Summary
La purezza e l'integrità dell'RNA isolato è un passo vitale nei saggi dipendenti dall'RNA. Qui, presentiamo un metodo pratico, rapido ed economico per estrarre l'RNA da una piccola quantità di tessuto pancreatico non danneggiato.
Abstract
Indipendentemente dal metodo di estrazione, l'estrazione ottimizzata dell'RNA dei tessuti e delle linee cellulari viene effettuata in quattro fasi: 1) omogeneizzazione, 2) denaturazione efficace delle proteine da RNA, 3) inattivazione della ribonuclea e 4) rimozione della contaminazione da DNA, proteine e carboidrati. Tuttavia, è molto laborioso mantenere l'integrità dell'RNA quando ci sono alti livelli di RNase nel tessuto. L'autolisi spontanea rende molto difficile estrarre l'RNA dal tessuto pancreatico senza danneggiarlo. Pertanto, è necessario un metodo pratico di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dei tessuti pancreatici durante il processo di estrazione. Uno studio sperimentale e comparativo dei protocolli esistenti è stato effettuato ottenendo 20-30 mg di tessuti pancreatici di ratto in meno di 2 minuti ed estraendo l'RNA. I risultati sono stati valutati per elettroforesi. Gli esperimenti sono stati effettuati tre volte per la generalizzazione dei risultati. Immergere il tessuto pancreatico nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 24 h ha prodotto RNA ad alta integrità, quando il reagente di estrazione dell'RNA è stato utilizzato come reagente. I risultati ottenuti sono stati paragonabili ai risultati ottenuti da kit commerciali con attacchi di colonna di spin.
Introduction
I dati genetici strutturali possono essere trascritti in un prodotto funzionale attraverso l'espressione genica. L'analisi dell'RNA viene utilizzata per scoprire le differenze nell'espressione genica in diverse condizioni. Ci sono una serie di metodi per estrarre gli acidi nucleici come segue: guanidinium thiocyanate, estrazione tramite fenolo-cloroformio, cromatografia a base di cellulosa, estrazione da matrici di silice e scambio dianioni 1,2.
La corretta rilevazione dell'espressione genica è influenzata dall'integrità dell'RNA isolato dai tessuti; pertanto, è fondamentale valutare l'integrità dell'RNA isolato dai tessuti prima che vengono effettuati ulteriori test perché test molecolari complementari su RNA di bassa qualità possono compromettere i risultati dell'applicazione diagnostica. Pertanto, l'RNA ad alta integrità è necessario per i test biologici molecolari con diverse applicazioni diagnostiche: RT-PCR quantitativo, micro-array, analisi della protezione della ribonucleasi, analisi delle macchie settentrionali, mappatura dell'RNA e costruzione della libreria cDNA3,4.
L'RNA diventa piuttosto instabile dopo essere stato tenuto a lungo. Frammenti di mRNA lunghi oltre 10 kb sono particolarmente suscettibili alla degradazione5,6. Pertanto, i ricercatori devono considerare vari fattori che influenzano l'integrità dell'RNA purificato. La purezza dell'RNA deve essere protetta da RNases, proteine, DNA genomico e contaminazione da inibitori enzimatici. Inoltre, il miglior e accettabile rapporto di assorbimento tra RNA e UV (260/280) deve essere compreso nell'intervallo di 1,8-2,0 con frammentazione minima sull'elettroforesi. Tecniche di laboratorio sviluppate di recente hanno permesso agli scienziati di valutare l'integrità del campione di analisi molecolarepiù praticamente 7,8.
È molto più difficile estrarre l'RNA non danneggiato dal tessuto pancreatico rispetto ad altri tipi di tessuti a causa dell'elevata quantità di ribonucleasi (RNases). Tuttavia, i metodi di estrazione esistenti, vale a dire la rapida espulsione del tessuto pancreatico dalla cavità addominale e l'omogeneizzazione a basse temperature per ostacolare le RNases, si sono dimostrati inefficaci7,8,9,10,11,12,13,14.
Lo scopo dell'attuale studio sperimentale comparativo è quello di modificare e confrontare i metodi esistenti per determinare i metodi più efficienti. A tal fine, vari protocolli di estrazione dell'RNA sono stati modificati e confrontati. Era specificamente finalizzato a determinare il metodo meno costoso che richiede una quantità minima di tessuto pancreatico.
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Protocol
L'approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dalla Shiraz University of Medical Sciences (numero di approvazione: 93-01-01-7178-03-07-2014).
NOTA: Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250 g. Posizionare la fiala contenente una scheggia di tessuto pancreatico immerso nel reagente stabilizzante dell'RNA in un serbatoio di azoto liquido a -80 gradi centigradi e utilizzare la soluzione del reagente di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dell'RNA.
1. Rimozione del tessuto pancreatico ratto
- Preparare la sala operatoria e posizionare tutti i materiali necessari sotto il cofano.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (dressing forceps, forceps Brown-Adson, forbici Iris e forbici Littler) in forno per almeno 4 h a 240 gradi centigradi per inattivare RNases15. Sterilizzare la superficie del luogo di chirurgia con 70% di alcol sotto il cofano.
- Iniettare chetamina/xylazina intraperitonealmente utilizzando una siringa insulina [80/8 mg/kg]. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi del ratto per una mancanza di risposta.
- Aggiungere 1 mL di reagente di stabilizzazione dell'RNA nel microtubo corretto (2 mL) per inibire l'attivazione delle endonucleasi nei tessuti azizzati.
- Posizionare immediatamente il ratto sulla tavola chirurgica (allontanarsi dal chirurgo) per un'incisione a media linea.
- Sterilizzare l'intera superficie addominale con il 70% di alcol e rimuovere i capelli di ratto utilizzando un tagliacapello con #40 lame.
- Fai un'incisione a forma di V per aprire l'addome dall'area pubica alle zampe anteriori con le forbici Dressing, le forcepi Brown-Adson, le forbici Iris e le forbici Littler.
- Capovolgere gli organi addominali sul lato sinistro per esporre il pancreas. Trova con attenzione il tessuto pancreatico, che si diffonde nella cavità addominale. Individuare l'area sotto la milza per trovare il pancreas senza essere confuso con il tessuto adiposo.
- Rimuovere immediatamente 20-30 mg di pancreas dalla cavità addominale in meno di 2 min. Mettere rapidamente il tessuto rimosso nel microtubo da 2 mL e tagliarlo con una fresa sterile per penetrare i tessuti separati con il reagente di stabilizzazione dell'RNA.
- Posizionare il microtubo in un serbatoio di azoto per congelare immediatamente. Conservare il microtubo in un congelatore a -80 gradi centigradi per 24 h16.
- Dopo 24 h, trasferire i piccoli pezzi di tessuti pancreatici in un contenitore di ghiaccio.
- Iniettare cloruro di potassio (KCl) intracardially per l'eutanasia dei ratti dopo l'intervento chirurgico.
2. Estrazione dell'RNA
- Sterilizzare la superficie sotto il cofano con 70% di alcol.
- Mettere 1 mL del reagente di estrazione dell'RNA, che contiene il diocianio di guanidinio per inibire RNase, nel microtubo sterile.
- Trasferire il tessuto pancreatico separato nel microtubo. Trasferire il microtubo nell'azoto liquido per congelare immediatamente.
- Omogeneizzare il tessuto con il sonicatore della sonda a micro punta a 4 gradi centigradi impostato al livello 20 per 60 s on e 5 s off.
- Incubare ogni campione omogeneizzato per 5 minuti a 4 gradi centigradi utilizzando ghiaccio tritato per consentire ai complessi di nucleoproteina di essere completamente dissociati.
- Arricchire i campioni con 0,2 mL di cloroformio per ogni 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA. Stringere saldamente il tubo e agitarlo con forza per 15 s.
- Incubare il tubo per 15 minuti sul ghiaccio tritato (4 gradi centigradi) per separare il reagente in tre fasi.
- Eseguire la centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 2 -8 . Trasferire la fase aques incolore in un nuovo microtubo.
