Summary
Renheten og integriteten til den isolerte RNA er et viktig skritt i RNA-avhengige analyser. Her presenterer vi en praktisk, rask og billig metode for å trekke ut RNA fra en liten mengde uskadet bukspyttkjertelvev.
Abstract
Uavhengig av ekstraksjonsmetoden utføres optimalisert RNA-ekstraksjon av vev og cellelinjer i fire faser: 1) homogenisering, 2) effektiv denaturation av proteiner fra RNA, 3) ribonuclease inaktivering, og 4) fjerning av forurensning fra DNA, proteiner og karbohydrater. Det er imidlertid svært arbeidskrevende å opprettholde integriteten til RNA når det er høye nivåer av RNase i vevet. Spontan autolyse gjør det svært vanskelig å trekke ut RNA fra bukspyttkjertelvev uten å skade den. Dermed er det nødvendig med en praktisk RNA-ekstraksjonsmetode for å opprettholde integriteten til bukspyttkjertelvev under ekstraksjonsprosessen. En eksperimentell og komparativ studie av eksisterende protokoller ble utført ved å oppnå 20-30 mg rotte bukspyttkjertelvev på mindre enn 2 minutter og trekke ut RNA. Resultatene ble vurdert ved elektroforese. Eksperimentene ble utført tre ganger for generalisering av resultatene. Nedsenking av pankreasvev i RNA-stabiliseringsreagens ved -80 °C i 24 timer ga høy integritet RNA, da RNA-ekstraksjonsreagensen ble brukt som reagens. Resultatene som ble oppnådd var sammenlignbare med resultatene fra kommersielle sett med spin kolonnebindinger.
Introduction
Strukturelle gendata kan transkriberes til et funksjonelt produkt gjennom genuttrykk. RNA-analyse brukes til å oppdage forskjeller i genuttrykk på tvers av ulike forhold. Det finnes en rekke metoder for å trekke ut nukleinsyrer som følger: guanidiniumthiocyanat, ekstraksjon via fenolklorform, cellulosebasert kromatografi, ekstraksjon av silikamatriser og anionutveksling1,,2.
Riktig påvisning av genuttrykk påvirkes av integriteten til RNA isolert fra vev; Derfor er det viktig å evaluere integriteten til RNA isolert fra vev før ytterligere tester utføres fordi komplementære molekylære tester på lav kvalitet RNA kan sette diagnostiske applikasjonsresultater i fare. Dermed er høy integritet RNA nødvendig for molekylære biologiske tester med ulike diagnostiske applikasjoner: kvantitativ RT-PCR, mikro-arrays, ribonuclease beskyttelse analyse, nordlige blot analyse, RNA kartlegging, og cDNA bibliotek konstruksjon3,,4.
RNA blir ganske ustabil etter å ha blitt holdt i lang tid. Lange mRNA-fragmenter over 10 kb er spesielt utsatt for nedbrytning5,6. Dermed må forskerne vurdere ulike faktorer som påvirker integriteten til renset RNA. Renheten av RNA må beskyttes mot RNases, proteiner, genomisk DNA og enzymatisk hemmerkontaminering. I tillegg må det beste og akseptable absorpsjonsforholdet mellom RNA og UV (260/280) være innenfor området 1,8-2,0 med minimal fragmentering over elektroforese. Nylig utviklede laboratorieteknikker har gjort det mulig for forskere å evaluere integriteten til molekylær analyseprøve mer praktisktalt 7,8.
Det er mye vanskeligere å trekke ut uskadet RNA fra bukspyttkjertelvev enn andre typer vev på grunn av den høye mengden ribonucleases (RNases). Men eksisterende ekstraksjonsmetoder, nemlig rask utstøting av bukspyttkjertelvevet fra bukhulen og homogenisering ved lave temperaturer for å hindre RNases, har vist seg ineffektive7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14.
