Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

doi: 10.3791/61246 Published: June 9, 2020

Summary

Настоящий протокол генерирует сетчатой формы инженерии сердечных тканей, содержащих сердечно-сосудистые клетки, полученные из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, чтобы исследование клеточной имплантации терапии сердечных заболеваний.

Abstract

Текущий протокол описывает методы для создания масштабируемых, сетчатой формы инженерии сердечных тканей (ECTs), состоящий из сердечно-сосудистых клеток, полученных из человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые разработаны в направлении цели клинического использования. HiPSC полученных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и сосудистых клеток фрески смешиваются с гель матрицы, а затем вылил в полидиметилсилоксана (PDMS) ткани формы с прямоугольными внутренними шахматной должностей. По культуре день 14 ECTs созревают в 1,5 см х 1,5 см сетки структуры с 0,5 мм диаметром миофибер расслоения. Кардиомиоциты выравниваются к длинной оси каждого пучка и спонтанно бьют синхронно. Этот подход может быть увеличен до большего (3,0 см х 3,0 см) сетки ЭСТ при сохранении созревания конструкции и функции. Таким образом, сетчатые ЭКТы, генерируемые из сердечных клеток, полученных из hiPSC, могут быть осуществимы для парадигм регенерации сердца.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Многочисленные доклинические исследования и клинические испытания подтвердили эффективность клеточной сердечной регенеративной терапии для отказасердца 1,2,3. Среди различных типов клеток, человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) являются перспективными источниками клеток в силу их пролиферативной способности,потенциал для создания различных сердечно-сосудистых линий 4,5, и алогенности. Кроме того, технологии тканевой инженерии сделали возможным перенос миллионов клеток на поврежденное сердце5,,6,,7,,8.

Ранее мы сообщали о генерации трехмерных (3D) линейных инженерных сердечных тканей (ЭКТ) из сердечно-сосудистых линий, полученных из hiPSC, с использованием коммерчески доступной системы культуры для 3D биоискусныхтканей 5,7. Мы обнаружили, что сосуществование сосудистых эндотелиальных клеток и фресок с кардиомиоцитами в рамках ЭСТ облегчает созревание структурных и электрофизиологических тканей. Кроме того, мы подтвердили терапевтический потенциал имплантированных hiPSC-ECTs в иммунной толерантной модели инфаркта крыс миокарда для улучшения сердечной функции, регенерации миокарда, и повышения ангиогенеза5. Тем не менее, линейные ЭКТ, построенные этим методом, были 1 мм на 10 мм цилиндрами и поэтому не подходили для имплантации в доклинических исследованиях с более крупными животными или клиническом использовании.

Основываясь на успешном использовании тканевых форм для генерации пористой инженерии формирования тканей с использованием крыс скелетныхмиобластов и кардиомиоцитов 9, человека ESC полученных кардиомиоцитов10 и мыши iPSCs11, мы разработали протокол для создания масштабируемых hiPSC полученных больших имплантируемых тканей с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) формы. Мы оценили ряд геометрий плесени, чтобы определить наиболее эффективные характеристики плесени. Сетчатые ЭКТ с несколькими пучками и соединениями продемонстрировали отличные характеристики в жизнеспособности клеток, функции тканей и масштабируемости по сравнению с простым листом или линейными форматами, в которых отсутствовали поры или соединения. Мы имплантировали СЕТ в форме сетки в модель инфаркта миокарда крысы и подтвердили его терапевтические эффекты, похожие на имплантированные цилиндрическиеЭКТ 12. Здесь мы описываем протокол для создания СЕТ в форме сетки, полученной от hiPSC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Поддержание HIPSCs и сердечно-сосудистой дифференциации

