yutulursa SNP toksiktir. Cilt ve göz lerle temasından kaçının. İşlemden sonra cildi iyice yıkayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.- Alternatif olarak, Birim 2'yi birleştirin. Doğum sonrası gün 7 (P7) ve daha küçük fareler için, göbeğinden ek bir 30 G iğne ayırmak ve iğneyi Ünite 1'in açık ucuna saplamak için hemostat kullanın(Şekil 1).
- İğne yerine, 7-0 ipek 10 cm uzunluğunda bir ucunu kavramak için kavisli keskin forceps kullanın. Bir taraftan giren ve kas ve diğer taraftan forseps uçlarını geçen kalbin apeks nüfuz. Başka bir set ile ipek kavramak ve yaklaşık 2 cm uzunluğunda çekin ve kravat kapalı. Sütür kalan 8 cm ucunu alın, caudally kalp çekme, ve cerrahi tahta ya da sonuna bant.
NOT: Bu gerginlik yaratacak, daha büyük damarları açığa ve yerine kalp tethering, pulmoner arter kateter daha kolay yerleşim için izin. - Hem AA hem de PAT altında kavisli forseps uçları kanca. Açma yoluyla 7-0 ipek 3 cm uzunluğunda çekin ve tek atış gevşek dikiş oluşturun.
- Makas kullanarak kateter (Ünite 1) takılması için ince duvarlı sağ ventrikül (RV) nüfuz, kalbin apeksine doğru 1-2 mm kesi yapmak. Yerleştirmeden önce, sistemde hava olmadığını doğrulayın. Astarlı boruyu sağ ventriküle tanıtıve hafifçe yarı saydam ince duvarlı PAT'e doğru ilerleyin.
- Kateterin sol veya sağ pulmoner dallara doğru ilerlemediğini ve pulmoner arter dal noktasına abut olmadığını görsel olarak doğrulayın. Bant kullanarak, cerrahi tahtaya tüp distal kısmını güvenli.
NOT: RV tanımlamak için, kalbin sağ tarafında çimdik için forceps kullanın. Sol ventrikül aksine, RV nispeten ince serbest duvar kolayca kavranmalıdır. - P7'den daha genç fareler için, Ünite 2'yi bir mikromanipülatöre takın ve ünitenin iğne ucunu yukarıda manipülatör kullanarak açıklandığı şekilde PAT'e takın.
- Kateterin sol veya sağ pulmoner dallara doğru ilerlemediğini ve pulmoner arter dal noktasına abut olmadığını görsel olarak doğrulayın. Bant kullanarak, cerrahi tahtaya tüp distal kısmını güvenli.
- Yavaşça her iki büyük damarların etrafında gevşek dikiş sıkın ve doğal bir dinlenme pozisyonuna kalp dönmek için adım 3.2 oluşturulan dikiş 8 cm uzunluğunda kesti. Kateter artık PAT içinde sıkıca sabitlenmiş.
- Perfusate sistemden çıkmak için izin vermek için kalbin sol auricle klip.
- Snp içeren şırıngayı (Ünite 1 veya Unit 2, boyuta bağlı) şırınga pompasına sabitleyin ve kanı yıkamak ve vaskülatürü maksimum olarak büyütmek için çözeltiyi 0,05 mL/dk oranında perfüzyonlayın. Kan/perfusat kırpılmış auricle ile çıkar. Perfusate net çalışana kadar perfüzyona devam edin (yetişkin bir farede ~200 μL, genç hayvanlar için daha az).
NOT: Düşük viskoziteli PBS/SNP'yi perfüzyon yaparken, zamandan tasarruf amacıyla nispeten daha yüksek bir infüzyon oranı kullanılmıştır. Daha viskoz polimer bileşik aşırı dolum önlemek için daha yavaş bir oranda aşılanır, rüptür, ve distal uç noktaları üzerinde kontrolü maksimize.
4. Trakeostomi ve akciğer şişmesi
- Akciğer şişirme ünitesini oluşturmak (Şekil 2).
- Esnek bir plastik 24 G intravenöz (IV) kateter (iğne kaldırıldı)/kelebek infüzyon açık bir 50 mL şırınga (hiçbir piston) bağlı bir stopcock için ayarlayın. Şırıngayı bir yüzük standına as.
- Şırıngaya %10 tamponlu formalin ekleyin. Stopcock'u açın, formalinin boruya girmesini ve sistemdeki tüm havayı temizlemesine izin verin. Stopcock kapatın ve menisküs kadar şırınga yükseltmek20trakea üzerinde cm 8 .
DİkKAT: Formalin yanıcı, kanserojen, yutulduğunda akut toksiktir ve cilt tahrişine, ciddi göz hasarına, cilt hassasiyetine ve germ hücre mutajenitasyonuna neden olur. Yutma ve cilt ve gözler ile temas kaçının. Buhar veya sis teneffüs kaçının. Ateşleme kaynaklarından uzak durun. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
- 2-4 mm ayrı krikoid kıkırdak aşağı iki gevşek dikiş yerleştirin.
- Makas kullanarak, krikotiroid ligament dikişüstün küçük bir kesi yapmak.
- IV kateteri açıklığa yerleştirin ve ucu iki gevşek sütürden öteye doğru ilerletin.
- Nefes borusu çevresindeki dikişleri sıkın ve stopcock açın. Formalin yerçekimi ile akciğerlere girmek için izin verin ve akciğerler in tamamen şişirmek için 5 dakika bekleyin. Akciğerler enflasyon sırasında göğüs kafesine yapışırsa, göğüs kafesinin dışını künt uçlu pütürlülerle tutarak lobların serbest çıkmasına yardımcı olmak için her yöne doğru hareket edin. Akciğerlerle doğrudan temas etmeyin.
- 5 dakika sonra, ilk dikiş ve ligate ötesinde IV kateter geri. İkinci dikiş için tekrarlayın. Akciğerler artık kapalı ve basınçlı bir durumda şişirilmiş durumda.
5. Vaskülatür döküm
- 1,5 mL'lik bir tüpte, iyi karıştırmasağlamak için8 polimer:diluent:kür maddesi 8'in in1 mL'sini hazırlayın ve birkaç kez hafifçe ters çevirin.
- 1 cc şırıngadan pistonu çıkarın, eldivenli bir parmakla karşı ucunu kapatın ve polimer bileşiği şırınganın içine dökün. Dikkatlice piston yeniden, ters ve tüm hava kaldırmak ve şırınga ucunda bir menisküs oluşturmak için piston ilerlemek.
- SNP/PBS şırıngını iğnenin göbeğinden çıkarın ve menisküs oluşturmak için hub'a ek PBS damlatın. Dikkatle sıkışmış hava için merkezi kontrol edin, gerekirse yerinden, ve menisküs reform. Polimer bileşiği ile dolu şırınga için hub katılın.
NOT: Her iki uçta da menisküs oluşturmak havanın sisteme girme şansını önemli ölçüde azaltır. - Polimer bileşik dolu şırınga pompasına takın ve 0,02 mL/dk'da aşılayın.
NOT: Daha küçük akciğerler için, daha yavaş bir hız aşırı dolgu önlemek için yararlı olabilir ama, gerekli değildir. - PE tüpünden aşağı doğru hareket ederken bileşiği izleyin ve PAT'e girerken şırınga hacmine dikkat edin. Tüm loblar kılcal damar seviyesine tamamen dolana kadar doldurmaya devam edin ve şırınga pompasını durdurun. Şırınga hacmini tekrar kontrol edin.
NOT: Birkaç çalıştırmadan sonra yaklaşık bir bitiş noktasını ölçmek için tahmini hacim kullanılabilir (yetişkin bir fare için ~35 μL ve P1 yavrusu için ~5 μL). Pompa durdurulduktan sonra, sistemdeki artık basınç polimer bileşiği pulmoner arterlere itmeye devam edecektir. Tüm akciğer lobları benzer bir oranda doldurmak gerekir. - Bir fiber optik temizleme mendil ile akciğerleri kaplayın, liberal PBS uygulamak, ve karkas oda sıcaklığında 30-40 dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmasını bekleyin. Bu dönemde, polimer bileşik tedavi ve sertleşir.
- Kateteri çıkarın, farenin kollarını/alt yarısını ayırın ve baş/toraksı bir gecede %10 tamponlu formalin ile dolu 50 mL konik konik bir yere yerleştirin.
- Fiksasyondan sonra, nefes borusunu kavrayın ve kalp/akciğer ünitesini kalan göğüs kafesi ve torakstan yavaşça ayırın. Kalp/akciğer bloğunu formalin dolu bir sintillasyon şişesine yerleştirin. Gerisini at.
6. Döküm için alternatif vasküler yataklar (Tablo 1)
NOT: Her hedef vasküler yatak farklı kateter yerleşimleri, infüzyon oranları ve optimal dolum süreleri gerektirebilir. Böylece, birden fazla hayvan birden fazla organ atmak için gerekli olacaktır.
- Sistemik vasküler yataklar için yukarıdaki gibi 1.1-2.5 adımlarını takip edin. Portal sistemi ve diyafram ek notlar bakınız (Tablo 1).
- Bir hemostat ile ksifoid süreci kavramak ve iki taraflı göğüs kafesi kesti (kabaca midaxillary line) hemen önce iç torasik arterler.
- Hayvanın boynuna/kafasına dayanarak göğüs boşluğunu tamamen açığa çıkaracak şekilde hala bağlı olan göğüs kafesini katlayın.
- Yukarıdaki adım 3.1 izleyin, sonra akciğerleri çıkarın. Torasik aort (TA) görünür olduğunda, diyaframdan ~10 mm daha üstün olan kavisli çöplerin uçlarını altına bağla. 7-0 ipek 3 cm uzunluğunda kavramak, TA altında açıklık geri çekin ve tek atış gevşek dikiş oluşturun. Diyaframın ~8 mm üzerinde bu işlemi tekrarlayın.
- Diyaframdan üstün yapılar için, TA'nın ventral kısmında küçük bir delik (toplam çevrenin ~%30'u) oluşturmak için yay makası kullanın, 6.4 adımda yerleştirilen gevşek dikişlere ~2 mm daha düşük.
- Diyafram aşağı yapılar için, bunun yerine, gevşek dikişler ~ 2 mm üstün küçük bir delik oluşturun.
- Hayvan boyutuna bağlı olarak, Ünite 1 veya 2'yi gemiye tanıtınız, gevşek dikişlerin ötesine ilerleyin ve kabı nazikçe hafifçe initin.
- Şırınga pompasını 1,0 mL/dk hızında ayarlayarak ve en az 5 mL perfüzyon la ilgili olarak 3.7 adımını takip edin. Perfusate IVC üzerinden çıkacak.
- İnfüzyon oranını 0,05 mL/dk'ya ayarlayarak hedef dokuyu gerçek zamanlı olarak görsel olarak izleyerek 5.1 - 5.4 adımlarını takip edin.
NOT: İnfüzyon hacmi organ ve hayvan yaşına özgü olacaktır. Hacim daha da hedef olmayan vasküler yatak (yani, beyin, karaciğer, böbrek, bağırsak) yol arteriyel dalları ligating ile sınırlı olabilir. - 5.6'yı takip edin ve hedef dokuyu çıkarın ve formalin yerleştirin.
7. Mikro-BT için numune montajı, taraması ve rekonstrüksiyonu
- Parafin film kullanarak, tarama yatağında düz bir yüzey oluşturun ve ıslak numuneyi bu yüzeye ortalayın(Şekil 3A).
NOT: Hareket artifakı algılanırsa, örnek daha fazla sabitleme gerektirebilir. - Dehidratasyon önlemek için ek parafin film ile hafifçe çadır / kapak örnek. Dokuda deformasyona neden olan numunenin parafin filmini dinlenmemeye özel özen gösterirler(Şekil 3B).
- Tablo 2'de özetlenen ayarları kullanarak örneği tarayıp bu parametreleri belirli bir denemede standartlaştırın.
NOT: Bu deneme/uç nokta bağlıdır. Örnekler arasında karşılaştırma kolaylığı için seçilen parametreleri standartlaştırın. - Yeniden yapılanttırılanın işleme ve analiz sonrası taramalarını aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir döküm tüm pulmoner arter ağının düzgün dolgu sergileyecek. Bunu yaşolarak değişen C57Bl/6J farelerde gösteriyoruz: Doğum sonrası gün P90 (Şekil 4A), P30 (Şekil 4B), P7 (Şekil 4C), P1(Şekil 4D). Akış hızının kontrol edilerek ve dolgunun gerçek zamanlı olarak görsel olarak izlenmesi yle, en distal vaskülatürün güvenilir uç noktaları elde edilmiştir(Şekil 5A).
Yaygın sorunlar akciğerlerde hasar, eksik dolum, eksik doldurma, veya aşırı doldurma, kateter wedging ve hayvan boyutu içerir.
Akciğer/hava yolunda hasar varsa, küçük sızıntılar akciğerlerin basınç tutmasını önler (Şekil 5B,C). Tam bir enflasyon yokluğunda, örnekler arasında doğru nicel ve mekansal karşılaştırmalar yapmak zorlaşır. Akciğer parankim riskini en aza indirmek için, göğüs kafesi çıkarırken akciğerlere çok yakın kesme önlemek ve dehidratasyon ve çevre yapılara yapışmasını önlemek için işlem boyunca PBS ile akciğerleri nemli tutmak. Bir lob enflasyon sırasında göğüs kafesine yapışırsa, göğüs kafesinin dışını (akciğerden uzakta) forceps ile hafifçe tutun ve lobları serbest bırakıp bir yöne doğru hareket ettirin. Alternatif olarak, yumuşak kenarlı bir spatula gibi künt bir alet, şişmiş akciğeri göğüs kafesinden uzaklaştırmak veya itmek için kullanılabilir. Akciğerleri şişirirken, önerilen basınç parametrelerine uyun ve hava yolunun yırtılmasına yol açabileceğinden aşırı enflasyonu önleyebilirsiniz. Son olarak, post-fiksasyon tamamlanana kadar torasik kavitenin akciğerlerini çıkarmayın. Trakea, akciğerler ve kalp torasik boşluğun kalan kısımlarından blok olarak çıkarılmalıdır.
Yamalı (Şekil 5D) veya eksik(Şekil 5E)dolgu, havanın kateter aracılığıyla damar sistemine girilerek bileşiğin aşağı akışını engellediği bir "hava kilidi"nden kaynaklanabilir. Hava kilidi olasılığını en aza indirmek için, snp/PBS'den polimer bileşiğe şırınga geçişi sırasında (Adım 3.4) ve yerleştirilmeden önce kateterin ucundaki havayı dikkatlice temizleyin. Dolgu yamalı veya eksik kalırsa, fokal/uzun segment darlığı veya tortuosit sonucu artmış vasküler direncin bir göstergesi olabilir. Kan pıhtıları da eksik dolgu yol açabilir ve kolayca işlem öncesi heparin kullanılarak önlenebilir.
Yanlış enjeksiyon hacmi dolgu veya aşırı dolum yol açacaktır. Alt dolgu, vaskülatüre çok az bileşik sokulduğunda oluşur (Şekil 5F). Alternatif olarak, aşırı dolgu veya çok hızlı bir şekilde çok fazla polimer bileşik tanıtılması ya arteriyel rüptüre neden olabilir (Şekil 5G) veya daha yaygın olarak, venöz transit (Şekil 5H). Her iki sorun bir şırınga pompası kullanılarak hafifletilebilir. Müfettişler, önerilen fiyat ve hacim kısıtlamalarına dikkatle uymalı veya kendi model ve optimizasyonlarına göre kendi oranlarını belirlemelidir. Büyütme altında gerçek zamanlı olarak polimer bileşik perfüzyonun izlenmesi önemlidir ve küçük arteriyollerin/kılcal damarların doldurulması bir uç nokta olarak kullanılmalıdır.
Kateteri pulmoner gövdeden çok aşağıya doğru ilerletmek ucun bir pulmoner arter dalına girmesine ve akışta dengesizlik yaratmasına neden olabilir. Sonuç olarak, bir taraf diğerinden daha hızlı doluyor(Şekil 5I),bu da sıklıkla bir akciğerde dolgu ya da diğerinde dolgu olmasına yol açar. Kateter wedging bu senaryoda en olası nedeni olmakla birlikte, "hava kilidi" ve heparin eksikliği de faktörlere katkıda bulunabilir.
Son olarak, küçük hayvanlar ek engellerin kendi kümesi mevcut. Genç hayvanlar sabit eller talep ve küçük hatalar daha az affedici. Mikrocerrahi için özel olarak tasarlanmış yüksek kaliteli aletler, erken doğum sonrası zaman noktalarında daha da önem emz. Mikromanipülatör kullanımı sadece yerleşimde değil, kateter çıkığı nın önlenmesinde de büyük ölçüde yardımcı olur. Ayrıca doğru kontrol etmek ve uç noktaları yönetmek için küçük hayvanlar üzerinde şırınga pompası kullanmak esastır.
Pulmoner vaskülatür için özel olarak gösterilmiş olmakla birlikte, bu işlem sistemik hedef vasküler yataklara da kolayca uygulanabilir(Tablo 1). Yukarıda listelenen zorluklara ek olarak, doğru giriş noktasıseçimi çok önemlidir. Torasik aort yoluyla döküm çoğu vasküler yatak için mükemmel sonuçlar üretir. Ancak, kateteri mümkün olduğunca hedef bölgeye proksimal olarak takmanın ve hedef olmayan vaskülatürlerin ligleştirilmesinin akış ve hacim kontrolüne yardımcı olduğu unutulmamalıdır. Bu arıtmalar distal vasküler uç noktaların uygun doğrudan izlenmesi ile birlikte(Şekil 6A-F)ve standart infüzyon oranları dolgu optimize. Bu tür döküm yöntemlerinin birçok örnek literatürde var ve tam referans için çok sayıda. Ancak,,bu4,5,7,18,19,20,,21gibi organa özel metinde ek ayrıntılar bulunabilir.
Dökümden sonra, numuneler μCT taraması için işlenebilir (Şekil 7A,B). İşlem sonrası için, ticari bir yazılım paketi (Bkz. Malzeme Tablosu)pulmoner vasküler ağacın hareketsiz görüntü(Şekil 7C)veya film olarak sunulan 3Boyutlu hacimli bir işlemesini üretti. Segment uzunluğu ve sayısı, tortuosity, sipariş (nesil veya rütbe), hacim ve arcade uzunluğu gibi vasküler özellikleri inceleyen daha fazla istatistiksel analizler de yapılabilir. ΜCT taramasına ek olarak, döküm örnekleri de brüt görüntüleri elde etmek için temizlenebilir veya işlenmiş ve histolojik analiz için kesilebilir8.
Şekil 1: Kateter ve iğne kurulumu. Şırıngalar ekli boru ve iğnelerle gösterilir (Ünite1 ve Unit2). Inset: iğne ve tüp yakın çekim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akciğer enflasyonu kurulumu. Halka standı, kelepçe, formalin dolu bir şırınga ve kateter takılı tüp. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikro-BT numune hazırlama ön taraması. (A) Burada numune parafin film tabanı üzerine ortalanmış, (B) Burada örnek parafilm tabanına ortalanmış ve kapsanmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vasküler dökümlü akciğerler 3 aydan 1 güne kadar değişen gelişimevrelerinde. Akciğerlerin dorsal görünümü, (A) P90, (B) P30, (C) P7, ve (D) P1 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Polimer bileşik infüzyonu sırasında ideal dolgu ve yaygın hatalar örnekleri. (A) Dolgu ucuna ulaşıldığında sağlam ve ince bir vasküler ağ gözlenmiştir. (B) Tam şişirilmiş formalin perfüzyonlu akciğerler beyaz kesik li bir çizgi ile temsil edilir, (C) Az şişirilmiş/sönmüş akciğerler gösterilir. Bu, akciğer hava yolunun uzaması nedeniyle gözlendi. Orijinal şişirilmiş pozisyon beyaz kesikli bir çizgi ile temsil edilir ve sönmüş pozisyon siyah noktalı bir çizgi ile temsil edilir, (D) Yamalı dolum: diğer alanlar tamamen dolu iken lob kısımlarının vaskülature doldurulmamış kalır, (E) Eksik dolum: polimer bileşik akciğer tüm bölümleri nüfuz başarısız, (F) Underfilling: polimer bileşik distal vaskülatür doldurmak için başarısız oldu, (G) Rüptür: ok vaskülatür ekstrüzyon ekstrüzyon polimer bileşik işaret ediyor, (H) Venöz doldurma: artersegmentleri işaret ok tamamen dolu ve venöz sisteme uzanan. Damarlar ve venler önemli ölçüde daha büyük kalibreli, (I) Kateter kama: Burada kateter sol lob aşırı doldu iken tamamen dolum sağ lobların vaskülatür engelleyen bir arter içine şant lı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Ek organlarda vasküler döküm ve uç noktalar. (A) Böbrek: glomeruluspolimer bileşik delinmiş görünümü bitiş noktası sağladı. (B) Karaciğer: organın kenarlarında görünen küçük damarları not edin. (C) Mide: küçük damarlar görünür ve tamamen doluydu. (D) Kalın bağırsak: Küçük damarlar kolayca tanımlanabilir ve doldurulabilir. (E) Diyafram: burada kas ince ve küçük dolu damarları belirgin yarı saydam. (F). Beyin: küçük damarlar kortekste görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. CT görüntüleri ve polimer bileşik dolu akciğerlerin 3D hacim render. (A) Tek bir gri ölçekli yeniden akciğer dilimi, (B) Bu polimer dolu akciğerlerden üretilen bir CT taraması maksimum yoğunluklu projeksiyon oldu, (C) Vasküler arcade bir 3D hacim render ticari olarak kullanılabilir yazılım kullanılarak oluşturuldu (Malzeme Tablosubakınız). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedef Arteriyel Vasküler Yatak | Kateter yerleşimi | İnfüzyon yönü | İnfüzyon hızı | Notlar |
| Beyin | Torasik aort kranial işaret | Karotidler içine Retrograd | .05ml/dk | Kanülatatattosik aort, eğilimli pozisyona fare çevirmek, açık kafa derisi, ve kafatası ile polimer ilerlemesini görsel olarak izlemek. |
| Diyafram | Sol Ventrical | Anterograd içine internal torasik, frenik ve interkostal | .05ml/dk | Göğüs kafesinin yan tarafında bir pencere açın, göğüs kafesi ve diyafram ın büyük bir kısmını sağlam bırakın. Sol ventrical, klips sağ atriyum ve diyafram kaudal tarafında ilerleme izlemek kanül. |
| Üst ekstremite kasları | Torasik aort kranial işaret | Brakiyosefalik ve sol subklavian içine Retrograd | .02ml/dk | Ekstremite akışını optimize etmek için, karotis arterleri bağlayın ve ekstremite kas içine polimer transit görsel izleme sağlamak için ekstremite cilt kaldırmak. |
| Böbrek | Torasik aort caudally işaret | Renal arterlere anterograd | .05ml/dk | İç damar körü körüne doldurulur. Venöz geçişi önlemek için, polimer böbrek boyunca düzgün bir delinme deseni görünür olduğunda enjekte durdurmak. |
| Portal Sistemi | Portal ven | Portal sistemine anterograd | .02ml/dk | Yavaşça portal ven ortaya çıkarmak için karaciğer katlayın. |
| Hepatik | Torasik aort caudally işaret | Hepatik arter içine Anterograd | .05ml/dk | İnfüzyondan önce portal ven kapatın ve bağırsaktan karaciğere akan venöz geçişi önleyin. |
| Mide / Bağırsak | Torasik aort caudally işaret | Çölyak içine Anterograd, üstün mezenterik ve / veya inferior mezenterik | .05ml/dk | Bağırsak bazı bölgelerde birden fazla arter tarafından sağlanan ve farklı zamanlarda doldurabilir. Venöz geçişi önlemek için, ilgi alanları için gerekli olmayan arterleri bağlayın ve polimerin ilerlemesini görsel olarak izleyin. |
| Karın içi yağ pedleri | Torasik aort caudally işaret | Anterograd ama damar yağ yastığı üzerinde çalışılıyor bağlıdır | .05ml/dk | Yağ pedleri birden fazla arter tarafından sağlanır ve farklı zamanlarda doldurabilir. Venöz geçişi önlemek için, hassas ilgi alanı için gerekli olmayan arterleri bağlayın ve polimerin ilerlemesini görsel olarak izleyin. |
| Alt ekstremite kasları | Infrarenal aort caudally işaret | Femoral arterlere anterograd | .02ml/dk | Ekstremite kas içine polimer transit görsel izleme sağlamak için ekstremite cilt çıkarın. |
Tablo 1. Döküm alternatif vasküler yataklar.
| CT ayarları | |
| Kvp | 90 |
| Hedef Malzeme | Tungs -ten |
| Güç | 8W |
| Filtrasyon | Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm |
| Projeksiyon Numarası | 6424 |
| Dedektör Boyutu | Düz panel CMOS - 2944 x 2352 piksel |
| Görüş Alanı (FOV) | 36 mm |
| Voxel Boyutu | 72 μm |
| Uzamsal Çözünürlük | voxel boyutu x 1.5 |
| Satın alma süresi | 14 dk |
| Rekonstrüksiyonu | FBP ve ticari algoritma |
| Binn | 1x1 |
Tablo 2. μCT Tarama Parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Düzgün bir şekilde yürütülen bu yöntem, pulmoner arterağlarının çarpıcı görüntülerini vererek kemirgen modellerinde karşılaştırma ve deney emaresi sağlar. Yol boyunca birkaç kritik adım başarıyı sağlar. İlk olarak, müfettişler akciğer vaskülatür ve kalp odalarında oluşan kan pıhtıları önlemek için hazırlık aşamasında hayvan heparinize gerekir. Bu polimer bileşiğin tam arteriyel transit sağlar. İkinci olarak, diyafram delinme ve göğüs kafesi çıkarmadan, yanlışlıkla hasar, kesik ler veya yaralanmalara karşı akciğerleri korumak için dikkat edin. Hava yolundaki herhangi bir sızıntı tam enflasyonu önleyecek ve numuneler arasındaki karşılaştırmaları yanlış hale getirecektir. Üçüncü olarak, apeksde kalbi tethering kateter yerleştirilmesine yardımcı olur. Dördüncü olarak, SNP gibi güçlü bir vazodilatör kullanımı kan ve arteriyol ve kılcal damarların tam dolgu hem de yardımcı olacaktır5,8. Beşincisi, kateteri PAT'e yerleştirirken ucu çatallamanın içine gömmemeye dikkat edin. Bu akış bir dengesizlik neden olur, sol veya sağ tarafa polimer bileşik şant, eşit olmayan bir basınç gradyan verimli. Altıncı olarak, bir şırınga pompası kullanımı kullanıcı oranı kontrol etmek ve hem fare zorlanma ve yaş için ses titret sağlayacaktır. Son olarak, kalp / akciğerler torasik kavite geri kalanına bağlı bırakın, bir gecede düzeltmek, ve ertesi gün kaldırın. Akciğerler iyi sabit olacak ve ayırma sırasında kazara çentikler nedeniyle deflasyon potansiyeli en aza indirilecektir.
Bu metodoloji istenilen sonuçları elde ederken, alternatif teknikler bazı kullanıcılar için yararlı olabilir. Kateterin yerleştirilmesine yardımcı olmak için bir mikromanipülatör kullanılabilir. Kararlı bir taban sağlarken zaten sınırlı olan bir çalışma alanına tecavüzü en aza indirmek için küçük profilli ve manyetik tabanı olan bir sürüm seçtik (manyetik bir taban kullanıyorsanız, mıknatısın devreye girmesine izin vermek için çalışma alanının altına çelik bir plaka yerleştirin. Bu, kullanıcının kateterin ucunu PAT'te arterin doğal yörüngesini takip eden bir açıya tam olarak yerleştirmesini sağlar. Ayrıca kateter güvenlidir ve yerinden edilme riski daha azdır. Başka bir seçenek trompetli kateter ucu8kullanımıdır. Oluşturmak için önemsiz olmasa da, trompetli bir kateter çok daha güvenli ve yanlışlıkla PAT dışına kaymaya daha az eğimli. Polimer oranını değiştirme:dilüent viskozite ve küçük damarların doldurulur kolaylığı değiştirir. Hedef vaskülatür ve deneysel uç noktalara bağlı olarak bu değerli bir husus olabilir. CO2 ile ötanazi hayvanların küçük bir yüzdesi pulmoner kanamaya neden olabilir ve zorlanma bağımlı22. Bu deneysel uç noktaları etkiliyorsa alternatif bir ötenazi protokolü düşünün. Akciğerleri şişirirken formalin kullanımı verilen basınçta organın fiksasyonuna yardımcı olur. Periferik damarların sabitlenmemiş bir durumda doldurulması gerektiğinde fizyolojik olarak nötr bir tampon değiştirilebilir. İnfüzyon hızı ve kontrolü belirli bir deney için daha az öneme sahipse, elle perfüzyon da mümkündür. El enjeksiyonu, aşırı dolgu veya damar yırtılması önlemek için büyütme altında uygulama ve gerçek zamanlı izleme gerektirir8. Son olarak, doku montaj / koşullar, tarama parametreleri ve bu kağıt için istihdam minimal post-processing sadece bir başlangıç noktası olarak hizmet etmelidir. Farklı tarayıcılar, dokular, deneysel uç noktalar/kullanıcı ihtiyaçları alternatif parametreler talep edebilir.
Bu teknikten elde edilen vasküler görüntüler etkileyici olsa da, sınırlamalar vardır. Öncelikle, yukarıdaki yöntem infüzyon sırasında intravasküler basıncı izlemek ve kontrol edememe nedeniyle vasküler kalibre ölçmek için suboptimal olduğunu. Diğer gruplar sürüş basıncıizleyereksistemik vaskülatürde bu basınç endişeleri biraz ele başardık 4,23, Ancak, Bu tür endişeler daha pulmoner tarafında basınçlarda küçük değişiklikler ile kolayca ayrıştırılabilir nispeten ince pulmoner arter duvarları nedeniyle yükseltilir24 ve tam olarak ölçmek ve pulmoner intravasküler basıncı kontrol edememe.
Bu yöntemin ikinci bir sınırlama bir postmortem, tek zaman noktası deney, gerçekten fizyolojik koşullar veya bir zaman ders gerektiren çalışmalarda yarar sınırlayan kalır. BT pulmoner anjiyografi (CTPA) veya kontrastlı μCT (CE-CT) gibi diğer canlı hayvan önlemleri fonksiyonel ve morfolojik önlemler alma olanağı sunar. Tekrarlanan taramalar/uzunlamasına çalışmalar ve kardiyak/pulmoner döngüde farklı noktalarda ölçümler,10,25,,26,27,28olarak incelenebilir. Bu yöntemler güvenilir bir şekilde kullanılabilir, ekokardiyografi ek olarak, arteriyel kalibre ölçmek için. Ancak, hem CTPA hem de ekokardiyografi ölçüleri şu anda proksimal vaskülatürlerin değerlendirilmesi ile sınırlıdır. Ekokardiyogram için, CTPA potansiyel olarak 1-2 siparişler dal pulmoner arter kaliber yeterli hesaplama sağlar ise değerlendirme pulmoner gövde ile sınırlıdır, ancak çözünürlük sınırlıdır, vaskülature distal kısımları gizleme7. Radyasyon dozu da dikkatle çoklu-tkan uzunlamasına çalışmalarda özellikle CT kullanırken izlenmesi gereken bir endişe29,30. Bu uygulamalardan herhangi biri için, μCT ekipmanı, tarama süresi ve analiz yazılımı pahalı olabilir ve özel personel eğitimi gerektirebilir. Bazı kurumlardaki hayvan görüntüleme temel tesisleri bu yükü hafifletebilir.