Formålet med den nåværende komparative eksperimentelle studien er å endre og sammenligne eksisterende metoder for å bestemme de mest effektive metodene. For dette formål ble ulike protokoller for RNA-utvinning endret og sammenlignet. Det var spesielt rettet mot å bestemme den minst kostbare metoden som krever et minimum av bukspyttkjertelvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkjenning for denne studien ble innhentet fra Shiraz University of Medical Sciences (Godkjenningsnummer: 93-01-01-7178\03-07-2014). approval
MERK: Bruk hannSprague–Dawley rotter som veier 250 g. Plasser hetteglasset som inneholder en sliver av bukspyttkjertelvev nedsenket i RNA stabiliserende reagens i en flytende nitrogentank ved -80 °C og bruk RNA ekstraksjonsreagensoppløsning for å opprettholde integriteten til RNA.
1. Fjerning av rotte bukspyttkjertelvevet
- Forbered operasjonssalen og plasser alle nødvendige materialer under panseret.
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter (Dressing tang, Brown-Adson tang, Iris saks, og Littler saks) i en ovn i minst 4 t ved 240 ° C for å inaktivere RNases15. Steriliser overflaten av operasjonsstedet med 70% alkohol under panseret.
- Injiser ketamin/xylazin intraperitonealt med en insulinsprøyte [80/8 mg/kg]. Kontroller dybden av anestesi ved å klemme rottens tærne for mangel på respons.
- Tilsett 1 ml RNA-stabiliseringsreagens i riktig mikrorør (2 ml) for å hemme aktivering av endonukler i utskåret vev.
- Plasser umiddelbart rotten på kirurgisk bord (hodet bort fra kirurgen) for et mellomlinjesnitt.
- Steriliser hele bukoverflaten med 70% alkohol og fjern ved hjelp av en hårklipper #40 bladene.
- Lag et V-formet snitt for å åpne magen fra kjønnsområdet til forbena med Dressing tang, Brown-Adson tang, Iris saks og Littler saks.
- Vend bukorganene til venstre side for å eksponere bukspyttkjertelen. Finn nøye bukspyttkjertelvevet, som sprer seg i bukhulen. Finn området under milten for å finne bukspyttkjertelen uten å forveksles med fettvevet.
- Fjern umiddelbart 20-30 mg bukspyttkjertel fra bukhulen på mindre enn 2 min. Sett det fjernede vevet i 2 ml mikrorør raskt og kutt det med en steril kutter for å trenge inn i det separerte vevet med RNA stabiliseringsreagens.
- Plasser mikrorøret i en nitrogentank for å fryse umiddelbart. Oppbevar mikrorøret i en -80 °C fryser i 24 t16.
- Etter 24 timer, overfør de små bitene av bukspyttkjertelvev til en isbeholder.
- Injiser kaliumklorid (KCl) intrakarialt for eutanasi av rotter etter operasjonen.
2. RNA ekstraksjon
- Steriliser overflaten under panseret med 70% alkohol.
- Sett 1 ml av RNA ekstraksjonsreagensen, som inneholder guanidiniumthiocyanat for å hemme RNase, i det sterile mikrorøret.
- Overfør det separerte bukspyttkjertelvevet til mikrorøret. Overfør mikrorøret til det flytende nitrogenet for å fryse umiddelbart.
- Homogenisere vevet med mikrospissen probe sonicator på 4 ° C satt til nivå 20 for 60 s på og 5 s av.
- Inkuber hver homogeniserte prøve i 5 min ved 4 °C ved hjelp av knust is slik at nukleoproteinkompleksene kan bli fullstendig dissosiert.
- Berike prøvene med 0,2 ml kloroform for hver 1 ml RNA ekstraksjonsreagens. Cap røret fast og riste den kraftig i 15 s.
- Inkuber røret i 15 min på den knuste isen (4 °C) for å skille reagensen i tre faser.
- Kjør sentrifugen ved 12 000 x g i 15 min ved +2 til +8 °C. Overfør den fargeløse vandige fasen til et nytt mikrorør.
- Tilsett 0,5 ml 100% isopropanol i vandig fase. Lukk røret og snu det deretter minst 3 ganger for å blande RNA grundig.