  1. Расширить и поддерживать hiPSCs на тонком пальто подвале мембранной матрицы (фактор роста уменьшается, 1:60 разбавления) в кондиционированной среде извлечены из мыши эмбриональных фибробластов (MEF-CM) с основным фактором роста фибробластов человека (hbFGF)4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали hiPSCs (4-фактор (Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc) линия: 201B6). Добавьте hbFGF при соответствующей концентрации для каждой клеточной линии. Фрагмент Laminin-511 также может быть использован для покрытия культуры блюдо вместо мембранной матрицы подвала. Коммерчески доступная среда, предназначенная для культуры HIPSCs, свободной от фидеры, может быть использована в качестве замены MEF-CM.
  2. Используйте versene (0.48 mM этилендиаминетачелтетраатетическая кислота (EDTA) раствор), чтобы отделить и разъединить клетки, когда слияние клеток достигает 90-u2012100%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие коммерчески доступные продукты для диссоциации клеток также могут быть использованы.
  3. Клетки плиты при плотности 10 000 клеток/мм2 на матричных пластинах клеточной культуры в MEF-CM с hbFGF и культурой в течение двух-трех дней.
  4. Когда культура становится полностью слияние, покрыть клетки с матрицей (1:60 разбавления с MEF-CM) в течение одного дня.
  5. Замените MEF-CM на RPMI 1640 и B27 среды. Добавьте 100 нг/мл Activin A и 100 нг/мл Wnt3A в среду в течение одного дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это день 0 дифференциации. Для перерегистрации канонической сигнализации Wnt вместо Wnt3A можно также использовать ингибиторы GSK3.
  6. На первый день дифференциации измените средний на новый RPMI 1640 и B27 с 10 нг/мл BMP4 и 10 нг/мл hbFGF. Культурные ячейки в течение двух (протокол MC) или четырех (протокол CM-EC) дней без среднего изменения5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол СМЗЕК оптимизирован для одновременного индуцирования кардиомиоцитов (СМ) и сосудистых эндотелиальных клеток (ЭК). Протокол MC оптимизирован, чтобы преимущественно индуцировать сосудистые клетки фрески (MCs).
  7. Протокол CM-EC для индукции CMs и ECs(рисунок 1A).
    1. Замените носитель на 5-й день дифференциации с RPMI 1640 и B27, дополненной 50 нг/мл VEGF165.
    2. Изменение среды культуры каждые 48 ч до дня 13-u201215 дифференциации.
  8. Протокол MC для индукции сосудистых клеток фрески(рисунок 1B)
    1. Замените среду с RPMI1640 и 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в день 3 дифференциации.
    2. Изменение среды культуры каждые 48 ч до дня 13-u201215 дифференциации.

2. Сотовый сбор и анализ линии в день дифференциации 13-u201215

  1. Вымойтеклетки с Ca2 "и Mg 2" бесплатно фосфат-буферный солевой раствор (PBS).
  2. Добавить раствор диссоциации клеток (содержащий протеазы, коллагеназы и ДНК) в блюдо клеточной культуры, чтобы покрыть пластину. Инкубировать тарелку в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
  3. Соберите и отмежевать клетки с культурой среды с помощью пипетки после инкубации.
  4. Выделите 1 x 106 клеток для анализа линии с цитометрией потока. Для устранения мертвых клеток, пятно клеток с починимой жизнеспособности красителя.
  5. Пятно клеток с мембранными маркерами поверхности в PBS с 5% FBS. Используйте следующие разбавления антител в флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) окрашивание буфера: анти-PDGFR (1:100), анти-VE кадерин (1:100), анти-TRA-1-60 (1:20).
  6. Для внутриклеточных белков, resuspend и исправить клетки с 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
  7. Пятно клеток с анти-сердечной изоформы Troponin T (cTnT) в PBS с 5% FBS и 0,75% Сапонин, а затем этикетки антитела cTnT с 488 мыши IgG1 (разбавление 1:50).
  8. Resuspend окрашенных клеток в PBS с 5% FBS и положить их в facS трубки с напряжением клеток.
  9. Проанализируйте клеточный состав окрашенных клеток из каждого протокола дифференциации с цитометрией потока, чтобы облегчить генерацию клеточных суспензий с определенными распределениями линий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этой процедуры, оставшаяся подвеска ячейки для ECTs сохраняется в холодильнике 4 градусов по Цельсию.

