Sårinducerad polyploidisering är en bevarad vävnadsreparationsstrategi där cellerna växer i storlek istället för att dela sig för att kompensera för cellförlust. Här är ett detaljerat protokoll om hur man använder fruktflugan som modell för att mäta ploidy och dess genetiska reglering i epitelial sår reparation.
Polyploidy är ett vanligt fenomen vars inverkan på organismen hälsa och sjukdom är fortfarande dåligt förstådd. En cell definieras som polyploid om den innehåller mer än den diploida kopian av dess kromosomer, vilket är ett resultat av endoreplication eller cellfusion. I vävnad reparation, sår-inducerad polyploidization (WIP) har visat sig vara en bevarad helande strategi från bananflugor till ryggradsdjur. PIA har flera fördelar jämfört med cellproliferation, inklusive resistens mot onkogen tillväxt och genotoxisk stress. Utmaningen har varit att identifiera varför polyploida celler uppstår och hur dessa unika celler fungerar. Förutsatt är ett detaljerat protokoll för att studera WIP i den vuxna fruktflugan epitel där polyploid celler genereras inom 2 dagar efter en punktering sår. Med fördel av D. melanogasters omfattande genetiska verktygssats har de gener som krävs för att initiera och reglera PIA, inklusive Myc, börjat identifieras. Fortsatta studier med denna metod kan avslöja hur andra genetiska och fysiologiska variabler inklusive kön, kost, och ålder reglera och påverka WIP funktion.
Drosophila melanogaster är ett attraktivt modellsystem för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna för epitel sår reparation. Liksom hos däggdjur beror de vävnadsreparationer mekanismer som används på både vävnaden och dess utvecklingsstadium. Scarless sårläkning sker i fruktflugembryot där en actomyosin “handväska sträng” former vid epitelial framkant gör det möjligt för såret att sömlöststänga 1,2. Post-embryonal sårläkning i larver, puppor, och vuxna bananflugor resulterar i extracellulär matris remodeling, melanin ärr bildning, och epitelial cell tillväxt3,4,5,6. Epitelcellerna ökar i storlek genom cellfusion och endocykeln, en ofullständig cellcykel som kringgår mitos3,4,7,8. Som resultat kompenseras cellförlusten genom polyploid celltillväxt istället för celldelning. Den vuxna flug hindgut, midgut, och follikulära epitel också förlita sig på polyploida celltillväxt för att kompensera för cellförlustefter vävnadsskada 9,10,11.
Polyploidy är en välkänd aspekt av organismutveckling i växter och insekter, men under de senaste åren har det blivit mer uppenbart att polyploidy är en bevarad vävnad reparation strategi i ryggradsdjur12. Den zebrafisk, som har kapacitet att regenerera sitt hjärta, förlitar sig på polyploid celltillväxt för att läka skadade epicardium13. Polyploidy bidrar också till däggdjur leverregenerering och njurubuli epitel reparation efter akut skada14,15. I dessa exempel genereras polyploida celler genom endoreplication via antingen endocycle eller endomitosis, vilket resulterar i en binucleerad cell på grund av ett block i cytokines12. Gåtan är anledningen till att polyploida celler uppstår vid sårreparation och hur polyploidy påverkar vävnadsfunktionen. Nyligen genomförda studier har gett ny insikt i frågan om polyploidy erbjuder en helande fördel eller nackdel. I zebrafisk epicardium, polyploidy ökat hastigheten på sårläkning13. I D. melanogaster hindgut och däggdjur lever, polyploidy befanns vara skyddande mot onkogen tillväxt11,14. I vuxen fluge epitel, det konstaterades nyligen att polyploidy möjliggör sår reparation i närvaro av genotoxiska stress16. Endoreplication är resistent mot DNA-skador, vilket gör att sårläkning när cellproliferation annars skulle äventyras17. För kardiomyocyter i mus och zebrafisk hjärtan, dock polyploidy saktar läkning, vilket resulterar i förbättrad ärrbildning18,19. Därför, beroende på organ och / eller celltyp, kan polyploidy vara en fördelaktig eller skadlig vävnad reparation strategi. Tillgängligheten av D. melanogaster genetik i kombination med analys av sår-inducerad polyploidization (WIP) svar gör det till en idealisk modell system för att belysa de molekylära och cellulära mekanismer som styr denna sårläkning strategi.
Här presenterar vi ett protokoll för att analysera WIP i den vuxna D. melanogaster epitel. Inkluderat är instruktioner för fruktfluga skada, dissektion, immunfärgning, montering, avbildning, och analys av re-epithelialization, cell fusion, och endoreplication (ploidy). Bild- och ploidanalysen kan även anpassas till andra modeller för att testa om PIA förekommer. Det bör noteras att med en ökning av kärn-DNA-innehåll finns det ofta en motsvarande ökning av kärnstorlek. Det finns dock många exempel inom biologi där kärnstorleken inte återspeglar en motsvarande förändring i ploidy20. Ännu mer försiktighet bör iakttas vid tolkning av kärnstorlek i samband med en sårmiljö där celler ofta kommer att spridas eller sträcka sig för att täcka sårplatsen. Därför är det enda definitiva beviset på förändring i ploidy att mäta DNA-innehåll med denna metod (eller andra, såsom hela genomsekvensering)21. Denna metod ökar lämpligheten hos den vuxna D. melanogaster buken epitel som en modell för att studera roll och reglering av polyploidy i sår reparation.
Presenteras är ett detaljerat protokoll om hur man dissekerar och använder den vuxna D. melanogaster bukepitel för att studera hur gener reglerar WIP genom att ändra re-epithelialization och endoreplication under sårreparation16. Med den här metoden identifierades nyligen proto-onkogene Myc som en nyckelregulator för PIA. Myc krävs för epitelceller till endoreplicate post skada och är tillräcklig för quiescent epitelceller att endocycle både i vuxen fluge epitel och tillbehörkörtlar 16,22. Det konstaterades också att byta epitelceller till en mitotiska cellcykel genom uttryck av stg, fzrRNAi är skadligt för sår reparation. Fortsatta studier med denna metod kommer att identifiera andra gener som krävs för att reglera re-epithelialization och endoreplication under PIA, avslöjar både likheter och skillnader till hur polyploidy regleras och fungerar i en mängd olika vävnader.
Denna modell och metod erbjuder unika fördelar, inklusive den enkla induktionen av polyploidy med en mekanisk punktering och det faktum att polyploida celler genereras inom dagar4. Vävnadsdisektionen och beredningsprotokollen baseras på larv dissektionsteknik23, men vuxenflugan buken är styvare och därför lätt störd. Som ett resultat kräver detta protokoll praxis och precision för att isolera en intakt vävnad för att studera PIA. När dissekeras, men epitelet är tydligt synlig och lätt avbildad, vilket ger en ögonblicksbild av sårläkningsprocessen. Denna metod ger en mängd information om den vuxna flugans epitelorganisation, cell- och synkytiumstorlek, och cellernas och enskilda kärnors ploidy. Medan live imaging ännu inte är möjligt inom intakt fruktfluga på grund av dess ogenomskinliga nagelband, detta protokoll skulle kunna anpassas till att omfatta för närvarande tillgängliga ex vivo kultur villkor som används i D. melanogaster att utföra kortsiktiga live imaging studier24.
I framtiden kommer denna modell att vara idealisk för att studera cell-till-cell överhörning och bidraget från andra celltyper till PIA genom att reglera genuttryck med Gal4/UAS-systemet i andra celltyper av intresse. Liknande frågor kan också besvaras med hjälp av en mängd olika genetiska och mutanta bakgrunder. Den dissekerade vuxna flyga buken innehåller en mängd olika celltyper som lätt kan visualiseras med hjälp av denna metod, inklusive fett kropp och oenocytes, laterala muskelfibrer, sensoriska nervceller, luftstrupe, och makrofag-liknande hemocyter. Dessutom, denna modell kommer att tillåta forskare att undersöka hur fysiologiska variabler påverkar PIA, inklusive kön, kost, infektion, ålder, och miljö stressfaktorer. Medan protokollet använder den vuxna honflugan på grund av sin större storlek förekommer WIP även i den manliga fruktflugan (Gjelsvik och Losick, opublicerade). Polyploida celler har visat sig uppstå under åldrande och åldersrelaterade sjukdom i däggdjur lever, hjärna, öga, och hjärta12. Fruktflugan modellen kommer att göra det möjligt för forskare att studera polyploidisering i fysiologiska och sjukdomssammanhang eftersom mänskliga sjukdomsrelaterade gener är mycket bevarade.
The authors have nothing to disclose.
På Boston College, vill vi tacka Dr Eric Folker för användning av hans lab kamera och stereoscope mikroskop setup för imaging och Bret Judson vid Boston College Imaging Core för infrastruktur och stöd. Vi vill också tacka fluggemenskapens resurser: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center och TRiP Center vid Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) för att tillhandahålla transgena lager som används i denna studie. Musen FasIII antikropp erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank stöds av NICHD av NIH och underhålls vid University of Iowa, Institutionen för biologi, Iowa City, IA. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under Award Number R35GM124691. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | For creating plates to dissect in |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparing staining reagents in |
AxioImager M2 with Apotome | Zeiss | NA | For imaging samples |
Blowgun mini | Genesee Scientific | 54-104M | For anethesizing D. melanogaster strains |
Bovine Serum Albumin, 30% | Sigma | A7284-500ML | For immuostaining |
Carbon dioxide tank | various distributors | N/A | For anethesizing D. melanogaster strains |
Click-iT EdU 594 Kit | Thermofisher | C10339 | For EdU assay |
Coverslips | Thermofisher | 3406 | For mounting |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | For immuostaining |
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) | Ellsworth Adhesives | 184SIL | For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A21206 | For secondary immuostaining |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A10042 | For secondary immuostaining |
Drosophila tubing and fittings | Genesee Scientific | 59-124C, 59-123, 59-140 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | For dissecting |
epi-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793, b27392 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
Excel | Microsoft | For performing ploidy calculations | |
Fiji/ImageJ (image analysis software) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij | For image analysis |
Fly food | Archon Scientific | N/A | Corn Syrup/Soy food |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Glass dissecting dish | Fisher Scientific | 13-748B | For performing dissections in |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-518-104C | For mounting |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A11001 | For secondary immuostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A11031 | For secondary immuostaining |
Grace's Insect Medium, unsupplemented | Thermofisher | 11595030 | For dissecting in |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | For wounding and pinning fly abdomens flat |
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | For immunostaining epithelial cell-cell junctions |
Mouting media | Vector Laboratories | H-1000 | Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging |
Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing slides |
Ortibal shaker | Fisher Scientific | 02-217-988 | For immuostaining |
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | For staining |
Pin holders | Fine Science Tools | 91606-07 | For wounding |
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody | N/A | N/A | For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8) |
Rabbit anti-RFP Primary Antibody | MBL | PM005 | For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium |
Stereomicroscope | Olympus | SZ51 | For dissecting and mounting fly tissue |
Triton X-100 | Sigma | 10789704001 | For immuostaining |
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v108837, b6292 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v25550, b56562 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-Myc | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b9674 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-myc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b36123 | Grendler et al. Development, 2019 |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | For dissecting |