- Inkuber prøven i 5-10 min på en kald boks (4 °C) for å tillate RNA-nedbør.
- Kjør sentrifugen ved 12 000 x g i 15 min ved +2 til +8 °C. Kast det overnaturlige.
- Berike hver av sentrifugerørene med 1 ml 75% etanol.
- Vask RNA pellet ved å snu røret minst 3 ganger.
- Kjør sentrifugen ved 7500 x g ved +2 til +8 °C i 5 min. Kast det overnaturlige for å fjerne overflødig etanol fra RNA-pelleten ved lufttørking.
- Re-suspendere RNA pellet i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet RNase-fritt vann.
- Før løsningen gjennom en pipettespiss flere ganger for å oppløse RNA-pelleten. Deretter inkubere oppløsningen i 10-15 min ved +65 °C.
3. Evaluering av RNA-integritet med denaturation elektroforese
- Klargjør gelløpbuffer: 50 mM NaAc (DEPC behandlet) og 0,5 M EDTA (pH 8,0) i DEPC-behandlet H2O.
- Klargjør 5x formaldehyd gel-running buffer (MOPS kjører buffer): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Oppløs 20,6 g MOPS i 800 ml DEPC behandlet 50 mM natriumacetat. Juster pH-en til 7,0 med 2 N NaOH. Tilsett 10 ml DEPC-behandlet 0,5 M EDTA (pH 8,0). Juster volumet på oppløsningen til 1 L med DEPC-behandlet vann.
- Filtrer oppløsningen gjennom et 0,2 μm filter og hold den ved romtemperatur borte fra lys for sterilisering. Bufferen blir gul med tiden hvis den utsettes for lys eller er autoklavet. En halmfarget buffer fungerer bra, men mørkere gjør de ikke17.
- Forbered en 1,5% agarose gel18. For 50 ml, tilsett 0,75 g agarose og 31 ml H2O. Mikrobølgeovn løsningen i mikrobølgeovnen i 1 min. Legg til 9 ml formaldehyd og 10 ml 5x MOPS kjører buffer.
- Forbered prøvene på gelen. Bland følgende i et sterilt mikrodrivstoffrør:
X μL RNA (opptil 30 μg)
2 μL 5x gellastende buffer
10 μL av formamid
4 μL mops kjører buffer
1 μL på 0,1 mg/ml EtBr
3 μL formaldehyd 5 x μL DEPC-H2O - Inkuber prøvene ved 65 °C i 15 min og avkjøl dem på is. Sentrifuge i 5 s til all væske er deponert.
- Forløp gelen ved 5 V/cm i 5 minutter.
- Last prøvene inn i gelens baner umiddelbart og senk deretter gelen ned i 1x formaldehyd gel-løpebuffer. Kjør på 3-4 V/cm19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluering av integriteten til RNA i RNA-ekstraksjonsreagensen i henhold til en rutinemessig og modifisert kirurgisk protokoll uten RNA-stabiliseringsreagens
Uakseptable bånd ble observert etter ekstraksjon av RNA med RNA-ekstraksjonsreagensen fra en rutinemessig kirurgisk protokoll. Lane 1 viser RNA fra leveren som en kontroll. Lane 2 viser degradert status for 28S/18S rRNA-bånd totalt RNA hentet fra en rutinemessig kirurgisk protokoll. Når mengden av bukspyttkjertelvev ble redusert til 50 mg (lane 3) eller 20-30 mg (lane 4) og operasjonen ble utført umiddelbart (modifisert protokoll) uten RNA stabilisering reagens, RNA separasjon var mindre vellykket enn i leveren vev kontroll og uspesifik bånd ble observert.
Evaluering av integriteten til RNA-prøver i henhold til en modifisert kirurgisk protokoll nedsenket i RNA stabiliseringsreagens
Integriteten til RNA-er produsert med RNA-ekstraksjonsreagensen avhenger av bevaringstid og temperatur (kjørefelt 5-8). Sammenlignet med kontrolllevervevet var RNA-separasjon ikke vellykket når mengden bukspyttkjertelvev var 50 mg (kjørefelt 5) eller 20-30 mg (kjørefelt 6). RNA ble ekstrahert umiddelbart etter at vevet ble nedsenket i RNA stabiliseringsreagens. Ingen spesifikt bånd ble observert da 20-30 mg vev ble nedsenket i RNA stabiliseringsreagens ved -80 °C i 48 timer og RNA ble ekstrahert basert på protokollen. Ifølge elektroforeseresultatene ble RNA fullstendig degradert (kjørefelt 7). Som avbildet i kjørefelt 8 ble akseptable bånd (28S/18S rRNA) observert etter å ha nedsenket 20-30 mg pankreasvev i RNA stabiliseringsreagens ved -80 °C i 24 timer, og deretter ble RNA ekstrahert.
Figur 1: Vurdering av integriteten til RNA isolert fra rottepankreasvev ved hjelp av RNA ekstraksjonsreagens i henhold til protokollene under undersøkelsen. Lane 1 viser integriteten til RNA hentet fra leveren som en kontroll. Lane 2 representerer statusen til 28S/18S rRNA-bånd totalt RNA hentet fra en rutinemessig kirurgisk protokoll. Lane 3 representerer statusen til 28S/18S rRNA-bånd totalt RNA hentet fra en modifisert kirurgisk protokoll og 50 mg vev. Lane 4 representerer statusen til 28S/18S rRNA-bånd totalt RNA hentet fra en modifisert kirurgisk protokoll og 20-30 mg vev. Lane 5 representerer statusen til 28S/18S rRNA-bånd totalt RNA hentet fra en modifisert kirurgisk protokoll og 50 mg vev ekstrahert umiddelbart etter å ha blitt nedsenket i RNA stabiliseringsreagens. Lane 6 viser integriteten til RNA hentet fra 20-30 mg bukspyttkjertelvev fra en modifisert kirurgisk protokoll ekstrahert umiddelbart etter å ha blitt nedsenket i RNA stabiliseringsreagens. Lane 7 viser integriteten til RNA hentet fra 20-30 mg vev fra en modifisert kirurgisk protokoll etter 48 timer nedsenking i en RNA stabilisering reagens ved -80 °C. Lane 8 viser integriteten til RNA hentet fra 20-30 mg vev fra en modifisert kirurgisk protokoll etter 24 timer nedsenking i en RNA stabilisering reagens ved -80 °C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I molekylærbiologi er det viktig å oppnå RNA av høy kvalitet. Tilstedeværelsen av ribonukle enzymer i celler og vev forringer raskt RNA og gjør ekstraksjonskomplekset. RNases er stabile enzymer som fungerer uten noen samtidige faktorer. Små mengder RNase er tilstrekkelig til å ødelegge RNA. Når rottepanasittvevet fjernes fra bukhulen, er det nødvendig å desinfisere kirurgiske instrumentene ved sterke vaskemidler, skyll dem grundig og legg dem i en ovn i minst 4 timer ved 240 °C for å inaktivere RNases før operasjonen. Gitt det faktum at RNase-nivået er ekstremt høyt i bukspyttkjertelen, steriliseres operasjonsstedet med NaOH og mild blekemiddel for å deaktivere RNases. Mens bukspyttkjertelvev blir fjernet under disseksjon, vil RNA forringes. For å øke effektiviteten, er det nødvendig for disseksjon å bli fullført så raskt som mulig20,21,22,23,24.
Bukspyttkjertelen er et kritisk vev for kroppens homeostatiske mekanismer. Derfor hjelper forbedrede pankreas RNA-ekstraksjonsprosedyrer forskerne med å forstå aktive veier bedre. Den nåværende protokollen foreslo en modell for en effektiv, enkel og optimalisert metode for RNA-ekstraksjon fra bukspyttkjertelen. Ulike vanlige RNA-ekstraksjonsmetoder fra bukspyttkjertelvev ble evaluert. Det var konsentrert om effekten av frossen lagring og RNase hemming strategier påvirker RNA kvalitet. De to viktigste faktorene som påvirker integriteten til RNA er kirurgi varighet og mengden av samlet bukspyttkjertelvev. Nyere studier har vist at det er en positiv sammenheng mellom RNA nedbrytning og mengden bukspyttkjertelvev8,13,20.
I denne protokollen ble 20-30 mg bukspyttkjertelvev oppnådd på mindre enn 2 minutter fra bedøvede rotter. Lange kirurgiske skritt kan føre til aktivering av endogene endonukleer i bukspyttkjertelen og forringe RNA raskt. I denne studien ble RNA isolert fra forskjellige prøver med guanidiniumthiocyanat, og fenolklorformekstraksjonsteknikker brukte flytende nitrogen for å hindre RNA-aktivitet. Metoden oppnådde tre mål: rask gjennomtrering av RNA stabiliseringsreagens i bukspyttkjertelvev, beskyttelse av cellulær RNA og økt bevaringstid. Resultatene var optimale når prøvene som inneholdt RNA stabiliseringsreagens ble holdt ved -80 °C i 24 timer.
RNA-integriteten økte imidlertid betydelig når RNA-stabiliseringsreagens ble introdusert. Videre var denne prosessen reproduserbar. En liten del av bukspyttkjertelen (20-30 mg) ble dissekert under operasjonen fra bedøvet rotter og nedsenket i 1 ml RNA stabiliseringsreagens ved -80 °C i 1-2 dager. Som sett i kjørefelt 8, lagring for 24 h var den optimale tiden.
De nevnte metodene tillot en mindre mengde RNA stabiliseringsreagens å trenge inn i orgelet. Videre avviklet nedbrytningsprosessen kort tid etter forsøkene fordi størrelsen på brikkene dissekert var liten. I denne protokollen er det viktige trinnet å kutte det nedsenkede vevet i RNA stabiliseringsreagens til svært små biter så snart som mulig til det trenger inn i cellene og undertrykker aktivering av RNase. I homogeniseringstrinnet er det svært avgjørende å forhindre bobleproduksjon i RNA-ekstraksjonsreagensen og utføre alle trinnene ved 4 °C. Det er avgjørende å skille vannfasen (fasen som inneholder RNA) svært nøye for å unngå DNA-kontaminering. Selv om autolyse og tilstedeværelsen av endogene RNases kompromiss intakt RNA isolasjon fra rotte bukspyttkjertelen, integriteten til RNA ble opprettholdt i den foreslåtte bukspyttkjertelen perfusjonsmetode. Dermed er den foreslåtte metoden en enkel, reproduserbar og billig prosedyre som krever mindre mengder RNA stabiliseringsreagens enn de andre eksisterende metodene.
Som enhver studie har denne protokollen noen begrensninger. For det første er integriteten og utbyttet av oppnådd RNA mindre enn å bruke hele bukspyttkjertelvev, da bare 20-30 mg vev brukes. For det andre kan ikke et stort antall prøver tas på én dag fordi RNA-ekstraksjon og også cDNA-syntesetester må gjøres raskt og etter hverandre for å redusere RNA-nedbrytning. For det tredje, for å utføre forskningsprosjekter med forskjellige rottegrupper, er det viktig å ta nøyaktig 20-30 mg vev fra samme kirurgiske område for å redusere variasjonen av data fordi rottepanasittvev sprer seg helt i bukhulen.
For å konkludere, ved hjelp av RNA ekstraksjon reagens løsning etter RNA stabilisering reagens perfusjon er et godt alternativ til dyre og kolonnebaserte RNA ekstraksjon kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen erklærte.
Acknowledgments
Den nåværende studien ble økonomisk støttet av Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Vi takker Mr. Zomorodian og Mr. Rostami ved Institutt for e-læring i medisinske vitenskaper, Virtual School og Center of Excellence i e-læring, Shiraz University of Medical Sciences for redigering av videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J.
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
