Sårindusert polyploidisering er en konservert vevreparasjonsstrategi der cellene vokser i størrelse i stedet for å dele for å kompensere for celletap. Her er en detaljert protokoll om hvordan du bruker fruktfluen som modell for å måle ploidy og dens genetiske regulering i epitelsårreparasjon.
Polyploidy er et hyppig fenomen hvis innvirkning på organismehelse og sykdom fortsatt er dårlig forstått. En celle er definert som polyploid hvis den inneholder mer enn diploid kopi av kromosomene, som er et resultat av endoreplication eller cellefusjon. I vevreparasjon har sårindusert polyploidisering (WIP) vist seg å være en bevart helbredende strategi fra fruktfluer til virveldyr. WIP har flere fordeler fremfor cellespredning, inkludert resistens mot onkogen vekst og gentoksisk stress. Utfordringen har vært å identifisere hvorfor polyploidceller oppstår og hvordan disse unike cellene fungerer. Gitt er en detaljert protokoll for å studere VIA i voksen frukt fly epitel hvor polyploid celler genereres innen 2 dager etter en punktering sår. Ved å dra nytte av D. melanogasters omfattende genetiske verktøysett, har genene som kreves for å initiere og regulere VIA, inkludert Myc, begynt å bli identifisert. Fortsatt studier ved hjelp av denne metoden kan avsløre hvordan andre genetiske og fysiologiske variabler, inkludert kjønn, kosthold og alder regulerer og påvirker WIP funksjon.
Drosophila melanogaster er et attraktivt modellsystem for å studere cellulære og molekylære mekanismer for epitelsårreparasjon. Som hos pattedyr er vevsreparasjonsmekanismene som brukes, avhengig av både vevet og utviklingsstadiet. Scarless sårheling oppstår i fruktfluembryoet hvor en actomyosin “veskestreng” dannes ved epitelens forkant slik at såret sømløst kanlukke 1,2. Post-embryonal sårheling i larver, pupper og voksen fruktfluer resulterer i ekstracellulær matriseombygging, melanin arrdannelse og epitelcellevekst3,,4,,5,,6. Epitelcellene øker i størrelse ved cellefusjon og endocycle, en ufullstendig cellesyklus som omgår mitose3,,4,,7,,8. Som et resultat kompenseres celletap av polyploid cellevekst i stedet for celledeling. Den voksne fly hindgut, midgut, og follikulær epitel også stole på polyploid cellevekst for å kompensere for celletap etter vevsskade9,10,11.
Polyploidy er et velkjent aspekt ved organismeutvikling i planter og insekter, men i de siste årene har det blitt tydeligere at polyploidy er en konservert vevreparasjonsstrategi i virveldyr12. Sebrafisken, som har kapasitet til å regenerere sitt hjerte, er avhengig av polyploid cellevekst for å helbrede skadet epicardium13. Polyploidy bidrar også til pattedyr leverregenerering og nyre tubule epitel reparasjon etter akutt skade14,15. I disse eksemplene genereres polyploidceller ved endoreplisering via enten endocycle eller endomitosis, noe som resulterer i en binucleated celle på grunn av en blokk i cytokinese12. Gåten er grunnen til at polyploidceller oppstår under sårreparasjon og hvordan polyploidy påvirker vevsfunksjonen. Nyere studier har gitt ny innsikt i spørsmålet om polyploidy gir en helbredende fordel eller ulempe. I sebrafisk epicardium, polyploidy forbedret hastigheten på sårheling13. I D. melanogaster hindgut og pattedyr leveren, polyploidy ble funnet å være beskyttende mot onkogen vekst11,14. I voksen fly epitel ble det nylig funnet at polyploidy muliggjør sårreparasjon i nærvær av gentoksisk stress16. Endoreplication er motstandsdyktig mot DNA-skade, slik at sårheling når cellespredning ellers ville bli kompromittert17. For kardiomyocytter i mus og sebrafisk hjerter, men polyploidy bremser healing, noe som resulterer i forbedretarrdannelse 18,19. Derfor, avhengig av organ og / eller celletype, polyploidy kan være en gunstig eller skadelig vev reparasjon strategi. Tilgjengeligheten av D. melanogaster genetikk kombinert med analyse av sårindusert polyploidization (WIP) respons gjør det til et ideelt modellsystem for å belyse molekylære og cellulære mekanismer som styrer denne sårhelingsstrategien.
Her presenterer vi en protokoll for analyse av VIA i det voksne D. melanogaster epitelet. Inkludert er instruksjoner for fruktflueskade, disseksjon, immunstaining, montering, avbildning og analyse av re-epitelisering, cellefusjon og endoreplisering (ploidy). Bilde- og knepanalysen kan også tilpasses andre modeller for å teste om VIA oppstår. Det bør bemerkes at med en økning i kjernefysisk DNA-innhold er det ofte en tilsvarende økning i kjernefysisk størrelse. Det er imidlertid mange eksempler i biologi hvor kjernefysisk størrelse ikke gjenspeiler en tilsvarende endring i ploidy20. Enda mer forsiktighet bør utvises ved tolkning av kjernefysisk størrelse i sammenheng med et sårmiljø der celler ofte vil spre seg eller strekke seg for å dekke sårstedet. Derfor er det eneste definitive endringsbeviset i ploidy å måle DNA-innhold ved denne metoden (eller andre, for eksempel hele genomsekvensering)21. Denne metoden øker egnetheten til den voksne D. melanogaster abdominal epitel som en modell for å studere rollen og reguleringen av polyploidy i sårreparasjon.
Presentert er en detaljert protokoll om hvordan å dissekere og bruke den voksne D. melanogaster abdominal epitel for å studere hvordan gener regulerer VIA ved å endre re-epitelisering og endoreplication under sårreparasjon16. Ved hjelp av denne metoden ble proto-onkogene Myc nylig identifisert som en nøkkelregulator for VIA. Myc er nødvendig for epitelceller for å endoreplicate post skade og er tilstrekkelig for quiescent epitelceller å endocycle både i voksen fly epitel og tilbehør kjertler16,,22. Det ble også funnet at å bytte epitelceller til en mitotisk cellesyklus ved uttrykk for stg, fzrRNAi er skadelig for sårreparasjon. Fortsatt studier ved hjelp av denne metoden vil identifisere andre gener som kreves for å regulere re-epitelisering og endoreplication under VIA, avslører både likheter og forskjeller til hvordan polyploidy er regulert og fungerer i en rekke vev.
Denne modellen og metoden gir unike fordeler, inkludert enkel induksjon av polyploidy med mekanisk punktering og det faktum at polyploidceller genereres innen dager4. Vevsdisseksjons- og forberedelsesprotokollene er basert på larvedisseksjonsteknikker 23, men den voksne flymagen er stivere og derfor lett perturbed. Som et resultat krever denne protokollen praksis og presisjon for å isolere et intakt vev for å studere VIA. Når dissekert, er epitelet tydelig synlig og lett avbildet, noe som gir et øyeblikksbilde av sårhelingsprosessen. Denne metoden gir et vell av informasjon om den voksne fluens epitelorganisasjon, celle og syncytiumstørrelse, og knepet av celler og individuelle kjerner. Mens levende bildebehandling ennå ikke er mulig innenfor intakt fruktflue på grunn av sin ugjennomsiktige skjellaget, kan denne protokollen tilpasses til å inkludere tilgjengelige ex vivo kulturforhold som brukes i D. melanogaster for å utføre kortsiktige live imaging studier24.
I fremtiden vil denne modellen være ideell for å studere celle-til-celle crosstalk og bidrag fra andre celletyper til VIA ved å regulere genuttrykk med Gal4 / UAS-systemet i andre celletyper av interesse. Lignende spørsmål kan også besvares ved hjelp av en rekke genetiske og muterte bakgrunner. Den dissekerte voksne fly abdomen inneholder en rekke celletyper som lett kan visualiseres ved hjelp av denne metoden, inkludert fett kropp og oenocytter, laterale muskelfibre, sensoriske nevroner, luftrør, og makrofag-lignende hemocytter. I tillegg vil denne modellen tillate forskere å undersøke hvordan fysiologiske variabler påvirker VIA, inkludert sex, kosthold, infeksjon, alder og miljømessige stressfaktorer. Mens protokollen bruker den voksne kvinnelige fluen på grunn av sin større størrelse, skjer WIP også i den mannlige fruktfluen (Gjelsvik og Losick, upublisert). Polyploidceller har vist seg å oppstå under aldring og aldersrelatert sykdom i pattedyrleveren, hjernen, øyet og hjertet12. Fruktfluemodellen vil gjøre det mulig for forskere å studere polyploidisering i fysiologiske og sykdomssammenhenger fordi menneskelige sykdomsrelaterte gener er svært bevart.
The authors have nothing to disclose.
På Boston College vil vi takke Dr. Eric Folker for bruk av laboratoriets kamera og stereoskopetopoppsett for bildebehandling og Bret Judson ved Boston College Imaging Core for infrastruktur og støtte. Vi vil også takke flysamfunnets ressurser: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center og TRiP Center ved Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) for å gi transgene aksjer som brukes i denne studien. Musen FasIII antistoff ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank støttet av NICHD av NIH og vedlikeholdt ved The University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under Award Number R35GM124691. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | For creating plates to dissect in |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparing staining reagents in |
AxioImager M2 with Apotome | Zeiss | NA | For imaging samples |
Blowgun mini | Genesee Scientific | 54-104M | For anethesizing D. melanogaster strains |
Bovine Serum Albumin, 30% | Sigma | A7284-500ML | For immuostaining |
Carbon dioxide tank | various distributors | N/A | For anethesizing D. melanogaster strains |
Click-iT EdU 594 Kit | Thermofisher | C10339 | For EdU assay |
Coverslips | Thermofisher | 3406 | For mounting |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | For immuostaining |
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) | Ellsworth Adhesives | 184SIL | For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A21206 | For secondary immuostaining |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A10042 | For secondary immuostaining |
Drosophila tubing and fittings | Genesee Scientific | 59-124C, 59-123, 59-140 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | For dissecting |
epi-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793, b27392 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
Excel | Microsoft | For performing ploidy calculations | |
Fiji/ImageJ (image analysis software) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij | For image analysis |
Fly food | Archon Scientific | N/A | Corn Syrup/Soy food |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Glass dissecting dish | Fisher Scientific | 13-748B | For performing dissections in |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-518-104C | For mounting |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A11001 | For secondary immuostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A11031 | For secondary immuostaining |
Grace's Insect Medium, unsupplemented | Thermofisher | 11595030 | For dissecting in |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | For wounding and pinning fly abdomens flat |
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | For immunostaining epithelial cell-cell junctions |
Mouting media | Vector Laboratories | H-1000 | Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging |
Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing slides |
Ortibal shaker | Fisher Scientific | 02-217-988 | For immuostaining |
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | For staining |
Pin holders | Fine Science Tools | 91606-07 | For wounding |
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody | N/A | N/A | For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8) |
Rabbit anti-RFP Primary Antibody | MBL | PM005 | For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium |
Stereomicroscope | Olympus | SZ51 | For dissecting and mounting fly tissue |
Triton X-100 | Sigma | 10789704001 | For immuostaining |
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v108837, b6292 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v25550, b56562 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-Myc | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b9674 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-myc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b36123 | Grendler et al. Development, 2019 |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | For dissecting |