Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Быстрая и экономически эффективная РНК-экстракция крысиной ткани поджелудочной железы

Published: September 19, 2020 doi: 10.3791/61255
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,5
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, 2Endocrinology and Metabolism Research Center, Nemazee Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, 3English Language Department, Faculty of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, 4Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School and Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences, 5Autophagy Research Center, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences

Summary

Чистота и целостность изолированной РНК является жизненно важным шагом в РНК зависимых анализов. Здесь мы представляем практический, быстрый и недорогой метод извлечения РНК из небольшого количества неповрежденной ткани поджелудочной железы.

Abstract

Независимо от метода экстракции, оптимизированная рнк-экстракция тканей и клеточных линий осуществляется в четыре этапа: 1) гомогенизация, 2) эффективная денатурация белков из РНК, 3) инактивация рибонуклеазы и 4) удаление загрязнения из ДНК, белков и углеводов. Тем не менее, это очень трудоемкий для поддержания целостности РНК, когда Есть высокий уровень RNase в ткани. Спонтанный аутолиз делает его очень трудно извлечь РНК из ткани поджелудочной железы, не повреждая его. Таким образом, практический метод извлечения РНК необходим для поддержания целостности тканей поджелудочной железы в процессе извлечения. Экспериментальное и сравнительное исследование существующих протоколов было проведено путем получения 20-30 мг тканей поджелудочной железы крыс менее чем за 2 минуты и извлечения РНК. Результаты были оценены электрофорезом. Эксперименты проводились трижды для обобщения результатов. Погружение ткани поджелудочной железы в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию на 24 ч дало высокую целостность РНК, когда реагент извлечения РНК использовался в качестве реагента. Полученные результаты были сопоставимы с результатами, полученными из коммерческих комплектов с привязками спиновой колонки.

Introduction

Структурные генные данные могут быть транскрибированы в функциональный продукт через экспрессию генов. Анализ РНК используется для обнаружения различий в экспрессии генов в различных условиях. Существует ряд методов извлечения нуклеиновых кислот следующим образом: гуанидиний тиоцианат, экстракция через фенол-хлороформ, целлюлозно-основанная хроматография, экстракция матрицами кремнезема ианион-обмен 1,,2.

Правильное обнаружение экспрессии генов зависит от целостности РНК, изолированной от тканей; поэтому крайне важно оценить целостность РНК, изолированной от тканей, до того, как будут проведены дальнейшие испытания, поскольку дополнительные молекулярные тесты на некачественной РНК могут поставить под угрозу результаты диагностического применения. Таким образом, высокой целостности РНК необходима для молекулярно-биологических тестов с различными диагностическими приложениями: количественные RT-PCR, микро-arrays, рибонуклеазы защиты анализа, северной помарки анализа, РНК-картирования, и строительство библиотеки cDNA3,4.

РНК становится довольно нестабильной после того, как хранится в течение длительного времени. Длинные фрагменты мРНК более 10 кб особенно восприимчивы кдеградации 5,,6. Таким образом, исследователи должны учитывать различные факторы, влияющие на целостность очищенной РНК. Чистота РНК должна быть защищена от RNases, белков, геномной ДНК и ферментативного загрязнения ингибиторами. Кроме того, наилучшее и приемлемое соотношение поглощения РНК к УФ (260/280) должно быть в пределах 1,8-2,0 с минимальной фрагментацией над электрофорезом. Недавно разработанные лабораторные методы позволили ученым оценить целостность образца молекулярного анализа болеепрактически 7,,8.

Гораздо труднее извлечь неповрежденную РНК из ткани поджелудочной железы, чем другие типы тканей из-за большого количества рибонуклейсов (RNases). Однако существующие методы экстракции, а именно быстрый выброс ткани поджелудочной железы из брюшной полости и гомогенизация при низких температурах, препятствующие RNases, оказалисьнеэффективными 7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14.

Целью нынешнего сравнительного экспериментального исследования является изменение и сравнение существующих методов для определения наиболее эффективных методов. С этой целью были изменены и сопоставлены различные протоколы извлечения РНК. Он был специально направлен на определение наименее дорогостоящего метода, требующего минимального количества ткани поджелудочной железы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этическое одобрение этого исследования было получено в Ширазском университете медицинских наук (утверждение номер: 93-01-01-7178-03-07-2014). approval

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте самцов крыс Спраг-Доули весом 250 г. Поместите флакон, содержащий щепку ткани поджелудочной железы, погруженную в РНК стабилизирующий реагент, в резервуар с жидким азотом при -80 градусов по Цельсию и используйте раствор реагентов для извлечения РНК для поддержания целостности РНК.