3. Изготовление формы ткани PDMS

  1. Бросьте 0,5 мм толщиной и более 30 мм х 30 мм слой полидиметилсилоксана (PDMS) путем смешивания преполимера и перекрестного связывания раствора в соотношении 10:1, а затем вылечить при 80 градусов по Цельсию в течение 3 ч.
  2. Вырезать лист PDMS и склеить его с силиконовым клеем, чтобы изготовить 21 мм х 20,5 мм прямоугольный лоток с 7 мм в длину, 0,5 мм в ширину, и 2,5 мм высотой прямоугольные столбы в шахматном положении. Горизонтальное расстояние между двумя линиями столбов составляет 2,5 мм(рисунок 2B).
  3. Автоклав лоток при 120 градусов по Цельсию в течение 20 мин.
  4. Пальто лоток с 1% poloxamer 407 в PBS для 1 ч. Промыть poloxamer 407 и промыть плесень с PBS достаточно до использования.

4. Строительство ЭСТ

  1. После анализа клеточной линии объедините клетки из протоколов CM-EC и MC так, чтобы окончательная концентрация MCs составила от 10 до 20% в общем количестве клеток в шесть миллионов клеток наконструкцию 5.
  2. Приостановить смешанные шесть миллионов клеток в среде культуры ЭСТ (альфа-минимум существенной среды дополняется 10% FBS, 50 ЗМ 2-меркаптоэтанол и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин).
  3. Подготовка матричного раствора
    1. Смешайте 133 л растворимого кислотой растворимого крысиного хвоста коллагена типа I (2 мг/мл, рН 3) с 17 л 10-х минимальной необходимой среды (MEM). Затем смешайте раствор с 17 ЗЛ щелочного буфера (0,2 М НаХКО3,0,2 М HEPES и 0,1 М НаОХ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллаген должен храниться на льду (4 градусов по Цельсию). Проверьте цвет буфера, и если среда не станет розоватой, когда все решения смешиваются, добавьте дополнительный щелочный буфер к среде. Смешивание шаги должны быть смешать коллагена I и 10x MEM, а затем добавить щелочный буфер. НЕ меняй этот порядок. НЕ генерировать пузырьки в смеси.
    2. Добавьте 67 мкл мембранной матрицы подвала в нейтрализованный коллагеновый раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный раствор должен храниться на льду (4 градусов по Цельсию).
  4. Центрифуга подготовленной клеточной суспензии, содержащей шесть миллионов клеток при 1100 об/мин (240 х г)в течение 5 мин и повторного перерасхода клеток с 167 йл высоко глюкозы DMEM 20% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин (100x).
  5. Смешайте подвеску клетки и матричное решение. Общий объем клеточной/матричной смеси для одной конструкции составляет 400 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь клетки/матрицы должна быть невязкой и розоватым цветом на этом этапе. Держите его на льду, как гель будет затвердевать при комнатной температуре. Окончательная концентрация коллагена типа I составляет 0,67 мг/мл.
  6. Налейте клеточной / матричной смеси равномерно над poloxamer 407 покрытием PDMS ткани плесени, которая помещается в шесть хорошо культурыпластины 12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Налейте смесь тщательно, чтобы избежать генерации пузырьков, с тем чтобы предотвратить заполнение дефектов в налил гель.
  7. Инкубировать клеточной/матричной смеси в стандартном инкубаторе CO2 (37C, 5% CO2) в течение 60 мин.
  8. После того, как ткань формируется, замочите плесень ткани с 4 мл ЭСТ культуры среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что ячейка/матрица пересекается за 60 минут, конструкция все еще очень хрупкая. Добавить средний осторожно, чтобы избежать повреждения его.
  9. Культура ткани в течение 14 дней со средним изменением каждый день.
  10. Перед имплантацией ЭСТ аккуратно удалите ЭСТ с погрузочных столбов с помощью стерилизованных тонких типсов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные размеры ЭСТ после удаления из формы меньше, чем оригинальная плесень. Форма 2,1 см x 2,05 см генерирует выпущенную ЭСТ примерно 1,5 см х 1,5 см. Больше 3,9 см х 4,05 см плесень генерирует ЭСТ примерно 3 см х 3 см. Разгруженная ЭСТ показывает внутреннее спонтанное избиение в теплой среде культуры. Хотя первоначально он поддерживает структуру сетки, выгруженный ЭСТ сжимается и конденсируется с течением времени. Можно держать ткань мягко с тонкой типсов, а затем использовать 7-0 шелковый шов, чтобы прикрепить ЭСТ к эпикардии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

На рисунке 1A,B показаны схемы протокола CM-EC и MC. После индуцирования CMs и ECs из протокола CM-EC и MCs из протокола MC, клетки смешиваются, регулируя окончательные концентрации MC, чтобы представлять от 10 до 20% от общего количества ячеек. Форма ткани шириной 2 см изготовлена по чертежу из листа PDMS толщиной 0,5 мм(рисунок 2A,B). Шесть миллионов клеток CM-EC-MC сочетаются с коллагеном I и матрицей и выливаются на форму ткани, предварительно на покрытие полоксамером 407(рисунок 2C). В ходе предварительных экспериментов мы изготовили формы тканей с различными узорами, характеризующимися различными длинами столба и интервалами, и подтвердили окончательную геометрию ЭКТ(рисунок 3). Мы выбрали форму с 7 мм длинные столбы с 2,5 мм в ширину интервалы для этого исследования.

Poloxamer 407 предотвращает деление клеток к плесени и позволило сформировать характерную структуру сетки после быстрого уплотнения геля в течение 14 дней(рисунок 4). Эта структура поддерживается даже после того, как ЭСТ высвобождается из формы. Ширина всей ткани составляет около 1,5 см в ширину и 0,5 мм, а ширина каждого пучка в сетке составляет в среднем около 0,5 мм.

Можно создать 3 см окончательной ширины сетки ЭСТ, содержащей двадцать четыре миллиона клеток из четырех раз больше формы с той же шахматной конструкции поста(рисунок 5A,B). Эта большая сетка ЭСТ может быть легко удалена из формы и генерирует локаленую активную силу, эквивалентную меньшей сетке ЭСТ(рисунок 5C).