- Aggiungere 0,5 mL del 100% isopropanolo alla fase aque. Chiudere il tubo e invertire almeno 3 volte per mescolare accuratamente l'RNA.
- Incubare il campione per 5-10 min su una scatola fredda (4 gradi centigradi) per consentire la precipitazione dell'RNA.
- Eseguire la centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 2 -8 . Scarta il supernatant.
- Arricchire ciascuno dei tubi centrifuga con 1 mL del 75% di etanolo.
- Lavare il pellet dell'RNA invertendo il tubo almeno 3 volte.
- Eseguire la centrifuga a 7.500 x g a 2-8 dollari per 5 min. Scartare il supernatant per rimuovere l'etanolo in eccesso dal pellet dell'RNA mediante l'essiccazione dell'aria.
- Sospendere nuovamente il pellet di RNA in acqua libera da diethylpyrocarbonate (DEPC) trattata senza RNase.
- Passare la soluzione attraverso una punta di pipetta più volte per sciogliere il pellet di RNA. Quindi, incubare la soluzione per 10-15 min a 65 dollari.
3. Valutazione dell'integrità dell'RNA con elettroforesi denaturazione
- Preparare il buffer di esecuzione del gel: 50 mM NaAc (DEPC trattato) e 0,5 M EDTA (pH 8.0) in H2O trattato da DEPC.
- Preparare 5x formaldeide gel-running buffer (buffer di esecuzione MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Sciogliere 20,6 g di MOPS in 800 mL di DEPC trattati con acetato di sodio da 50 mM. Regolare il pH a 7,0 con 2 N NaOH. Aggiungere 10 mL di DEPC-trattato 0.5 M EDTA (pH 8.0). Regolare il volume della soluzione a 1 L con acqua trattata DEPC.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 m e tenerla a temperatura ambiente lontano dalla luce per motivi di sterilizzazione. Il buffer diventa giallo con il tempo se è esposto alla luce o è autoclaved. Un buffer color paglia funziona bene, ma quelli più scuri non17.
- Preparare un gel di agarose18. Per 50 mL, aggiungere 0,75 g di agarose e 31 mL di H2O. Microonde la soluzione nel microonde per 1 min. Aggiungere 9 mL di formaldeide e 10 mL di buffer in esecuzione MOPS 5x.
- Preparare i campioni per il gel. Mescolare quanto segue in un tubo di microfugio sterile:
RNA X L (fino a 30 g)
2 L di buffer di caricamento gel 5x
10 L di formamide
4 L di buffer di esecuzione MOPS
1 L di 0,1 mg/mL EtBr
3 L di formaldeide 5-x L di DEPC-H2O - Incubare i campioni a 65 gradi centigradi per 15 minuti e raffreddarli sul ghiaccio. Centrifuga per 5 s fino a quando tutto il fluido viene depositato.
- Pre-eseguire il gel a 5 V/cm per 5 minuti.
- Caricare immediatamente i campioni nelle corsie del gel e poi immergere il gel in un tampone di gel di formaldeide 1x. Eseguire a 3-4 V/cm19.
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Representative Results
Valutazione dell'integrità dell'RNA nel reagente di estrazione dell'RNA secondo un protocollo chirurgico di routine e modificato senza reagente di stabilizzazione dell'RNA
Dopo l'estrazione dell'RNA sono state osservate bande inaccettabili con il reagente di estrazione dell'RNA da un protocollo chirurgico di routine. La corsia 1 mostra l'RNA dal fegato come controllo. La corsia 2 mostra lo stato degradato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenuto da un protocollo chirurgico di routine. Quando la quantità di tessuto pancreatico è stata ridotta a 50 mg (corsia 3) o 20-30 mg (corsia 4) e l'intervento è stato eseguito immediatamente (protocollo modificato) senza il reagente di stabilizzazione dell'RNA, la separazione dell'RNA ha avuto meno successo rispetto al controllo del tessuto epatico e sono state osservate bande non specifiche.
Valutazione dell'integrità dei campioni di RNA secondo un protocollo chirurgico modificato immerso nel reagente di stabilizzazione dell'RNA
L'integrità degli RNA prodotti con il reagente di estrazione dell'RNA dipende dal tempo di conservazione e dalla temperatura (corsia 5-8). Rispetto al tessuto epatico di controllo, la separazione dell'RNA non ha avuto successo quando la quantità di tessuto pancreatico era di 50 mg (corsia 5) o 20-30 mg (corsia 6). L'RNA è stato estratto subito dopo che il tessuto è stato immerso nel reagente di stabilizzazione dell'RNA. Non è stata osservata alcuna banda specifica quando 20-30 mg di tessuto sono stati sommersi nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 48 h e l'RNA è stato estratto in base al protocollo. Secondo i risultati dell'elettroforesi, l'RNA era completamente degradato (corsia 7). Come raffigurato nella corsia 8, sono state osservate bande accettabili (28S/18S rRNA) dopo aver sommerso 20-30 mg di tessuto pancreatico nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 24 h, e poi è stato estratto l'RNA.
Figura 1: Valutazione dell'integrità dell'RNA isolata dai tessuti pancreatici del ratto utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA secondo i protocolli oggetto dell'indagine. La corsia 1 raffigura l'integrità dell'RNA ottenuta dal fegato come controllo. La corsia 2 rappresenta lo stato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenuto da un protocollo chirurgico di routine. La corsia 3 rappresenta lo stato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenuto da un protocollo chirurgico modificato e 50 mg di tessuto. La corsia 4 rappresenta lo stato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenute da un protocollo chirurgico modificato e 20-30 mg di tessuto. La corsia 5 rappresenta lo stato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenute da un protocollo chirurgico modificato e 50 mg di tessuto estratto subito dopo essere stati immersi nel reagente di stabilizzazione dell'RNA. La corsia 6 mostra l'integrità dell'RNA ottenuto da 20-30 mg di tessuto pancreatico da un protocollo chirurgico modificato estratto immediatamente dopo essere stato immerso nel reagente di stabilizzazione dell'RNA. La corsia 7 rappresenta l'integrità dell'RNA ottenuto da 20-30 mg di tessuto da un protocollo chirurgico modificato dopo 48 h di immersione in un reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi. La corsia 8 rappresenta l'integrità dell'RNA ottenuto da 20-30 mg di tessuto da un protocollo chirurgico modificato dopo 24 h di immersione in un reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi.
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Discussion
Nella biologia molecolare è fondamentale ottenere RNA di alta qualità. La presenza degli enzimi ribonucleasi nelle cellule e nei tessuti degrada rapidamente l'RNA e rende l'estrazione complessa. Le rule sono enzimi stabili che funzionano senza co-fattori. Piccole quantità di RNase sono adeguate per distruggere l'RNA. Quando il tessuto pancreatico del ratto viene rimosso dalla cavità addominale, è necessario disinfettare gli strumenti chirurgici con detergenti forti, sciacquarli accuratamente e metterli in forno per almeno 4 h a 240 gradi centigradi per inattivare le RNas prima dell'intervento chirurgico. Dato che il livello di RNase è estremamente alto nel pancreas, il luogo di chirurgia è sterilizzato con NaOH e candeggina lieve per disattivare le RNases. Mentre il tessuto pancreatico viene rimosso durante la dissezione, l'RNA si degrada. Per aumentare l'efficienza, è necessario che la dissezione venga completata il più rapidamentepossibile 20,21,22,23,24.
Il pancreas è un tessuto critico per i meccanismi omeostatici del corpo. Di conseguenza, una migliore procedura di estrazione dell'RNA pancreatico aiuta i ricercatori a comprendere meglio i percorsi attivi. Il presente protocollo proponeva un modello per un metodo efficiente, semplice e ottimizzato per l'estrazione dell'RNA dal pancreas. Sono stati valutati diversi metodi comuni di estrazione dell'RNA dal tessuto pancreatico. Si è concentrato sull'effetto dello stoccaggio congelato e sulle strategie di inibizione RNase che influenzano la qualità dell'RNA. I due fattori più significativi che influenzano l'integrità dell'RNA sono la durata della chirurgia e la quantità di tessuto pancreatico raccolto. Recenti studi hanno rivelato che esiste una correlazione positiva tra la degradazione dell'RNA e la quantità di tessuto pancreatico8,13,20.
In questo protocollo, 20-30 mg di tessuto pancreatico è stato ottenuto in meno di 2 min dai ratti anestetizzati. Lunghi passaggi chirurgici possono portare all'attivazione di endonucleasi endogene nel pancreas e degradare rapidamente l'RNA. In questo studio, l'RNA è stato isolato da diversi campioni con guanidinio tiocyanato, e le tecniche di estrazione fenolo-cloroformio utilizzato azoto liquido per ostacolare l'attività di RNA. Il metodo ha raggiunto tre obiettivi: la rapida permeazione del reagente di stabilizzazione dell'RNA nei tessuti pancreatici, la protezione dell'RNA cellulare e un aumento del tempo di conservazione. I risultati sono stati ottimali quando i campioni contenenti reagente di stabilizzazione dell'RNA sono stati conservati a -80 gradi centigradi per 24 h.
Tuttavia, l'integrità dell'RNA è aumentata in modo significativo quando è stato introdotto il reagente di stabilizzazione dell'RNA. Inoltre, questo processo è stato riproducibile. Una piccola sezione del pancreas (20-30 mg) è stata sezionata durante l'intervento chirurgico da ratti anetizzati e sommersa in 1 mL di reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 1-2 giorni. Come si vede nella corsia 8, lo stoccaggio per 24 h è stato il momento ottimale.
I suddetti metodi hanno permesso a una minore quantità di reagente di stabilizzazione dell'RNA di penetrare nell'organo. Inoltre, il processo di degradazione interrotto poco dopo gli esperimenti perché le dimensioni dei pezzi sezionati erano piccole. In questo protocollo, il passo fondamentale è tagliare il tessuto immerso nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a pezzi molto piccoli il più presto possibile fino a quando non penetra nelle cellule e sopprime l'attivazione di RNase. Nella fase omogeneizzante, è molto importante prevenire la produzione di bolle nel reagente di estrazione dell'RNA ed eseguire tutte le fasi a 4 gradi centigradi. È fondamentale separare la fase acqua (la fase contenente l'RNA) con molta attenzione per evitare la contaminazione del DNA. Anche se l'autolisi e la presenza di RNases endogeno compromettono l'isolamento intatto dell'RNA dal pancreas del ratto, l'integrità dell'RNA è stata mantenuta nel metodo di perfusione del pancreas proposto. Pertanto, il metodo proposto è una procedura semplice, riproducibile ed economica che richiede quantità minori di reagente di stabilizzazione dell'RNA rispetto agli altri metodi esistenti.
Come ogni studio, questo protocollo ha alcune limitazioni. In primo luogo, l'integrità e la resa dell'RNA ottenuto è inferiore rispetto all'utilizzo di tessuto pancreatico intero come solo 20-30 mg di tessuto viene utilizzato. In secondo luogo, un gran numero di campioni non può essere prelevato in un giorno perché l'estrazione dell'RNA e anche i test di sintesi cDNA devono essere eseguiti velocemente e consecutivamente per ridurre la degradazione dell'RNA. In terzo luogo, per eseguire progetti di ricerca con diversi gruppi di ratti, è essenziale prendere esattamente 20-30 mg di tessuto dalla stessa area chirurgica per diminuire la variazione dei dati perché il tessuto pancreatico ratto si diffonde completamente nella cavità peritoneale.
Per concludere, l'utilizzo della soluzione di reagente di estrazione dell'RNA dopo la perfusione del reagente di stabilizzazione dell'RNA è una buona alternativa ai costosi kit di estrazione dell'RNA a colonne.
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Disclosures
Nessuno dichiarato.
Acknowledgments
Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dalla Shiraz University of Medical Sciences (Grant No. Ringraziamo il Sig. Eomorodian e il Sig. Rostami presso il Dipartimento di e-Learning in Scienze Mediche, Scuola Virtuale e Centro di Eccellenza in e-Learning, Università di Scienze Mediche di Shiraz per la modifica del video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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