Bu bileşiğin alternatifi olarak, bazı gruplar yumuşak doku kaldırma 31 ,,32eşliğinde geleneksel korozyon döküm teknikleri kullanmak .31 Bu yöntemler bu polimer bileşiğinbenzer sonuçlar verir, ancak son ürün kırılgandır ve potansiyel artifakı15'eyol açmaktadır. Buna ek olarak, yumuşak doku çıkarılması gelecekteki histoloji potansiyelini ortadan kaldırır33. Başka bir seçenek yumuşak doku bozulmadan bırakmak ve yumuşak doku "temizlenir" örnek neredeyse şeffaf34,35render bir takip adım gerçekleştirmektir. Doku temizleme kullanıcıya bir örnek içinde daha derin görme yeteneği verir, ancak, genel olarak, aynı 3D görselleştirme sağlayamadığı için μCT'den daha düşük kalır. Seri histolojik kesit ve dizi tomografisi son derece yüksek çözünürlük sunan yöntemlerdir. Bu teknik heyecan verici yeni olanaklara kapı açarken, iş yükü katlanarak daha yüksek tir ve özellikle büyük kohortlar11,,12. 3D x-ray histolojisi, çiftlerin hem CT hem de geleneksel histoloji, hatta EM36,37,38gibi yıkıcı olmayan bir yaklaşımdır. Daha sonra rutin histoloji39ile takip edilir ilgi alanları belirlemek ve doğru bir şekilde izci μCT kullanarak patoloji daha yüksek düzeyde bir görünüm alır. Daha düşük çözünürlüklü kontrast maddeleri (veya bazı durumlarda kontrast) yerine polimer bileşik vaskülatür içine mümkün olduğunda her iki tekniği yükseltmek için hizmet verebilir. Henüz hesaplama yoğun bir diğer tahribatsız yaklaşım, potansiyel kontrast artırır, faz alma μCT görüntüleme40,41. Kontrastın zayıf olduğu veya mümkün olmadığı gürültülü verilerde kullanıldıklarında bu yöntem değerli olabilir42. Ancak bu teknikte kullanılan polimer bileşiği bu sınırlamadan muzdarip değildir. Bununla birlikte, faz alma polimer bileşiğinin muhtemelen seyreltildiği yerlerde yararlı olabilir, örneğin distal vaskülatür43. Son olarak, stereoloji44yıldır akciğer kantitatif yapısal analizinde bir standart olmuştur. Seçilen örneklerin yeterince temsil olduğunu varsayarak 3-B çıkarımlar yapmak için doku kesitleri üzerinde rastgele, sistematik örnekleme kullanır. Güçlü bir araç olsa da, hata ve önyargıya yol açma potansiyeline sahiptir. Stereoloji ile CT görüntüleme birleştirerek, ancak, büyük söz tutar45.
Özetlenen yöntem nispeten basittir ve eğitim ile >90% bir başarı oranı elde edilebilir. Bir kez hakim, akciğer vaskülatür tam ve güvenilir döküm sağlar. Fiksatif olarak, doku ve polimer gelecekteki taramalar için süresiz olarak istikrarlı kalır, potansiyel histoloji, veya EM46,47. Bu tekniğin yetişkinlik te P1 gibi genç hayvanlarda kullanılabileceğini ve pulmoner arter yoluyla embriyonik döküme ulaşılabileceğine inanıyoruz. Bu tekniğin kateter giriş noktasını değiştirerek ve uygun uç noktaları belirleyerek hemen hemen diğer vasküler yataklara uygulanabileceği unutulmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen NHLBI İntramural Araştırma Programı (DIR HL-006247) tarafından desteklenmiştir. Görüntü edinimi ve analizinde rehberlik için NIH Mouse Görüntüleme Tesisi'ne teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099 (2011).
- Hong, S. H., et al. Development of barium-based low viscosity contrast agents for micro CT vascular casting: Application to 3D visualization of the adult mouse cerebrovasculature. Journal of Neuroscience Research. 98 (2), 312-324 (2019).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24 (2016).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3740 (2012).
- Zhang, H., Faber, J. E. De-novo collateral formation following acute myocardial infarction: Dependence on CCR2(+) bone marrow cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 87, 4-16 (2015).
- Kim, B. G., et al. CXCL12-CXCR4 signalling plays an essential role in proper patterning of aortic arch and pulmonary arteries. Cardiovascular Research. 113 (13), 1677-1687 (2017).
- Counter, W. B., Wang, I. Q., Farncombe, T. H., Labiris, N. R. Airway and pulmonary vascular measurements using contrast-enhanced micro-CT in rodents. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (12), 831-843 (2013).
- Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. Journal of Surgical Research. 207, 115-122 (2017).
- Schuster, D. P., Kovacs, A., Garbow, J., Piwnica-Worms, D. Recent advances in imaging the lungs of intact small animals. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 30 (2), 129-138 (2004).
- Samarage, C. R., et al. Technical Note: Contrast free angiography of the pulmonary vasculature in live mice using a laboratory x-ray source. Medical Physics. 43 (11), 6017 (2016).
- Grothausmann, R., Knudsen, L., Ochs, M., Muhlfeld, C. Digital 3D reconstructions using histological serial sections of lung tissue including the alveolar capillary network. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (2), 243-257 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bussolati, G., Marchio, C., Volante, M. Tissue arrays as fiducial markers for section alignment in 3-D reconstruction technology. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (2), 438-445 (2005).
- Preissner, M., et al. Application of a novel in vivo imaging approach to measure pulmonary vascular responses in mice. Physiological Reports. 6 (19), 13875 (2018).
- Junaid, T. O., Bradley, R. S., Lewis, R. M., Aplin, J. D., Johnstone, E. D. Whole organ vascular casting and microCT examination of the human placental vascular tree reveals novel alterations associated with pregnancy disease. Scientific Reports. 7 (1), 4144 (2017).
- Bolender, R. P., Hyde, D. M., Dehoff, R. T. Lung morphometry: a new generation of tools and experiments for organ, tissue, cell, and molecular biology. American Journal of Physiology. 265 (6), Pt 1 521-548 (1993).
- Savai, R., et al. Evaluation of angiogenesis using micro-computed tomography in a xenograft mouse model of lung cancer. Neoplasia. 11 (1), 48-56 (2009).
- Ehling, J., et al. Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization. American Journal of Pathology. 184 (2), 431-441 (2014).
- Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis. Journal of Surgical Research. 184 (1), 365-373 (2013).
- Zhang, H., Jin, B., Faber, J. E. Mouse models of Alzheimer's disease cause rarefaction of pial collaterals and increased severity of ischemic stroke. Angiogenesis. 22 (2), 263-279 (2019).
- Faight, E. M., et al. MicroCT analysis of vascular morphometry: a comparison of right lung lobes in the SUGEN/hypoxic rat model of pulmonary arterial hypertension. Pulmonary Circulation. 7 (2), 522-530 (2017).
- Fisher, S., Burgess, W. L., Hines, K. D., Mason, G. L., Owiny, J. R. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (6), 811-815 (2016).
- Munce, N. R., et al. Intravascular and extravascular microvessel formation in chronic total occlusions a micro-CT imaging study. JACC Cardiovascular Imaging. 3 (8), 797-805 (2010).
- Shifren, A., Durmowicz, A. G., Knutsen, R. H., Faury, G., Mecham, R. P. Elastin insufficiency predisposes to elevated pulmonary circulatory pressures through changes in elastic artery structure. Journal of Applied Physiology. 105 (5), 1610-1619 (2008).
- Sonobe, T., et al. Imaging of the closed-chest mouse pulmonary circulation using synchrotron radiation microangiography. Journal of Applied Physiology (1985). 111 (1), 75-80 (2011).
- Ritman, E. L. Micro-computed tomography of the lungs and pulmonary-vascular system. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (6), 477-480 (2005).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography: a robust ECG-less paradigm for deriving cardiac phase information and functional imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Ford, N. L., Thornton, M. M., Holdsworth, D. W. Fundamental image quality limits for microcomputed tomography in small animals. Medical Physics. 30 (11), 2869-2877 (2003).
- Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. Small-animal X-ray dose from micro-CT. Molecular Imaging. 3 (3), 149-158 (2004).
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--standard method for studying microvessels. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 48 (3), 257-261 (2007).
- Polguj, M., et al. Quality and quantity comparison study of corrosion casts of bovine testis made using two synthetic kits: Plastogen G and Batson no 17. Folia Morphologica (Warsz). 78 (3), 487-493 (2019).
- Verli, F. D., Rossi-Schneider, T. R., Schneider, F. L., Yurgel, L. S., de Souza, M. A. Vascular corrosion casting technique steps. Scanning. 29 (3), 128-132 (2007).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Albers, J., Markus, M. A., Alves, F., Dullin, C. X-ray based virtual histology allows guided sectioning of heavy ion stained murine lungs for histological analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7712 (2018).
- Katsamenis, O. L., et al. X-ray Micro-Computed Tomography for Nondestructive Three-Dimensional (3D) X-ray Histology. American Journal of Pathology. 189 (8), 1608-1620 (2019).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Wen, H., et al. Correlative Detection of Isolated Single and Multi-Cellular Calcifications in the Internal Elastic Lamina of Human Coronary Artery Samples. Scientific Reports. 8 (1), 10978 (2018).
- Zamir, A., et al. Robust phase retrieval for high resolution edge illumination x-ray phase-contrast computed tomography in non-ideal environments. Scientific Reports. 6, 31197 (2016).
- Yu, B., et al. Evaluation of phase retrieval approaches in magnified X-ray phase nano computerized tomography applied to bone tissue. Optics Express. 26 (9), 11110-11124 (2018).
- Bidola, P., et al. Application of sensitive, high-resolution imaging at a commercial lab-based X-ray micro-CT system using propagation-based phase retrieval. Journal of Microscopy. 266 (2), 211-220 (2017).
- Norvik, C., et al. Synchrotron-based phase-contrast micro-CT as a tool for understanding pulmonary vascular pathobiology and the 3-D microanatomy of alveolar capillary dysplasia. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (1), 65-75 (2020).
- Weibel, E. R. Lung morphometry: the link between structure and function. Cell and Tissue Research. 367 (3), 413-426 (2017).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Sarhaddi, D., et al. Validation of Histologic Bone Analysis Following Microfil Vessel Perfusion. Journal of Histotechnology. 35 (4), 180-183 (2012).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