1. Удаление ткани поджелудочной железы крысы

  1. Подготовь операционную и поместите все необходимые материалы под капот.
  2. Стерилизовать все хирургические инструменты (одевание типсов, коричневый-Adson типсы, ножницы Ирис, и Littler ножницы) в духовке, по крайней мере 4 ч при температуре 240 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать RNases15. Стерилизовать поверхность хирургического места с 70% алкоголя под капотом.
  3. Инъекционный кетамин/ксилазин интраперитонно с использованием инсулинового шприца (80/8 мг/кг). Проверьте глубину анестезии, щипать крысы ног за отсутствие ответа.
  4. Добавьте 1 мл реагента стабилизации РНК в правильную микротрубку (2 мл) для ингибирования активации эндонуклейза в выкакциированных тканях.
  5. Немедленно поместите крысу на хирургическую доску (голова от хирурга) для разреза средней линии.
  6. Стерилизовать всю брюшную поверхность с 70% алкоголя и удалить крысиные волосы с помощью ножницы для волос #40 лезвиями.
  7. Сделайте V-образный разрез, чтобы открыть живот от лобковой области до передних ног с силами одевания, forceами Brown-Adson, ножницами Iris и ножницами Littler.
  8. Переверните органы брюшной полости в левую сторону, чтобы разоблачить поджелудочной железы. Тщательно найдите ткани поджелудочной железы, которая распространяется в брюшной полости. Найдите область под селезенкой, чтобы найти поджелудочной железы, не путать с жировой тканью.
  9. Немедленно удалите 20-30 мг поджелудочной железы из брюшной полости менее чем за 2 мин. Положите удаленную ткань в микротрубку 2 мл быстро и разрежьте ее стерильным резаком, чтобы проникнуть в разделенные ткани с реагентом стабилизации РНК.
  10. Поместите микротрубки в резервуар с азотом, чтобы немедленно замерзнуть. Храните микротрубку в морозильной камере -80 градусов по Цельсию в течение 24ч 16.
  11. После 24 ч, передать крошечные кусочки тканей поджелудочной железы в контейнер со льдом.
  12. Впрыснуть хлорид калия (KCl) intracardially для эвтаназии крыс после операции.

2. Добыча РНК

  1. Стерилизовать поверхность под капотом с 70% алкоголя.
  2. Положите 1 мл реагента экстракции РНК, который содержит гуанидиний тиоцианат для ингибирования RNase, в стерильной микротрубки.
  3. Перенесите отделенную ткань поджелудочной железы на микротрубки. Перенесите микротрубки в жидкий азот, чтобы немедленно заморозить.
  4. Гомогенизировать ткани с микро наконечник зонда sonicator на 4 градусов по Цельсию установлен на уровне 20 для 60 с и 5 с выключенным.
  5. Инкубировать каждый гомогенизированный образец в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия с использованием дробленого льда, чтобы позволить нуклеопротеин комплексов быть полностью разобщены.
  6. Обогащает образцы 0,2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента экстракции РНК. Крышка трубки твердо и встряхнуть его силой в течение 15 с.
  7. Инкубировать трубку в течение 15 минут на дробленом льду (4 градусов по Цельсию), чтобы отделить реагент в три этапа.
  8. Вы запустите центрифугу по 12 000 х г в течение 15 мин при 2 - 8 градусов по Цельсию. Перенесите бесцветную aqueous фазу на новую микротрубку.
  9. Добавьте 0,5 мл 100% изопропанола в aqueous фазу. Закройте трубку, а затем инвертировать его по крайней мере 3 раза, чтобы смешать РНК тщательно.
  10. Инкубировать образец в течение 5-10 минут на холодной коробке (4 градусов по Цельсию), чтобы РНК осадков.
  11. Вы запустите центрифугу по 12 000 х г в течение 15 мин при 2 - 8 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта.
  12. Обогатить каждую из трубок центрифуги 1 мл 75% этанола.
  13. Вымойте гранулы РНК, инвертирование трубки по крайней мере 3 раза.
  14. Вы запустите центрифугу по 7500 х г при 2 до 8 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Откажитесь от супернатанта, чтобы удалить избыток этанола из гранул РНК путем сушки воздуха.
  15. Повторно приостановить РНК гранулы в диэтилпирокарбонат (DEPC)-обработанных RNase свободной воды.
  16. Перейдите раствор через наконечник пипетки несколько раз, чтобы растворить гранулы РНК. Затем инкубировать раствор в течение 10-15 мин при 65 градусов по Цельсию.