Figure 1
Рисунок 1: Протоколы для дифференцировать сердечно-сосудистые клетки от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Схематические диаграммы протоколов, используемых для индуцирования кардиомиоцитов и сосудистых эндотелиальных клеток (протокол A, CM-EC) и индуцирования сосудистых фресок (B, протокол MC). СМ и кардиомиоциты; ЕК - эндотелиальная клетка; МК и сосудистая фреска ячейки; iPSC - индуцированная плюрипотентная стволовая клетка; МГ и мембранная матрица подвала; ActA - Активин А; Wnt3a, BMP4, костный морфогенетический белок 4; bFGF - основной фактор роста фибробластов; VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста клеток; FBS - сыворотка из крупного рогатого скота плода. Эта цифра адаптирована из ссылки Masumoto et al.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Изготовление формы ткани PDMS и строительство ЭСТ. (A)Представительное изображение формы ЭСТ, изготовленной из листов PDMS толщиной 0,5 мм. (B)Конструкция формы ткани PDMS с 7 мм длинными внутренними столбами, расположенными в шахматном положении; вид спереди (верхняя панель) и боковой вид (нижняя панель). (C)Схематический протокол строительства ЭСТ из хиПСК полученных сердечно-сосудистых клеток и матричного геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние конструкций формы тканей на окончательную геометрию ЭСТ. (A)Определения длины столба (PL) и горизонтального интервала столба (HPS). (B)Форма ткани без прямоугольных столбов (PL0) и сформированная лист ЭСТ. (Cu2012E) Ткань формы с различными PL / HPS и сетки ECTs. (F)форма ткани с длинными параллельными столбами и сформировала несколько линейных ЭСТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Формирование сетки ЭСТ после уплотнения геля. Показана репрезентативная серия изображений созревания сетки ЭСТ с 0-го по 14-й день. Клетка/матрица выливается в форму ткани PDMS (День 0'0 h), затем среда культуры добавляется через час (День 0'1 h). На 1-й день вокруг погрузочных постов наблюдаются эллиптические поры. Конструкция показала быстрое уплотнение геля и созрела в ткань сетки в дальнейшем. На 14-й день ткань высвобождается из формы. Выгруженная ЭСТ поддерживает геометрию сетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные изображения более крупной сетки ЭСТ, предназначенной для крупных доклинических испытаний животных и клинических испытаний. (A) Дизайн 4 см х 4 см формы ткани PDMS с 7 мм длинныестолбыи ( B ) изображение формы. (C)Репрезентативное изображение 3 см х 3 см больше сетки ЭСТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: Патологическая и электрофизиологическая оценка сетчатых ЭКТ. (A) Представительное изображение для пучка в сетке ЭСТ, окрашенной Hoechst 33342 (синий) для живых клеток и Ethidium Homodimer III (красный) для мертвых клеток. Шкала бар: 250 мкм. (B)Репрезентативное изображение трехмерного конфокального изображения пучка в сетке ЭСТ, окрашенной сердечным тропонином Т (зеленым цветом). Локальные кардиомиоцитные ориентации в комплекте визуализируются как небольшие линии, где цвет линии указывает величину в окружном (зеленом), радиальной (красной) и осяной (голубой) направлениях. (C)сферическая гистограмма отображает местные кардиомиоциты ориентации. Объем каждого луча представляет относительное количество для каждого направления, а толстая красная линия показывает среднее направление CM. (B) и (C) адаптируются из ссылки13 с пересмотром. (D)Репрезентативное изображение измерения контрактильной силы. Сегмент был отрезан на красной пунктирной линии в 1,5 см х 1,5 см сетки ЭСТ и прикреплен к системе тестирования мышц с помощью 10-0 нейлонового шва. Белая наконечник стрелы указывает на превлододер силы, а желтая наконечник стрелы указывает на высокоскоростной контроллер длины. (E)Репрезентативные волновые формы активного стресса на разных частотах темпа от 1,5 Гц до 4 Гц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительное видео 1: Внутреннее избиение перекрестка в сетке ЭСТ на 14-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео 2: Внутреннее избиение пучка в сетке ЭСТ на 14-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео 3: Внутреннее избиение сетки ЭСТ на 14-й день после освобождения от формы ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

После завершения нашего исследования линейного формата, hiPSC производных ЭСТ5, мы адаптировали протокол для смешивания hiPSC полученных CMs, ECs, и MCs для облегчения в пробирке расширение сосудистых клеток в РАМКАХ ИТС и последующего в виво сосудистой связи между ECTs и получателя миокарда.

Для облегчения генерации больших, имплантируемых геометрий сетки ЭСТ мы использовали тонкие листы PDMS для разработки 3D-форм с погрузочными столбами, выстроенными в шахматном положении. В ходе предварительных экспериментов, мы отметили, что ECTs придерживались PDMS должности во время уплотнения геля и поэтому мы изменили наш метод, чтобы покрыть каждую форму с surfactant poloxamer для предотвращения клеточной адгезии, которая является критическим шагом настоящего протокола9. ECTs остают отделенными от внутренних столбов нагрузки и дна прессформы во время созревания in vitro, которое облегчает уплотнение геля и удаление ECT от прессформы. Другим важным шагом протокола является равномерное вылить смесь матрицы клеточного геля в форму PDMS до того, как матрица затвердеет. Очень важно выполнить процедуру в течение короткого времени. Пузыри в клеточно-гель матрицы смеси также следует избегать, поскольку это может привести к структурной вакуолации и функционального нарушения ECTs.

Согласно анализу жизнеспособности, приблизительно 97% клеток были живы в течение дня 14 конструкций(Дополнительный рисунок 1A). Дополнительный рисунок 1B показывает весь конфокальный образ горы окрашенных с cTnT представляющих myofiber выравнивание параллельно локальной расслоение длинной оси (Дополнительный рисунок 1C)13. Все конструкции начинают внутреннее спонтанное избиение в пробирке в пределах 72 ч и продолжают бить на протяжении всейкультуры (Дополнительные видео 1'u20123). Мы проанализировали электромеханические свойства 1,5 см х 1,5 см ЭКТ с помощью специальной изолированной системы тестирования мышц(дополнительный рисунок 1D). ECTs отображаются максимальные темпы захвата 4 Гц и генерируется средний активный стресс 0,55 мН /мм 2 на 2 Гц, 5 V скорость протокола (n No 11, стандартная погрешность средств 0,063; Дополнительная фигура 1E).

Несмотря на то, что мы выбрали внутренние погрузочные посты длиной 7 мм с интервалом в 5 мм, можно изменить окончательную геометрию ЭСТ, организовав длину погрузочных столбов и интервал между смежнымистолбами (рисунок 3). Кроме того, можно расширить шкалу 1,5 см х 1,5 см ЭКТ до более крупных форматов, таких как 3 см х 3 см большой сетки ЭСТ. По данным измерения силы, 3 см х 3 см ЭКТ показали электромеханические свойства, аналогичные 1,5 см х 1,5 смЭКТ 12. Гибкость форм тканей и масштабируемость с сохраненной функцией тканей является значением настоящего протокола по отношению к уже существующим методам.

Одним из ограничений настоящего протокола является то, что формы PDMS собраны вручную из листов PDMS. Хотя строительство миллиметровых форм-единиц было бы осуществимо путем ручной сборки, формы из фотолитографии или литья из мастер-формы были бы более подходящими для расширенной и стабильной генерации ЭСТ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет финансовых или научных конфликтов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была финансово поддержана Kosair Благотворительные педиатрические исследования сердца программы в Университете Луисвилла и органоидный проект в RIKEN Центр биосистемных исследований динамики. HiPSCs, используемые в наших опубликованных протоколах, были предоставлены Центром исследований и применения клеток iPS, Киотский университет, Киото, Япония.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style Falcon/ Thomas scientific 9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS Falcon / Thomas scientific 6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761036
Reagents
Accumax Innovative Cell Technologies AM-105
BMP4, recombinant (10µg) R&D RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma C3867
Growth factor-reduced Matrigel Corning 356231
Human VEGF (165) IS, premium grade Miltenyi 130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Molecular Probes P-6866
Recombinant human bFGF WAKO 060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) R&D 338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg) R&D 5036-WN
Versene solution Gibco 15040066
Culture medium and supplements
10x MEM Invitrogen 11430
2 Mercaptro Ethanol SIGMA M6250
B27 supplement minus insulin Gibco A1895601
DMEM, high glucose Gibco 11965084
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
L-Glutamine Gibco 25030081
NaHCO3 Any
PBS 1x Gibco 10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) Gibco 15070-063
RPMI1640 medium Gibco 21870092
αMEM Invitrogen 11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences BD / Fisher 560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision Fisher MS-295-P0
BD FACS Clean Solution BD 340345
BD FACSFlow Sheath Fluid BD 342003
BD FACSRinse Solution BD 340346
EDTA Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) Corning 352235
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Molecular Probes L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences BD / Fisher 558821
Saponin Sigma-Aldrich 47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences BD / Fisher 560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit Molecular Probes Z25002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).More

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter