伤口诱导的多倍体化是一种保守的组织修复策略,其中细胞在大小上生长,而不是分裂,以弥补细胞损失。下面是一个详细的协议,如何使用果蝇作为模型来测量皮骨及其遗传调控在上皮伤口修复。
多倍体是一种常见现象,对机体健康和疾病的影响仍然鲜为人知。如果细胞包含的染色体的二倍体拷贝多,则细胞被定义为多倍体,这是最终复制或细胞融合的结果。在组织修复中,伤口诱导的多倍体化(WIP)被发现是一种保存的愈合策略,从果蝇到脊椎动物。WIP比细胞增殖具有若干优点,包括抗致癌生长和基因毒性应激。挑战在于确定多倍体细胞产生的原因,以及这些独特的细胞如何发挥作用。提供一个详细的协议,研究WIP在成人果蝇上皮,其中多倍体细胞产生后2天内穿刺伤口。利用 D.黑色素加斯特广泛的 基因工具包,启动和调节WIP所需的基因,包括 Myc,已经开始被识别。使用这种方法的持续研究可以揭示其他遗传和生理变量,包括性别、饮食和年龄如何调节和影响WIP的功能。
果蝇黑色素是一个有吸引力的模型系统,研究上皮伤口修复的细胞和分子机制。与哺乳动物一样,使用的组织修复机制取决于组织及其发育阶段。无疤痕伤口愈合发生在果蝇胚胎中,在上皮前缘形成一个果蝇胚胎,使伤口无缝关闭1,1,2。幼虫、幼虫和成年果蝇的胚胎后伤口愈合导致细胞外基质重塑、黑色素疤痕形成和上皮细胞生长,3、4、5、6。45,63上皮细胞通过细胞融合和内环增加大小,这是一个不完全的细胞周期,,绕过了3、4、7、847的线粒体。因此,细胞损耗通过多倍体细胞生长而不是细胞分裂来补偿。成年苍蝇后肢、中毛细胞和卵泡上皮也依靠多倍体细胞生长来补偿组织损伤后细胞损失,9、10、11。,11
多倍体是植物和昆虫有机体发育的一个众所周知的方面,但近年来,多倍体是脊椎动物12的一种保守组织修复策略,这一点越来越明显。斑马鱼,它有能力再生其心脏,依靠多倍体细胞生长来治愈受损的史诗13。多倍体也有助于哺乳动物肝脏再生和肾管上皮修复后急性损伤14,15。14,在这些示例中,多倍体细胞通过内环或内氧体进行内向生成,由于细胞因子12中的块而导致双细胞化。谜是为什么多倍体细胞在伤口修复过程中出现,以及多倍体如何影响组织功能。最近的研究为多倍体是提供治疗优势还是劣势的问题提供了新的见解。在斑马鱼史诗中,多倍体提高了伤口愈合的速度13。在D.黑色素和哺乳动物肝脏中,多倍体被发现对致癌生长有保护作用11,14。11,14在成人苍蝇上皮,最近发现,多倍体使伤口修复在基因毒性应力16的存在。内光对DNA损伤具有抗药性,当细胞增殖时,伤口愈合,否则就会受到损害。然而,对于小鼠和斑马鱼心脏中的心肌细胞,多倍体会减缓愈合,从而增强疤痕形成18,19。18,因此,根据器官和/或细胞类型,多倍体可以是一个有益或有害的组织修复策略。D. 黑色素糖酯遗传学的可及性,加上伤口诱导多倍体化 (WIP) 反应的分析,使其成为阐明指导伤口愈合策略的分子和细胞机制的理想模型系统。
在这里,我们提出了一个协议,用于分析在成人 D.黑色素体上皮的 WIP。其中包括果蝇损伤、解剖、免疫污点、安装、成像以及再上皮化、细胞融合和内皮(倍数)分析的说明。成像和倍体分析也可以适应其他模型,以测试是否发生 WIP。应当指出,随着核DNA含量的增加,核尺寸往往相应增加。然而,在生物学中有许多例子,核尺寸没有反映20倍体的相应变化。在解释细胞经常扩散或伸展以覆盖伤口场址的伤口环境中解释核尺寸时,应更加谨慎。因此,胶质变化的唯一明确证据是用这种方法(或其他方法,如全基因组测序)测量DNA含量21。该方法提高了成人 D.黑色素腹 上皮作为研究多倍体在伤口修复中的作用和调节的模型的适用性。
提出了一个详细的协议,如何解剖和使用成人D.黑色素腹上皮研究基因如何调节WIP通过改变重新上皮和伤口修复期间,末日化16。使用这种方法,原生基因 Myc 最近被确定为 WIP 的关键调节器。Myc是上皮细胞的致癌后,足以使静态上皮细胞内循环在成人苍蝇上皮和附属腺体16,22。,22研究还发现,通过stg、fzrRNAi的表达将上皮细胞切换到线粒细胞周期对伤口修复有害。使用这种方法的持续研究将确定在WIP期间调节再上皮化和末位化所需的其他基因,揭示多倍体调控和在各种组织中功能的相似性和差异。
该模型和方法具有独特的优势,包括多倍体与机械穿刺的容易诱导和多倍体细胞在几天内产生的事实。组织解剖和准备方案是基于幼虫解剖技术23,但成人苍蝇腹部更僵硬,因此容易扰动。因此,该协议需要实践和精度来分离一个完整的组织来研究WIP。然而,一旦解剖,上皮清晰可见,易于成像,产生伤口愈合过程的快照。这种方法提供了大量有关成年苍蝇上皮组织、细胞和同步大小以及细胞和单个核的倍体的信息。虽然活成像在完整的果蝇中还不可能由于其不透明的角质层,但该协议可以进行调整,以包括目前可用的外活体培养条件,用于D.melanogaster进行短期活体成像研究24。
将来,该模型将非常适合研究细胞对细胞串扰和其他细胞类型对WIP的贡献,通过调节基因表达与Gal4/UAS系统在其他细胞类型的兴趣。类似的问题也可以回答使用各种遗传和突变背景。解剖的成人苍蝇腹部包含各种细胞类型,可以使用这种方法很容易可视化,包括脂肪身体和月青细胞,侧肌纤维,感觉神经元,气管,和巨噬细胞状血细胞。此外,该模型将允许研究人员研究生理变量如何影响WIP,包括性别、饮食、感染、年龄和环境压力因素。虽然协议使用成年雌蝇由于其更大的大小,擦拭也发生在雄性果蝇(Gjelsvik和洛西克,未出版)。多倍体细胞在哺乳动物肝脏、大脑、眼睛和心脏的衰老和年龄相关疾病中被发现出现。果蝇模型将使研究人员能够研究生理和疾病背景下的多倍体化,因为人类疾病相关基因具有高度的保存性。
The authors have nothing to disclose.
在波士顿学院,我们要感谢埃里克·福尔克博士使用实验室的相机和立体镜显微镜设置成像和布雷特·贾德森在波士顿学院成像核心的基础设施和支持。我们还要感谢苍蝇社区资源:布卢明顿果蝇种群中心(NIH P40OD018537)、维也纳果蝇资源中心和哈佛医学院的TRIP中心(NIH/NIGMS R01-GM084947)提供了本研究中使用的转基因种群。小鼠FasIII抗体来自由NIHNICHD支持的发展研究杂交瘤库,并维持在爱荷华大学生物系,爱荷华市,IA。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持,编号为R35GM124691。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | For creating plates to dissect in |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparing staining reagents in |
AxioImager M2 with Apotome | Zeiss | NA | For imaging samples |
Blowgun mini | Genesee Scientific | 54-104M | For anethesizing D. melanogaster strains |
Bovine Serum Albumin, 30% | Sigma | A7284-500ML | For immuostaining |
Carbon dioxide tank | various distributors | N/A | For anethesizing D. melanogaster strains |
Click-iT EdU 594 Kit | Thermofisher | C10339 | For EdU assay |
Coverslips | Thermofisher | 3406 | For mounting |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | For immuostaining |
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) | Ellsworth Adhesives | 184SIL | For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A21206 | For secondary immuostaining |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A10042 | For secondary immuostaining |
Drosophila tubing and fittings | Genesee Scientific | 59-124C, 59-123, 59-140 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | For dissecting |
epi-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793, b27392 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
Excel | Microsoft | For performing ploidy calculations | |
Fiji/ImageJ (image analysis software) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij | For image analysis |
Fly food | Archon Scientific | N/A | Corn Syrup/Soy food |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Glass dissecting dish | Fisher Scientific | 13-748B | For performing dissections in |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-518-104C | For mounting |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A11001 | For secondary immuostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A11031 | For secondary immuostaining |
Grace's Insect Medium, unsupplemented | Thermofisher | 11595030 | For dissecting in |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | For wounding and pinning fly abdomens flat |
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | For immunostaining epithelial cell-cell junctions |
Mouting media | Vector Laboratories | H-1000 | Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging |
Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing slides |
Ortibal shaker | Fisher Scientific | 02-217-988 | For immuostaining |
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | For staining |
Pin holders | Fine Science Tools | 91606-07 | For wounding |
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody | N/A | N/A | For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8) |
Rabbit anti-RFP Primary Antibody | MBL | PM005 | For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium |
Stereomicroscope | Olympus | SZ51 | For dissecting and mounting fly tissue |
Triton X-100 | Sigma | 10789704001 | For immuostaining |
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v108837, b6292 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v25550, b56562 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-Myc | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b9674 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-myc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b36123 | Grendler et al. Development, 2019 |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | For dissecting |