3. Оценка целостности РНК с помощью электрофорезации денатурации

  1. Подготовка гель работает буфер: 50 мМ Наак (DEPC лечение) и 0,5 М EDTA (рН 8,0) в DEPC-обработанных H2O.
  2. Подготовка 5x формальдегида гель работает буфер (MOPS работает буфер): 0,1 М MOPS (рН 7,0), 40 мМ Наак, 5 мМ EDTA (рН 8,0).
    1. Растворите 20,6 г MOPS в 800 мл DEPC обработано 50 м ацетата натрия. Отрегулируйте рН до 7,0 с 2 N NaOH. Добавьте 10 мл ОБработаемого DEPC 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Отрегулируйте объем раствора до 1 л с помощью воды, обработанной DEPC.
    2. Фильтровать раствор через фильтр 0,2 мкм и держать его при комнатной температуре от света ради стерилизации. Буфер становится желтым со временем, если он подвергается воздействию света или автоматически. Буфер соломенного цвета работает хорошо, но темные не17.
  3. Подготовка 1,5% агарозы гель18. Для 50 мл добавьте 0,75 г агарозы и 31 мл H2O. Микроволновая печь раствор в микроволновой печи в течение 1 мин. Добавьте 9 мл формальдегида и 10 мл 5x буфера MOPS.
  4. Подготовь образцы для геля. Смешайте следующее в стерильной трубке микрофьюджа:
    РНК X х L (до 30 мкг)
    2 МКЛ буфера загрузки геля 5x
    10 МКЛ формамида
    4 МКЛ буфера MOPS
    1 мл 0,1 мг/мл EtBr
    3 МКЛ формальдегида 5-х МКЛ DEPC-H2O
  5. Инкубировать образцы при 65 градусов по Цельсию в течение 15 минут и охладить их на льду. Центрифуга на 5 с, пока вся жидкость не будет отложена.
  6. Предварительно запустите гель при 5 В/см в течение 5 минут.
  7. Загрузите образцы в полосы геля немедленно, а затем погрузить гель в 1x формальдегид гель работает буфер. Вы бегите при 3-4 В/см19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка целостности РНК в реагенте извлечения РНК в соответствии с обычным и измененным хирургическим протоколом без реагента стабилизации РНК
Неприемлемые полосы наблюдались после извлечения РНК с реагентом извлечения РНК из обычного хирургического протокола. Лейн 1 показывает РНК из печени в качестве контроля. Лейн 2 показывает деградированных статус 28S/18S rRNA полос в общей сложности РНК, полученных из обычного хирургического протокола. Когда количество ткани поджелудочной железы было сокращено до 50 мг (полоса 3) или 20-30 мг (полоса 4) и операция была выполнена немедленно (модифицированный протокол) без реагента стабилизации РНК, отделение РНК было менее успешным, чем в контроле тканей печени и неспецифические полосы наблюдались.

Оценка целостности образцов РНК в соответствии с измененным хирургическим протоколом, погруженным в реагент стабилизации РНК
Целостность РНК, производимых с помощью реагента извлечения РНК, зависит от времени консервации и температуры (полоса 5-8). По сравнению с контрольной тканью печени, разделение РНК не было успешным, когда количество ткани поджелудочной железы было 50 мг (полоса 5) или 20-30 мг (полоса 6). РНК была извлечена сразу после погружения ткани в реагент стабилизации РНК. Специфической полосы не наблюдалось, когда 20-30 мг ткани погружали в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию в течение 48 ч и РНК извлекалась на основе протокола. Согласно результатам электрофорезы, РНК была полностью деградирована (полоса 7). Как по изображено в полосе 8, приемлемые полосы (28S/18S rRNA) наблюдались после погружения 20-30 мг ткани поджелудочной железы в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию в течение 24 ч, а затем РНК была извлечена.

Figure 1
Рисунок 1: Оценка целостности РНК, изолированной от тканей поджелудочной железы крысы с использованием реагента извлечения РНК в соответствии с протоколами в рамках расследования. Лейн 1 изображает целостность РНК, полученной из печени в качестве контроля. Переулок 2 представляет собой статус 28S/18S rRNA полос в общей сложности РНК, полученных из обычного хирургического протокола. Переулок 3 представляет собой статус 28S/18S rRNA полос в общей сложности РНК, полученных из модифицированного хирургического протокола и 50 мг ткани. Переулок 4 представляет собой статус 28S/18S rRNA полос в общей сложности РНК, полученных из модифицированного хирургического протокола и 20-30 мг ткани. Переулок 5 представляет собой статус полос 28S/18S rRNA в общей сложности РНК, полученной из модифицированного хирургического протокола и 50 мг ткани, извлеченной сразу после погружения в реагент стабилизации РНК. Лейн 6 показывает целостность РНК, полученной из 20-30 мг ткани поджелудочной железы из модифицированного хирургического протокола, извлеченного сразу после погружения в реагент стабилизации РНК. Лейн 7 изображает целостность РНК, полученной из 20-30 мг ткани из модифицированного хирургического протокола после 48 ч погружения в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию. Лейн 8 изображает целостность РНК, полученной из 20-30 мг ткани из модифицированного хирургического протокола после 24 ч погружения в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В молекулярной биологии очень важно получить высококачественную РНК. Наличие ферментов рибонуклеазы в клетках и тканях быстро ухудшает РНК и делает экстракции сложным. RNases являются стабильными ферментами, функционирующими без каких-либо со-факторов. Небольшое количество RNase достаточно, чтобы уничтожить РНК. Когда ткань поджелудочной железы крысы удаляется из брюшной полости, необходимо дезинфицировать хирургические инструменты сильными моющими средствами, тщательно промойте их и поставь их в духовку, по крайней мере 4 ч при температуре 240 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать RNases перед операцией. Учитывая тот факт, что уровень RNase чрезвычайно высок в поджелудочной железе, место операции стерилизовано с NaOH и мягкий отбеливатель для деактивации RNases. В то время как ткани поджелудочной железы удаляется во время вскрытия, РНК будет деградировать. Для повышения эффективности необходимо, чтобы вскрытие было завершено какможно быстрее 20,,21,,22,,23,,24.

Поджелудочная железа является важнейшей тканью для гомеостатические механизмы организма. Таким образом, улучшение процедур экстракции РНК поджелудочной железы поможет исследователям лучше понять активные пути. В настоящем протоколе предложена модель эффективного, простого и оптимизированного метода извлечения РНК из поджелудочной железы. Были оценены различные распространенные методы извлечения РНК из ткани поджелудочной железы. Она была сосредоточена на воздействии замороженных хранилищ и стратегии ингибирования RNase, влияющие на качество РНК. Двумя наиболее важными факторами, влияющими на целостность РНК, являются продолжительность операции и количество собранной ткани поджелудочной железы. Недавние исследования показали, что существует положительная корреляция между деградацией РНК и количествомткани поджелудочной железы 8,,13,,20.

В этом протоколе, 20-30 мг ткани поджелудочной железы был получен менее чем за 2 минуты от анестезированых крыс. Длительные хирургические шаги могут привести к активации эндогенных эндонуклей в поджелудочной железе и быстро ухудшить РНК. В этом исследовании, РНК была выделена из различных образцов с гуанидиния тиоцианата, и фенол-хлороформ методы извлечения использовали жидкий азот, чтобы препятствовать активности РНК. Метод достиг трех целей: быстрая проницаемка реагента стабилизации РНК в тканях поджелудочной железы, защита клеточной РНК и увеличение времени консервации. Результаты были оптимальными, когда образцы, содержащие реагент стабилизации РНК, держались на уровне -80 градусов по Цельсию в течение 24 ч.

Однако целостность РНК значительно возросла, когда был введен реагент стабилизации РНК. Более того, этот процесс был воспроизводим. Небольшой участок поджелудочной железы (20-30 мг) был вскрыт во время операции от анестезированные крысы и погружен в 1 мл реагента стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию в течение 1-2 дней. Как видно из полосы 8, хранение в течение 24 ч было оптимальным временем.

Вышеупомянутые методы позволили меньшему количеству рнк стабилизационного реагента проникнуть в орган. Кроме того, процесс деградации прекратился вскоре после экспериментов, поскольку размер расчлененных частей был небольшим. В этом протоколе жизненно важным шагом является сокращение погруженной ткани в реагент стабилизации РНК на очень мелкие кусочки как можно скорее, пока он не проникает в клетки и подавляет активацию RNase. В гомогенизации шаг, это очень важно, чтобы предотвратить производство пузырьков в реагенте экстракции РНК и выполнять все шаги при 4 градусов по Цельсию. Очень важно очень тщательно отделить водную фазу (фазу, содержащую РНК), чтобы избежать заражения ДНК. Хотя аутолиз и наличие эндогенных RNases компромисс нетронутыми РНК изоляции от поджелудочной железы крысы, целостность РНК была сохранена в предлагаемом методе перфузии поджелудочной железы. Таким образом, предлагаемый метод является простой, воспроизводимой и недорогой процедурой, которая требует меньшего количества реагента стабилизации РНК, чем другие существующие методы.

Как и любое исследование, этот протокол имеет некоторые ограничения. Во-первых, целостность и урожайность полученной РНК меньше, чем использование всей ткани поджелудочной железы, так как используется только 20-30 мг ткани. Во-вторых, большое количество образцов не может быть взято в один день, потому что экстракция РНК, а также тесты синтеза кДНК должны быть сделаны быстро и последовательно, чтобы уменьшить деградацию РНК. В-третьих, для выполнения исследовательских проектов с различными группами крыс, важно принять ровно 20-30 мг ткани из той же хирургической области, чтобы уменьшить изменение данных, потому что крыса поджелудочной ткани полностью рассеивается в брюшной полости.

В заключение, использование раствора реагентов для извлечения РНК после перфузии РНК-стабилизации является хорошей альтернативой дорогим и колонкам на основе комплектов для извлечения РНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один не объявлен.

Acknowledgments

Нынешнее исследование было финансово поддержано Ширазского университета медицинских наук (Грант No 93-01-01-7178-03-07-2014). Мы благодарим г-на Зоморояна и г-на Ростами на кафедре электронного обучения в области медицинских наук, виртуальной школе и Центре передового опыта в области электронного обучения, Ширазском университете медицинских наук за редактирование видео.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Merck 116801 Germany
Atoclave Teb Zaim Iran
Centrifuge Sigma Germany
Chloroform Merck 107024 Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water Sigma Germany
EDTA sigma 60-00-4 Germany
Electrophoresis tank Payapajoohesh Iran
Eppendorf microTube Extragene Taiwan
EtBr sigma E 8751 Germany
Ethanol Merck 81870 Germany
Falcon Tube Extragene Taiwan
Formaldehyde Merck 344198 Germany
Formamide Merck 344206 Germany
Homogenizer-sunicator Microson XL 2000 USA
Isopropanol sigma 19516 Germany
Ketamine hydrochloride sigma 1867-66-9 Germany
Laminar Flow Hood Jal Tajhiz Iran
Mgnetic stirrer Labrotechnik USA
Microcentrifuge Eppendorf Germany
Micropipette Tips Extragene Taiwan
MOPS sigma 85022106 Germany
Na AC Merck 567422 Germany
NaOH Merck 109137 Germany
Oven Teb Zaim Iran
PH meter Knick Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent Qiagen 76104 USA
Surgical instrument Agn Thos German made
Syringes AvaPezeshk Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent Roche 11667157001 USA
Vortex Labinco Netherland
Water bath Memmert Germany
zylazine sigma 7361-61-7 Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
  2. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
  3. Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
  4. Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
  5. Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
  6. Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
  7. Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
  8. Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
  9. Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
  10. Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
  11. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
  12. Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
  13. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
  14. Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
  15. Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
  16. Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
  17. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
  18. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  19. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
  20. Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
  21. Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
  22. Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
  23. Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
  24. Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).

Tags

Биохимия выпуск 163 Чистота Добыча РНК Поджелудочная железа Аутолиз Рентабельный
Быстрая и экономически эффективная РНК-экстракция крысиной ткани поджелудочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dastghaib, S., Shahsavar, Z.,… More

Dastghaib, S., Shahsavar, Z., Karimian, Z., Mokarram, P. Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (163), e61255, doi:10.3791/61255 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter