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Biochemistry

चूहा अग्नाशय के ऊतकों की तेजी से और लागत प्रभावी आरएनए निष्कर्षण

Published: September 19, 2020 doi: 10.3791/61255
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,5
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, 2Endocrinology and Metabolism Research Center, Nemazee Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, 3English Language Department, Faculty of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, 4Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School and Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences, 5Autophagy Research Center, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences

Summary

अलग आरएनए की शुद्धता और अखंडता आरएनए निर्भर परख में एक महत्वपूर्ण कदम है । यहां, हम अक्षतिग्रस्त अग्नाशय के ऊतकों की एक छोटी मात्रा से आरएनए निकालने के लिए एक व्यावहारिक, तेजी से और सस्ती विधि पेश करते हैं।

Abstract

निष्कर्षण विधि के बावजूद, ऊतकों और सेल लाइनों का अनुकूलित आरएनए निष्कर्षण चार चरणों में किया जाता है: 1) समरूपता, 2) आरएनए से प्रोटीन का प्रभावी विकृति, 3) राइबोन्यूलाइज निष्क्रियता, और 4) डीएनए, प्रोटीन और कार्बोहाइड्रेट से संदूषण को हटाना। हालांकि, जब ऊतक में आरएनएएस के उच्च स्तर होते हैं तो आरएनए की अखंडता को बनाए रखना बहुत श्रमसाध्य होता है। सहज ऑटोलिसिस इसे नुकसान पहुंचाए बिना अग्नाशय के ऊतकों से आरएनए निकालने के लिए बहुत मुश्किल बना देता है। इस प्रकार, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान अग्नाशय के ऊतकों की अखंडता को बनाए रखने के लिए एक व्यावहारिक आरएनए निष्कर्षण विधि की आवश्यकता होती है। मौजूदा प्रोटोकॉल का एक प्रयोगात्मक और तुलनात्मक अध्ययन 2 मिनट से भी कम समय में चूहा अग्नाशय के ऊतकों के 20-30 मिलीग्राम प्राप्त करने और आरएनए निकालने के द्वारा किया गया था । परिणामों का आकलन इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया गया । परिणामों के सामान्यीकरण के लिए तीन बार प्रयोग किए गए । आरएनए स्थिरीकरण रिएजेंट में अग्नाशय के ऊतकों को विसर्जित करना -80 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए उच्च अखंडता आरएनए, जब आरएनए निष्कर्षण अभिवाक्त्रक को रिएजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्राप्त परिणाम स्पिन कॉलम बाइंडिंग के साथ वाणिज्यिक किट से प्राप्त परिणामों के बराबर थे।

Introduction

संरचनात्मक जीन डेटा जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से एक कार्यात्मक उत्पाद के लिए लिखित किया जा सकता है । आरएनए विश्लेषण का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों को खोजने के लिए किया जाता है। न्यूक्लियिक एसिड निकालने के लिए कई तरीके हैं: ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट, फिनोल-क्लोरोफॉर्म, सेल्यूलोज आधारित क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से निष्कर्षण, सिलिका मैट्रिस द्वारा निष्कर्षण, और एनियन-एक्सचेंज1,,2।

जीन अभिव्यक्ति का उचित पता लगाना ऊतकों से अलग आरएनए की अखंडता से प्रभावित होता है; इसलिए, आगे के परीक्षणों से पहले ऊतकों से अलग आरएनए की अखंडता का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है क्योंकि कम गुणवत्ता वाले आरएनए पर पूरक आणविक परीक्षण नैदानिक आवेदन परिणामों को ख़तरे में डालना हो सकता है। इस प्रकार, विभिन्न नैदानिक अनुप्रयोगों के साथ आणविक जैविक परीक्षणों के लिए उच्च अखंडता आरएनए की आवश्यकता होती है: मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, माइक्रो-सरणी, राइबोन्यूलेज प्रोटेक्शन परख, उत्तरी दाग विश्लेषण, आरएनए मैपिंग, और सीडीएनए लाइब्रेरी निर्माण3,,4।

आरएनए एक लंबे समय के लिए रखा जा रहा है के बाद बल्कि अस्थिर हो जाता है । 10 केबी से अधिक लंबे एमआरएनए के टुकड़े विशेष रूप से5,6के क्षरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस प्रकार, शोधकर्ताओं को विभिन्न कारकों पर विचार करना चाहिए जो शुद्ध आरएनए की अखंडता को प्रभावित करते हैं। आरएनए की शुद्धता को आरएनएस, प्रोटीन, जीनोमिक डीएनए और एंजाइमेटिक अवरोधक संदूषण के खिलाफ संरक्षित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यूवी (260/280) के लिए आरएनए का सबसे अच्छा और स्वीकार्य अवशोषण अनुपात इलेक्ट्रोफोरेसिस पर न्यूनतम विखंडन के साथ 1.8-2.0 की सीमा के भीतर होना चाहिए । हाल ही में विकसित प्रयोगशाला तकनीकों ने वैज्ञानिकों को आणविक विश्लेषण नमूने की अखंडता का मूल्यांकन करने में सक्षम बनाया है , जो व्यावहारिक रूप से7,8

राइबोन्यूक्लिस (आरएनएस) की उच्च मात्रा के कारण अन्य प्रकार के ऊतकों की तुलना में अग्नाशय के ऊतकों से अक्षतिग्रस्त आरएनए निकालना बहुत अधिक कठिन है। हालांकि, मौजूदा निष्कर्षण विधियों, अर्थात् पेट की गुहा से अग्नाशय के ऊतकों का तेजी से इंजेक्शन और कम तापमान पर समरूपता आरनासेस को बाधित करने के लिए, अप्रभावी,,7,8,9,10, 11,,,,,12,1113, 14साबित हुए हैं।,14

वर्तमान तुलनात्मक प्रयोगात्मक अध्ययन का उद्देश्य सबसे कुशल तरीकों को निर्धारित करने के लिए मौजूदा तरीकों को संशोधित करना और तुलना करना है। इस उद्देश्य के लिए, आरएनए निष्कर्षण के विभिन्न प्रोटोकॉलों को संशोधित किया गया था और इसकी तुलना की गई थी। यह विशेष रूप से अग्नाशय के ऊतकों की एक ंयूनतम राशि की आवश्यकता होती है कम से कम महंगी विधि का निर्धारण करने के उद्देश्य से किया गया था।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन शिराज आयुर्विज्ञान विश्वविद्यालय (अनुमोदन संख्या: 93-01-01-7178\03-07-2014) से प्राप्त किया गया था ।

नोट: 250 ग्राम वजनी नर स्प्राग-डावले चूहों का उपयोग करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एक तरल नाइट्रोजन टैंक में रिएजेंट स्थिर आरएनए में डूबे अग्नाशय के ऊतकों के एक ज़ुल्फ़ युक्त शीशी रखें और आरएनए की अखंडता को बनाए रखने के लिए आरएनए निष्कर्षण अभिवात समाधान का उपयोग करें।

1. चूहे अग्नाशय के ऊतकों को हटाना

  1. ऑपरेटिंग रूम तैयार करें और सभी आवश्यक सामग्रियों को हुड के नीचे रखें।
  2. सभी सर्जिकल उपकरणों (ड्रेसिंग संदंश, ब्राउन-एड्सन संदंश, आइरिस कैंची, और लिटिलर कैंची) को ओवन में कम से कम 4 घंटे के लिए 240 डिग्री सेल्सियस पर15निष्क्रिय करने के लिए स्टरलाइज करें। हुड के नीचे 70% शराब के साथ सर्जरी जगह की सतह को स्टरलाइज करें।
  3. इंसुलिन सिरिंज [80/8 मिलीग्राम/किलो] का उपयोग करके केटामाइन/जाइलाज़ीन को इंजेक्ट करें। प्रतिक्रिया की कमी के लिए चूहे के उंगलियों को चुटकी देकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें।
  4. उत्पादित ऊतकों में एंडोन्यूक्लिस की सक्रियता को रोकने के लिए उचित माइक्रोट्यूब (2 एमएल) में आरएनए स्थिरीकरण अभिवार्जक के 1 एमएल जोड़ें।
  5. तुरंत एक मध्य लाइन चीरा के लिए सर्जिकल बोर्ड (सर्जन से दूर सिर) पर चूहे रखें।
  6. 70% शराब के साथ पूरे पेट की सतह को स्टरलाइज करें और #40 ब्लेड के साथ हेयर क्लिपर का उपयोग करके चूहे के बालों को हटा दें।
  7. जघन क्षेत्र से पेट को ड्रेसिंग संदंश, ब्राउन-एसन संदंश, आइरिस कैंची और लिटिलर कैंची के साथ सामने के पैरों तक खोलने के लिए वी-आकार का चीरा बनाएं।
  8. अग्न्याशय को बेनकाब करने के लिए पेट के अंगों को बाईं ओर फ्लिप करें। अग्नाशय के ऊतकों को ध्यान से ढूंढें, जो पेट की गुहा में फैलता है। वसा ऊतक के साथ भ्रमित होने के बिना अग्न्याशय को खोजने के लिए तिल्ली के नीचे के क्षेत्र का पता लगाएं।
  9. 2 मिनट से भी कम समय में पेट की गुहा से 20-30 मिलीग्राम अग्न्याशय तुरंत निकालें। 2 एमएल माइक्रोट्यूब में हटाए गए ऊतकों को जल्दी से रखें और आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक के साथ अलग हुए ऊतकों को भेदने के लिए इसे बाँझ कटर से काटें।
  10. माइक्रोट्यूब को तुरंत फ्रीज करने के लिए नाइट्रोजन टैंक में रखें। माइक्रोट्यूब को 24 एच16के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें ।
  11. 24 घंटे के बाद, अग्नाशय के ऊतकों के छोटे टुकड़ों को एक बर्फ के कंटेनर में स्थानांतरित करें।
  12. सर्जरी के बाद चूहों की इच्छामृत्यु के लिए इंट्राकार्डीली पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) इंजेक्ट करें।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. 70% शराब के साथ हुड के नीचे सतह को स्टरलाइज करें।
  2. आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के 1 एमसीएल रखें, जिसमें बाँझ माइक्रोट्यूब में आरएनएएस को बाधित करने के लिए ग्वानिनियम थिओसाइनेट शामिल है।
  3. अलग अग्नाशय के ऊतकों को माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें। माइक्रोट्यूब को तुरंत फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रो टिप प्रोब सोनिकेटर के साथ ऊतक को 60 एस ऑन और 5 एस ऑफ के लिए 20 स्तर तक सेट करें।
  5. न्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों को पूरी तरह से अलग करने की अनुमति देने के लिए कुचल बर्फ का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्रत्येक समरूप नमूने को इनक्यूबेट करें।
  6. आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के प्रत्येक 1 एमएल के लिए क्लोरोफॉर्म के 0.2 एमएल के साथ नमूनों को समृद्ध करें। ट्यूब को मजबूती से कैप करें और इसे 15 एस के लिए जबरदस्ती हिलाएं।
  7. तीन चरणों में रिएजेंट को अलग करने के लिए कुचल बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  8. +2 से +8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर अपकेंद्रित्र चलाएं। एक नए माइक्रोट्यूब के लिए रंगहीन जलीय चरण स्थानांतरित करें।
  9. जलीय चरण में 100% आइसोप्रोपेनॉल का 0.5 एमएल जोड़ें। ट्यूब को बंद करें और फिर आरएनए को अच्छी तरह से मिलाने के लिए इसे कम से कम 3 बार उलटा करें।
  10. आरएनए वर्षा की अनुमति देने के लिए ठंडे बॉक्स (4 डिग्री सेल्सियस) पर 5-10 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  11. +2 से +8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर अपकेंद्रित्र चलाएं। सुपरनेट को त्याग दें।
  12. 75% इथेनॉल के 1 एमसीएल के साथ प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब को समृद्ध करें।
  13. कम से कम 3 बार ट्यूब को उलटा करके आरएनए गोली को धोएं।
  14. 5 मिनट के लिए +2 से +8 डिग्री सेल्सियस पर 7,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र चलाएं। हवा सुखाने से आरएनए गोली से अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए सुपरनेट को त्यागें।
  15. डायथिलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) में आरएनए गोली को फिर से निलंबित करें-RNase-मुक्त पानी का इलाज किया ।
  16. आरएनए गोली को भंग करने के लिए कई बार एक पिपेट टिप के माध्यम से समाधान पारित करें। फिर, समाधान को +65 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

3. डेनैचुरेशन इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ आरएनए अखंडता का मूल्यांकन

  1. जेल रनिंग बफर तैयार करें: डीईपीसी-इलाज एच 2 ओ में 50 एमएम एनएसी (डीईपीसी इलाज) और 0.5 एम ईडीटीए (पीएच8.0)।
  2. 5x फॉर्मलडिहाइड जेल-रनिंग बफर (एमओपीएस रनिंग बफर): 0.1 एम एम एमओपी (पीएच 7.0), 40 एमएम एनएएसी, 5 एमएम ईडीटीए (पीएच 8.0) तैयार करें।
    1. डीईपीसी के 800 एमएल में 20.6 ग्राम एमओपी घोलकर 50 एमएम सोडियम एसीटेट का इलाज किया। पीएच को 2 एन नाओएच के साथ 7.0 पर समायोजित करें। डीईपीसी-उपचारित 0.5 एम ईडीटीए (पीएच 8.0) के 10 एमएल जोड़ें। डीईपीसी-उपचारित पानी के साथ 1 एल के समाधान की मात्रा को समायोजित करें।
    2. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें और इसे नसबंदी के लिए कमरे के तापमान को प्रकाश से दूर रखें। बफर समय के साथ पीला हो जाता है अगर यह प्रकाश के संपर्क में है या autoclaved है । एक भूसे के रंग का बफर अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन गहरे रंग के लोग17नहीं करते हैं।
  3. 1.5% एगर उठे जेल18तैयार करें। 50 एमएल के लिए, 0.75 ग्राम एगर उठी और 31 एमएल ऑफ एच2ओ माइक्रोवेव माइक्रोवेव को माइक्रोवेव में 1 मिनट के लिए जोड़ें। फॉर्मलडिहाइड के 9 एमएल और 5x एमओपी के 10 एमएल रनिंग बफर जोड़ें।
  4. जेल के लिए नमूने तैयार करें। एक बाँझ माइक्रोफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित मिलाएं:
    एक्स माइक्रोन आरएनए (30 माइक्रोग्राम तक)
    5x जेल-लोडिंग बफर के 2 माइक्रोन
    फॉर्ममाइड के 10 माइक्रोन
    एमओपी के 4 माइक्रोन चल बफर
    0.1 मिलीग्राम/एमएल ईटीआर का 1 माइक्रोन
    3 फॉर्मलडिहाइड 5-एक्स μL के DEPC-H2O
  5. नमूनों को 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और उन्हें बर्फ पर ठंडा करें। 5 एस के लिए सेंट्रलाइज जब तक सभी तरल पदार्थ जमा नहीं हो जाते।
  6. 5 मिनट के लिए 5 V/सेमी पर जेल को प्री-रन करें।
  7. नमूनों को तुरंत जेल की गलियों में लोड करें और फिर जेल को 1x फॉर्मलडिहाइड जेल-रनिंग बफर में जलमग्न करें। 3-4 V/cm19पर चलाएं ।

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Representative Results

आरएनए स्टेबिलाइजेशन रिएजेंट के बिना एक नियमित और संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट में आरएनए की अखंडता का मूल्यांकन
एक नियमित शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल से आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट के साथ आरएनए की निकासी के बाद अस्वीकार्य बैंड मनाया गया। लेन 1 एक नियंत्रण के रूप में जिगर से आरएनए से पता चलता है । लेन 2 एक नियमित शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल से प्राप्त कुल आरएनए में 28S/18S rRNA बैंड की अवक्रमित स्थिति से पता चलता है । जब अग्नाशय के ऊतकों की मात्रा 50 मिलीग्राम (लेन 3) या 20-30 मिलीग्राम (लेन 4) तक कम हो गई थी और आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक के बिना सर्जरी तुरंत (संशोधित प्रोटोकॉल) किया गया था, आरएनए जुदाई यकृत ऊतक नियंत्रण और अविशिष्ट बैंड की तुलना में कम सफल रहा था।

आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक में डूबे एक संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए नमूनों की अखंडता का मूल्यांकन
आरएनए निष्कर्षण अभिकर्ण के साथ उत्पादित आरएनए की अखंडता संरक्षण समय और तापमान (लेन 5-8) पर निर्भर करती है। नियंत्रण जिगर के ऊतकों के साथ तुलना में, आरएनए जुदाई सफल नहीं था जब अग्नाशय के ऊतकों की मात्रा ५० मिलीग्राम (लेन 5) या 20-30 मिलीग्राम (लेन 6) था । आरएनए को ऊतक आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक में डूबे जाने के तुरंत बाद निकाला गया था। कोई विशिष्ट बैंड नहीं देखा गया जब 20-30 मिलीग्राम ऊतक आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक में 48 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जलमग्न हो गया था और प्रोटोकॉल के आधार पर आरएनए निकाला गया था। इलेक्ट्रोफोरेसिस परिणामों के अनुसार, आरएनए पूरी तरह से अपमानित (लेन 7) था। जैसा कि लेन 8 में दर्शाया गया है, स्वीकार्य बैंड (28S/18S rRNA) आरएनए स्थिरीकरण अभिवाचन में 20-30 मिलीग्राम अग्नाशय के ऊतकों को जलमग्न करने के बाद 24 घंटे के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर देखा गया था, और फिर आरएनए निकाला गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: आरएनए की अखंडता का आकलन जांच के तहत प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए निष्कर्षण अभिकर्षक का उपयोग कर चूहा अग्नाशय ऊतकों से अलग । लेन 1 एक नियंत्रण के रूप में जिगर से प्राप्त आरएनए की अखंडता को दर्शाया गया है । लेन 2 एक नियमित शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल से प्राप्त कुल आरएनए में 28S/18S rRNA बैंड की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है । लेन 3 एक संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल और ऊतक के ५० मिलीग्राम से प्राप्त कुल आरएनए में 28S/18S rRNA बैंड की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है । लेन 4 एक संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल और ऊतक के 20-30 मिलीग्राम से प्राप्त कुल आरएनए में 28S/18S rRNA बैंड की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है । लेन 5 कुल आरएनए में 28S/18S rRNA बैंड की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है एक संशोधित शल्य प्रोटोकॉल से प्राप्त की और ५० मिलीग्राम ऊतक तुरंत आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक में डूबे होने के बाद निकाला । लेन 6 आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक में डूबे होने के तुरंत बाद निकाले गए एक संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल से अग्नाशय के ऊतकों के 20-30 मिलीग्राम से प्राप्त आरएनए की अखंडता को दर्शाता है। लेन 7 में आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक में -80 डिग्री सेल्सियस पर विसर्जन के 48 घंटे के बाद एक संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल से 20-30 मिलीग्राम ऊतक से प्राप्त आरएनए की अखंडता को दर्शाया गया है। लेन 8 में -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्थिरीकरण अभिवात में विसर्जन के 24 घंटे के बाद एक संशोधित सर्जिकल प्रोटोकॉल से 20-30 मिलीग्राम ऊतक से प्राप्त आरएनए की अखंडता को दर्शाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

आणविक जीव विज्ञान में उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं और ऊतकों में राइबोन्यूक्लिज एंजाइमों की उपस्थिति जल्दी से आरएनए को नीचा दिखाती है और निष्कर्षण जटिल बनाती है। RNases किसी भी सह कारकों के बिना काम स्थिर एंजाइम हैं। आरएनए को नष्ट करने के लिए आरएनएएस की छोटी मात्रा पर्याप्त है। जब चूहा अग्नाशय के ऊतकों को पेट की गुहा से हटा दिया जाता है, तो सर्जिकल उपकरणों को मजबूत डिटर्जेंट द्वारा कीटाणुरहित करना, उन्हें अच्छी तरह से कुल्ला करना और सर्जरी से पहले RNases को निष्क्रिय करने के लिए उन्हें कम से कम 4 घंटे के लिए 240 डिग्री सेल्सियस के लिए ओवन में डालना आवश्यक है। इस तथ्य को देखते हुए कि आरएनएएस का स्तर अग्न्याशय में बहुत अधिक है, सर्जरी की जगह को नाओएच और हल्के ब्लीच के साथ निष्फल किया जाता है ताकि RNases को निष्क्रिय किया जा सके। जबकि अग्नाशय के ऊतकों विच्छेदन के दौरान हटाया जा रहा है, आरएनए नीचा होगा । कार्यकुशलता बढ़ाने के लिए,,विच्छेदन को,20, 21, 22,,23,,24के रूप में जल्द से जल्द पूरा किया जाना आवश्यक है।2124

अग्न्याशय शरीर के होम्योस्टिटिक तंत्र के लिए एक महत्वपूर्ण ऊतक है। इसलिए, बेहतर अग्नाशय आरएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं शोधकर्ताओं को बेहतर सक्रिय रास्तों को समझने में मदद । वर्तमान प्रोटोकॉल ने अग्न्याशय से आरएनए निष्कर्षण के लिए एक कुशल, सरल और अनुकूलित विधि के लिए एक मॉडल का प्रस्ताव किया। अग्नाशय के ऊतकों से विभिन्न आम आरएनए निष्कर्षण विधियों का मूल्यांकन किया गया। यह आरएनए गुणवत्ता को प्रभावित करने वाली जमे हुए भंडारण और आरएनएई अवरोध रणनीतियों के प्रभाव पर केंद्रित था। आरएनए की अखंडता को प्रभावित करने वाले दो सबसे महत्वपूर्ण कारक सर्जरी अवधि और एकत्र अग्नाशय के ऊतकों की मात्रा हैं। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएनए क्षरण और अग्नाशय के ऊतकों की मात्रा 8,,138,20के बीच सकारात्मक संबंध है ।

इस प्रोटोकॉल में एनेस्थेटाइज्ड चूहों से 2 मिनट से भी कम समय में 20-30 मिलीग्राम अग्नाशय के ऊतक प्राप्त किए गए थे। लंबे सर्जिकल चरण अग्न्याशय में अंतर्जात अंतःस्रनीय को सक्रिय करने और आरएनए को जल्दी नीचा दिखा सकते हैं। इस अध्ययन में, आरएनए को ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट के साथ विभिन्न नमूनों से अलग किया गया था, और फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण तकनीकों ने आरएनए गतिविधि को बाधित करने के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग किया। विधि ने तीन उद्देश्यों को प्राप्त किया: अग्नाशय के ऊतकों में आरएनए स्थिरीकरण रिएजेंट का तेजी से पारम, सेलुलर आरएनए की सुरक्षा, और संरक्षण समय में वृद्धि हुई। परिणाम इष्टतम थे जब आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्ण वाले नमूनों को 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था।

हालांकि, आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक शुरू होने पर आरएनए अखंडता में काफी वृद्धि हुई। इसके अलावा, यह प्रक्रिया प्रजनन योग्य थी। अग्न्याशय (20-30 मिलीग्राम) का एक छोटा सा हिस्सा एनेस्थेटाइज्ड चूहों से सर्जरी के दौरान विच्छेदित किया गया था और 1-2 दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्थिरीकरण अभिवास्कर के 1 एमएल में डूबा हुआ था। जैसा कि लेन 8 में देखा गया है, 24 घंटे के लिए भंडारण इष्टतम समय था।

उपरोक्त तरीकों ने आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्ण की एक छोटी मात्रा को अंग में प्रवेश करने की अनुमति दी। इसके अलावा, प्रयोगों के तुरंत बाद गिरावट की प्रक्रिया बंद हो गई क्योंकि विच्छेदित टुकड़ों का आकार छोटा था। इस प्रोटोकॉल में, महत्वपूर्ण कदम आरएनए स्थिरीकरण अभिवाक में डूबे ऊतक को जितनी जल्दी हो सके बहुत छोटे टुकड़ों में काट रहा है जब तक कि यह कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करता है और आरएनएसई की सक्रियता को दबा देता है। समरूप कदम में, आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट में बुलबुला उत्पादन को रोकने और 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों को करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। डीएनए संदूषण से बचने के लिए एक्वा चरण (आरएनए युक्त चरण) को बहुत सावधानी से अलग करना महत्वपूर्ण है। यद्यपि ऑटोलिसिस और अंतर्जात आरएनएस की उपस्थिति चूहे अग्न्याशय से बरकरार आरएनए अलगाव से समझौता करती है, आरएनए की अखंडता प्रस्तावित अग्न्याशय पर्फ्यूजन विधि में बनाए रखी गई थी। इस प्रकार, प्रस्तावित विधि एक सीधी, प्रजनन योग्य और सस्ती प्रक्रिया है जिसके लिए अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में आरएनए स्थिरीकरण अभिकरने की छोटी मात्रा की आवश्यकता होती है।

किसी भी अध्ययन की तरह, इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, प्राप्त आरएनए की अखंडता और उपज पूरे अग्नाशय के ऊतकों का उपयोग करने से कम है क्योंकि केवल 20-30 मिलीग्राम ऊतक का उपयोग किया जाता है। दूसरा, एक दिन में बड़ी संख्या में नमूने नहीं लिए जा सकते क्योंकि आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण परीक्षण आरएनए क्षरण को कम करने के लिए तेजी से और लगातार किया जाना चाहिए। तीसरा, विभिन्न चूहा समूहों के साथ अनुसंधान परियोजनाओं को करने के लिए, डेटा की भिन्नता को कम करने के लिए एक ही शल्य क्षेत्र से बिल्कुल 20-30 मिलीग्राम ऊतक लेना आवश्यक है क्योंकि चूहा अग्नाशय ऊतक पेरिटोनियल गुहा में पूरी तरह से फैलता है।

समाप्त करने के लिए, आरएनए स्थिरीकरण अभिकर्मक के बाद आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक समाधान का उपयोग करना महंगा और कॉलम-आधारित आरएनए निष्कर्षण किट का एक अच्छा विकल्प है।

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Disclosures

किसी ने घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

वर्तमान अध्ययन को शिराज आयुर्विज्ञान विश्वविद्यालय (अनुदान संख्या 93-01-01-7178\03-07-2014) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था । हम वीडियो के संपादन के लिए ई-लर्निंग इन मेडिकल साइंसेज, वर्चुअल स्कूल और सेंटर ऑफ एक्सीलेंस इन ई-लर्निंग, शिराज यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिकल साइंसेज में श्री जोमोरोडियन और श्री रोस्टामी को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Merck 116801 Germany
Atoclave Teb Zaim Iran
Centrifuge Sigma Germany
Chloroform Merck 107024 Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water Sigma Germany
EDTA sigma 60-00-4 Germany
Electrophoresis tank Payapajoohesh Iran
Eppendorf microTube Extragene Taiwan
EtBr sigma E 8751 Germany
Ethanol Merck 81870 Germany
Falcon Tube Extragene Taiwan
Formaldehyde Merck 344198 Germany
Formamide Merck 344206 Germany
Homogenizer-sunicator Microson XL 2000 USA
Isopropanol sigma 19516 Germany
Ketamine hydrochloride sigma 1867-66-9 Germany
Laminar Flow Hood Jal Tajhiz Iran
Mgnetic stirrer Labrotechnik USA
Microcentrifuge Eppendorf Germany
Micropipette Tips Extragene Taiwan
MOPS sigma 85022106 Germany
Na AC Merck 567422 Germany
NaOH Merck 109137 Germany
Oven Teb Zaim Iran
PH meter Knick Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent Qiagen 76104 USA
Surgical instrument Agn Thos German made
Syringes AvaPezeshk Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent Roche 11667157001 USA
Vortex Labinco Netherland
Water bath Memmert Germany
zylazine sigma 7361-61-7 Germany

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 163 शुद्धता निष्कर्षण आरएनए अग्न्याशय ऑटोलिसिस लागत प्रभावी
चूहा अग्नाशय के ऊतकों की तेजी से और लागत प्रभावी आरएनए निष्कर्षण
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Dastghaib, S., Shahsavar, Z.,… More

Dastghaib, S., Shahsavar, Z., Karimian, Z., Mokarram, P. Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (163), e61255, doi:10.3791/61255 (2020).

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