Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo
Summary
Le protocole actuel génère des tissus cardiaques en forme de maille contenant des cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour permettre l’étude de la thérapie d’implantation cellulaire pour les maladies cardiaques.
Abstract
Le protocole actuel décrit les méthodes de production de tissus cardiaques évolutifs et en forme de maille (ECT) composés de cellules cardiovasculaires dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs), qui sont développées vers l’objectif de l’utilisation clinique. Les cardiomyocytes dérivés de HiPSC, les cellules endothéliales et les cellules murales vasculaires sont mélangés à une matrice de gel, puis versés dans un moule tissual polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des poteaux rectangulaires décalés internes. Par jour de culture, 14 ECT mûrissent en une structure en maille de 1,5 cm x 1,5 cm avec des faisceaux de myofiber de 0,5 mm de diamètre. Les cardiomyocytes s’alignent sur le long axe de chaque faisceau et battent spontanément de façon synchrone. Cette approche peut être étendue jusqu’à un plus grand (3,0 cm x 3,0 cm) maillage ECT tout en préservant la maturation de la construction et la fonction. Ainsi, les ECT en forme de maille générées par les cellules cardiaques hiPSC-dérivées peuvent être réalisables pour les paradigmes de régénération cardiaque.
Introduction
De nombreuses études précliniques et essais cliniques ont confirmé l’efficacité des thérapies régénératrices cardiaques à base de cellules pour les cœurs défaillants1,2,3. Parmi divers types de cellules, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) sont des sources de cellules prometteuses en raison de leur capacité proliférative, le potentiel de générer diverses lignées cardio-vasculaires4,5, et l’allogénicité. En outre, les technologies d’ingénierie tissulaire ont permis de transférer des millions de cellules sur un cœur endommagé5,6,7,8.
Auparavant, nous avons signalé la génération de tissus cardiaques linéaires (ECT) linéaires tridimensionnels (ECT) à partir de lignées cardiovasculaires dérivées de hiPSC à l’aide d’un système de culture disponible dans le commerce pour les tissus bioartificiels 3D5,7. Nous avons constaté que la coexistence des cellules endothéliales vasculaires et des cellules murales avec des cardiomyocytes dans l’ECT a facilité la maturation structurelle et électrophysiologique de tissu. En outre, nous avons validé le potentiel thérapeutique des hiPSC-ECT implantés dans un modèle d’infarctus du myocarde de rat tolérant immunitaire pour améliorer la fonction cardiaque, régénérer le myocarde, et améliorer l’angiogenèse5. Toutefois, les ECT linéaires construits par cette méthode étaient des cylindres de 1 mm sur 10 mm et ne convenaient donc pas à l’implantation dans des études précliniques avec des animaux plus grands ou une utilisation clinique.
Basé sur l’utilisation réussie des moules de tissu pour générer la formation de tissu poreux conçu utilisant des myoblastes squelettiques de rat et des cardiomyocytes9,les cardiomyocytes humains esc-dérivés10 et les iPSCs de souris11, nous avons développé un protocole pour produire des tissus implantables plus grands hilosC-dérivés évolutifs utilisant des moules polydiméthylsiloxanes (PDMS). Nous avons évalué une gamme de géométries de moule pour déterminer les caractéristiques les plus efficaces de moule. Les ECT en forme de maille avec plusieurs faisceaux et jonctions présentaient d’excellentes caractéristiques en matière de viabilité cellulaire, de fonction tissulaire et d’évolutivité par rapport aux formats en feuilles simples ou linéaires qui manquaient de pores ou de jonctions. Nous avons implanté l’ECT en forme de maille dans un modèle d’infarctus du myocarde de rat et confirmé ses effets thérapeutiques similaires aux ECT cylindriques implantés12. Ici, nous décrivons le protocole pour générer un ECT en forme de maille dérivé de hiPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Après l’achèvement de notre étude d’un format linéaire, hiPSC dérivé ECT5, nous avons adapté le protocole pour mélanger hiPSC-dérivés CM, EC, et MC pour faciliter l’expansion in vitro des cellules vasculaires dans les ECT et le couplage vasculaire in vivo ultérieur entre ects et myocardium receveur.
Pour faciliter la génération de géométries ECT de mailles plus grandes et implantables, nous avons utilisé de fines feuilles DEDM pour concevoir les mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par le Kosair Charities Pediatric Heart Research Program de l’Université de Louisville et le projet Organoïde du RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Les HiPSC utilisés dans nos protocoles publiés ont été fournis par le Center for iPS Cell Research and Application, Université de Kyoto, Kyoto, Japon.
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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