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Bioengineering

从人体 iPS 细胞中提取的网状工程心脏组织用于活体心肌修复

doi: 10.3791/61246 Published: June 9, 2020

Summary

本协议产生网状工程心脏组织,其中包含来自人类诱导多能干细胞的心血管细胞,以便研究心脏病的细胞植入疗法。

Abstract

目前的协议描述了产生可扩展的网状工程心脏组织(ECTs)的方法,这些组织由来自人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的心血管细胞组成,这些细胞朝着临床使用的目标发展。HiPSC衍生的心肌细胞、内皮细胞和血管壁画细胞与凝胶基质混合,然后倒入具有矩形内部交错柱的聚二甲基硅氧烷(PDMS)组织模具中。到培养日,14个ETS成熟成一个1.5厘米x1.5厘米的网状结构与0.5毫米直径的硫纤维束。心肌细胞与每个束的长轴对齐,并自发地同步跳动。这种方法可以放大到更大的(3.0 厘米 x 3.0 厘米)网格 ECT,同时保持构造成熟度和功能。因此,从hiPSC衍生心脏细胞产生的网状EEC对于心脏再生范式可能是可行的。

Introduction

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许多临床前研究和临床试验已经确认了细胞为基础的心脏再生疗法对心脏1,2,3,2失败的有效性。在各种细胞类型中,人类诱导多能干细胞(hiPSCs)凭借其增殖能力、产生各种心血管血统4、5,和全源性的潜力,有希望的细胞来源。此外,,组织工程技术已经使得将数百万个细胞转移到受损的心脏5,6,7,8。6,758

此前,我们报告了从hiPSC衍生的心血管系生成三维(3D)线性工程心脏组织(ECTs),使用商用的培养系统进行3D生物人工组织5,5,7。我们发现,ECT内血管内皮细胞和壁画细胞与心肌细胞共存,促进了结构和电生理组织的成熟。此外,我们验证了在免疫耐受大鼠心肌梗塞模型中植入hiPSC-ECTs的治疗潜力,以改善心脏功能,再生心肌,增强血管生成5。然而,此方法构建的线性 EC 是 1 mm x 10 mm 圆柱体,因此不适合植入临床前研究与较大的动物或临床用途。

基于成功利用组织模具利用大鼠骨骼肌细胞和心肌细胞9、人类ESC衍生心肌细胞10和小鼠 iPSCs 11生成多孔工程组织形成,我们开发了一种协议,利用聚二11氧化硅氧烷 (PDMS) 霉菌生成可扩展的 hiPSC 衍生更大的可植入组织。我们评估了一系列模具几何形状,以确定最有效的模具特性。与缺少毛孔或结的薄板或线性格式相比,具有多个束和结的网状 EC 在细胞生存能力、组织功能和可伸缩性方面表现出出色的特性。我们把网状ECT植入大鼠心肌梗死模型,并确认其治疗效果类似于植入的圆柱形ECT12。在这里,我们描述了生成 hiPSC 派生网格形状的 ECT 的协议。

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Protocol

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1. 维护高保和心血管分化

  1. 在从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF-CM)中提取的有条件介质中,在具有人类基本成纤维细胞生长因子(hbFGF)的中,在薄涂层基底膜基质(生长因子减少,1:60稀释)4上扩展和维护hiPSC。
    注:我们使用了hiPSCs(4因子(10月3/4,Sox2,Klf4和c-Myc)行:201B6)。在每个细胞系的适当浓度下添加 hbFGF。拉米宁-511片段也可用于培养皿的涂层,而不是地下室膜基质。专为无馈线培养的 hiPSC 培养而设计的商用介质可用作 MEF-CM 的替代品。
  2. 当细胞汇合达到90\u2012100%时,使用宇宙(0.48 mM乙酰乙酸(EDTA)溶液分离和分离细胞。
    注:还可用于其他用于细胞分离的商用产品。
  3. 在 MEF-CM 中具有 hbFGF 和培养的基质涂层细胞培养板上,以 10,000 个细胞/mm2 的密度进行板状细胞,培养两到三天。
  4. 当培养成为完全汇合时,用基质覆盖细胞(1:60 稀释与 MEF-CM)一天。
  5. 将 MEF-CM 更换为 RPMI 1640 + B27 介质。将 100 ng/mL 的 Activin A 和 100 ng/mL 的 Wnt3A 添加到介质中一天。
    注:这是区分的第 0 天。为了调节规范的Wnt信号,还可以使用GSK3+抑制剂代替Wnt3A。
  6. 在差异化的第 1 天,将介质更改为新的 RPMI 1640 + B27,BMP4 的 10 ng/mL 和 hbFGF 的 10 ng/mL。培养细胞为两个(MC协议)或四个(CM+EC协议)天没有中等变化5。
    注:CM+EC协议经过优化,可同时诱导心肌细胞(CM)和血管内皮细胞(EC)。MC 协议经过优化,可优先诱导血管壁画细胞 (MC)。
  7. 用于电磁和 EC 诱导的 CM+EC 协议(图 1A)。
    1. 用 RPMI 1640 + B27 更换分化第 5 天的介质,并辅以 50 ng/mL 的 VEGF165
    2. 每 48 小时更换培养培养,直到第 13\u201215 天分化。
  8. 血管壁画细胞诱导的MC协议 (图1B
    1. 在分化的第 3 天,用 RPMI1640 ± 10% 胎儿牛血清 (FBS) 代替介质。
    2. 每 48 小时更换培养培养,直到第 13\u201215 天分化。

2. 分化日13\u201215细胞收获和血统分析

  1. 用 Ca2+ 和 Mg2+ 自由磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞。
  2. 在细胞培养盘中加入细胞分离溶液(含有蛋白酶、胶原酶和DNAse)以覆盖盘子。在37°C下孵育板5分钟。
  3. 孵化后使用移液器收集细胞,用培养培养培养培养体分离细胞。
  4. 分配 1 x 106 个细胞进行流式细胞分析。为了消除死细胞,用可修复的可行染料染色细胞。
  5. 用 5% FBS 用 PBS 中的膜表面标记染色细胞。在荧光活性细胞分选 (FACS) 染色缓冲液中使用以下抗体稀释剂:抗PDGFR®(1:100)、抗VE卡德林(1:100)、抗TRA-1-60(1:20)。
  6. 对于细胞内蛋白质,在PBS中用4%的甲状甲醛(PFA)重新暂停和修复细胞。
  7. 用5%FBS和0.75%的萨波宁用特洛平宁T(cTnT)的抗心脏异构体染色细胞,然后用488只小鼠IgG1(稀释1:50)标记cTnT抗体。
  8. 用 5% FBS 将 PBS 中的染色细胞重新暂停,并用细胞过滤器将它们放入 FACS 管中。
  9. 使用流式细胞分析每个分化协议的染色细胞的细胞组成,以方便生成具有明确谱系分布的细胞悬浮液。
    注:执行此程序时,ECT 的剩余电池悬浮液保存在 4 °C 冰箱中。

3. PDMS组织模具的制造

  1. 通过以 10:1 的比例混合预聚聚合物和交联溶液,在 80°C 下固化 3 小时,施用 0.5 mm 厚且超过 30 mm x 30 mm 的聚二氧化硅氧烷 (PDMS) 层。
  2. 切割 PDMS 板材,用硅胶粘合,以在交错位置制造 21 mm x 20.5 mm 矩形托盘,长 7 毫米、宽 0.5 毫米和 2.5 毫米高矩形柱。两行柱子之间的水平柱间距为 2.5 mm(图 2B)。
  3. 在 120 °C 下将托盘自动保存 20 分钟。
  4. 在 PBS 中用 1% 的马球 407 涂覆托盘 1 小时。冲洗马球 407,并在使用前用 PBS 充分冲洗模具。

4. ECT 结构

  1. 细胞系分析后,结合CM+EC和MC协议的细胞,使MC的最终浓度为10-20%,每个构造的细胞数为600万个细胞
  2. 悬浮在ECT培养基中混合的600万细胞(α最小基本培养基辅以10%FBS、50μM 2-甲醇和100 U/mL青霉素-链霉素)。
  3. 矩阵解决方案的准备
    1. 将酸溶性大鼠尾胶原蛋白 I 型溶液(2 mg/mL,pH 3)与 17 μL 的最小基本介质 (MEM) 混合 133 μL。然后将溶液与 17 μL 碱缓冲液(0.2 M NaHCO3、0.2M HEPES 和 0.1 M NaOH)混合。
      注:胶原蛋白必须保存在冰上(4 °C)。检查缓冲区颜色,如果混合所有溶液时介质未变粉红,则向介质添加额外的碱缓冲。混合步骤必须混合胶原蛋白 I = 10x MEM,然后添加碱缓冲液。不要更改此顺序。不要在混合物中产生气泡。
    2. 在中和胶原蛋白溶液中加入67μL的基底膜基质。
      注:混合溶液必须保存在冰上(4°C)。
  4. 在1,100 rpm(240 x g)下将含有600万个细胞的制备细胞悬浮液离心5分钟,用167μL的高葡萄糖DMEM +20% FBS = 1% 青霉素链霉素 (100x) 重新悬浮细胞。
  5. 混合细胞悬浮液和矩阵溶液。一个构造的细胞/基体混合物的总体积为 400 μL。
    注:在此步骤中,细胞/基体混合物应为非粘性和粉红色。保持在冰上,因为凝胶将在室温下凝固。胶原蛋白 I 型的最终浓度为 0.67 mg/mL。
  6. 将细胞/基体混合物均匀地倒在 Poloxamer 407 涂层 PDMS 组织模具上,该模具被放置在六井培养板12 中
    注:小心倒注混合物,避免产生气泡,以防止灌装凝胶中的缺陷。
  7. 在标准CO2培养箱(37C,5 % CO2)中孵育细胞/基质混合物60分钟。
  8. 组织形成后,用4 mL的ECT培养培养培养中浸泡组织模具。
    注:虽然单元格/矩阵在 60 分钟内交联,但构造仍然非常脆弱。轻轻添加介质,以免损坏。
  9. 培养组织14天,每天中等变化。
  10. 在 ECT 植入之前,使用消毒的细钳将 ECT 从装载柱中轻轻取出。
    注:从模具中去除后的最终 ECT 尺寸小于原始模具。2.1 厘米 x 2.05 厘米模具可产生约 1.5 厘米 x 1.5 厘米的释放 ECT。较大的 3.9 厘米 x 4.05 厘米模具可生成约 3 厘米 x 3 厘米的 ECT。卸载ECT在温暖的文化媒介中表现出内在的自发跳动。尽管它最初维护网格结构,但卸载的 ECT 会随着时间的推移而收缩和凝结。有可能用细钳轻轻地握住组织,然后用 7-0 丝缝合将 ECT 连接到史诗上。

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Representative Results

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图1A,B 显示了CM+EC和MC协议的示意图。从CM+EC协议和MC从MC协议诱导CM和EC后,细胞混合调整最终MC浓度,以代表10-20%的总细胞。2 厘米宽的组织模具是根据 0.5 mm 厚 PDMS 板材(图2A,B) 的设计图纸制造的。600万个CM+EC+MC细胞与胶原蛋白一结合,并用基质和马球407预涂的组织模具(图2C)在初步实验中,我们制造了各种图案的组织模具,其特点是柱长和间距不同,并确认了ECT的最终几何形状(图3)。我们为本研究选择了长7毫米、宽间隔为2.5毫米的模具。

Poloxamer 407 可防止细胞粘附在模具上,并在 14 天内快速压缩凝胶后形成特征网格结构(图4)。即使在 ECT 从模具中释放后,这种结构也得到维护。整个组织大约1.5厘米宽,0.5毫米厚,网状物中每个束的宽度平均约为0.5毫米。

可以生成一个 3 厘米的最终宽度网格 ECT,其中包含 2400 万个细胞,该模组具有四倍大的模具,具有相同的交错后设计(图 5A,B)。这种较大的网格ECT可以很容易地从模具中去除,并产生相当于较小的网格ECT的局部活动力(图5C)。

Figure 1
图1:将心血管细胞与人类诱导多能干细胞区分开来的协议。用于诱导心肌细胞和血管内皮细胞(A,CM+EC协议)和诱导血管壁画细胞(B,MC协议)的协议的示意图。CM = 心肌细胞;EC = 内皮细胞;MC = 血管壁画细胞;iPSC = 诱导多能干细胞;MG = 地下室膜矩阵;ActA = 活性 A;Wnt3a, BMP4, 骨形态遗传蛋白 4;bFGF = 基本成纤维细胞生长因子;VEGF = 血管内皮细胞生长因子;FBS = 胎儿牛血清。这个数字是根据参考Masumoto等人5。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:PDMS组织模具和ECT结构的制造。A) 由 0.5 mm 厚 PDMS 板材制造的 ECT 模具的代表性图像。(B) PDMS组织模具设计,内部柱子7毫米长,排列在交错位置;前视图(上面板)和侧视图(下面板)。(C) ECT结构的原理图协议,来自hiPSC衍生的心血管细胞和基质凝胶。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:组织模具设计对最终ECT几何形状的影响。A) 柱长度 (PL) 和水平柱间距 (HPS) 的定义。(B) 一种无矩形柱 (PL0) 的组织模具,并形成表 ECT。(C+u2012E)具有不同 PL/HPS 和网状 EC 的组织模具。(F) 具有长平行柱的组织模具,形成多线性ECT. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:凝胶压实后网状ECT的形成。显示了从第 0 天到第 14 天的网格 ECT 成熟代表性系列图像。细胞/基体倒入 PDMS 组织模具(第 0_0 h),一小时后添加培养基(第 0_1 小时)。第 1 天,在装载柱周围观察到椭圆孔。该结构显示快速凝胶压实,并成熟成网状组织后。第14天,组织从模具中释放。卸载的 ECT 维护网格几何体。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:大型网格ECT的代表性图像,用于大型动物临床前试验和临床试验。A) 设计 4 厘米 x 4 厘米 PDMS 组织模具,有 7 毫米长柱和 (B) 模具图像.(C) 3 厘米 x 3 厘米大网格 ECT 的代表性图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图1:网状EC的病理和电生理评价。A) 在网状ECT中,用霍赫斯特33342(蓝色)染色的带状图像,用于活细胞,代表三代(红色)用于死细胞。比例线:250 μm。(B) 三维共物图像的三维共物图像在网格 ECT 中染色的心脏肌片 T (绿色) 。捆绑包中的局部心肌细胞方向被可视化为小线,其中线颜色表示圆周(绿色)、径向(红色)和轴向(蓝色)方向的幅度。(C) 球面直方图显示局部心肌细胞方向。每条光线的体积表示每个方向的相对计数,粗红线表示平均 CM 方向。(B) 和 (C) 根据参考号13 改编,并 修订。(D) 合同力测量的代表性图像。在1.5厘米×1.5厘米网格ECT的红色虚线上被切断一段,并使用10-0尼龙缝合线连接到肌肉测试系统。白色箭头表示力传感器,黄色箭头表示高速长度控制器。(E) 在1.5赫兹至4赫兹的不同起搏频率下,有源应力的代表性波形。 请点击此处下载此数字。

补充视频 1: 第 14 天网格 ECT 中交汇点的内在跳动。请点击这里下载此视频。

补充视频 2: 第 14 天在网格 ECT 中对捆绑包的内在跳动。请点击这里下载此视频。

补充视频 3: 从组织模具释放后, 第 14 天网格 ECT 的内在跳动。请点击这里下载此视频。

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Discussion

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在完成对线性格式(hiPSC衍生的ECT5)的调查后,我们调整了协议,将hiPSC衍生的CMs、EC和MC混合在一起,以促进ETC内血管细胞的体外扩张,以及ECT和接受者心肌之间随后的体内血管耦合。

为了促进更大、可植入的网格 ECT 几何的生成,我们使用薄的 PDMS 表设计 3D 模具,加载柱排列在交错位置。在初步实验中,我们注意到ETS在凝胶压实过程中粘附在PDMS柱上,因此我们修改了方法,用表面活性剂马球剂涂覆每个模具,以防止细胞粘附,这是本协议9的关键步骤。在体外成熟期间,EECT 与内部装载柱和模具底部保持分离,从而促进凝胶压实和从模具中去除 ECT。协议的另一个关键步骤是,在基体凝固之前,将细胞凝胶基质混合物均匀地倒入 PDMS 模具中。在短时间内完成该过程至关重要。还应避免细胞凝胶基质混合物中的气泡,因为它可能导致结构性气化和功能中断 EC。

根据生存能力测定,大约97%的细胞在14天内存活(补充图1A)。补充图1B显示整个安装共生图像染色的cTnT表示与局部捆绑长轴平行的 myofiber 对齐 (补充图1C)13。所有构造在 72 h 内开始内在自发跳动,并在培养过程中继续跳动 (补充视频 1\u20123)。我们使用自定义隔离肌肉测试系统(补充图1D)分析了 1.5 厘米 x 1.5 厘米 ETS 的机电特性。ET 显示最大起搏捕获速率为 4 Hz,在 2 Hz 时产生平均有源应力 0.55 mN/mm2,5 V 起搏协议(n = 11,标准误差意味着 = 0.063;补充图 1E.

虽然我们选择了 7 mm 长的内部装载柱,间隔为 5 mm,但通过排列装载柱的长度和相邻柱之间的间隔,可以更改最终的 ECT 几何形状(图 3)。此外,可以扩展 1.5 厘米 x 1.5 厘米 EC 的尺度,以更大的格式,如 3 厘米 x 3 厘米大网状 ECT。根据力测量,3 厘米 x 3 厘米 ET 显示的机电性能类似于 1.5 厘米 x 1.5 厘米 ETS12。组织形状的灵活性和具有保留的组织功能的可伸缩性是本协议对现有方法的意义。

本协议的一个限制是 PDMS 模具是 PDMS 板材手工组装的。虽然通过手工组装构建毫米单元模具是可行的,但光刻或主模具铸造的模具更适合于扩展和稳定的 ECT 生成。

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Disclosures

作者没有财务或科学冲突要披露。

Acknowledgments

这项工作得到了路易斯维尔大学Kosair慈善儿科心脏研究项目和RIKEN生物系统动力学研究中心的有机物项目的支持。我们发布的协议中使用的HIPSC由日本京都大学 iPS 细胞研究和应用中心提供。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style Falcon/ Thomas scientific 9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS Falcon / Thomas scientific 6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761036
Reagents
Accumax Innovative Cell Technologies AM-105
BMP4, recombinant (10µg) R&D RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma C3867
Growth factor-reduced Matrigel Corning 356231
Human VEGF (165) IS, premium grade Miltenyi 130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Molecular Probes P-6866
Recombinant human bFGF WAKO 060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) R&D 338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg) R&D 5036-WN
Versene solution Gibco 15040066
Culture medium and supplements
10x MEM Invitrogen 11430
2 Mercaptro Ethanol SIGMA M6250
B27 supplement minus insulin Gibco A1895601
DMEM, high glucose Gibco 11965084
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
L-Glutamine Gibco 25030081
NaHCO3 Any
PBS 1x Gibco 10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) Gibco 15070-063
RPMI1640 medium Gibco 21870092
αMEM Invitrogen 11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences BD / Fisher 560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision Fisher MS-295-P0
BD FACS Clean Solution BD 340345
BD FACSFlow Sheath Fluid BD 342003
BD FACSRinse Solution BD 340346
EDTA Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) Corning 352235
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Molecular Probes L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences BD / Fisher 558821
Saponin Sigma-Aldrich 47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences BD / Fisher 560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit Molecular Probes Z25002

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References

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从人体 iPS 细胞中提取的网状工程心脏组织用于活体心肌修复
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Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).More

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).

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