Summary
Renhet och integritet av den isolerade RNA är ett viktigt steg i RNA beroende analyser. Här presenterar vi en praktisk, snabb och billig metod för att extrahera RNA från en liten mängd oskadad bukspottskörtelvävnad.
Abstract
Oavsett utvinningsmetoden, optimerad RNA utvinning av vävnader och cellinjer utförs i fyra steg: 1) homogenisering, 2) effektiv denaturering av proteiner från RNA, 3) ribonukleas inaktivering, och 4) avlägsnande av kontaminering från DNA, proteiner, och kolhydrater. Det är dock mycket mödosamt att upprätthålla integriteten hos RNA när det finns höga nivåer av RNase i vävnaden. Spontan autolys gör det mycket svårt att extrahera RNA från bukspottskörteln vävnad utan att skada den. Således behövs en praktisk RNA-extraktionsmetod för att upprätthålla integriteten hos bukspottskörtelvävnader under extraktionsprocessen. En experimentell och jämförande studie av befintliga protokoll genomfördes genom att erhålla 20-30 mg av råtta bukspottskörteln vävnader på mindre än 2 minuter och extrahera RNA. Resultaten bedömdes med elektrofores. Experimenten utfördes tre gånger för generalisering av resultaten. Nedsänkning bukspottskörteln vävnad i RNA stabilisering reagens vid -80 °C för 24 h gav hög integritet RNA, när RNA extraktion reagens användes som reagens. De erhållna resultaten var jämförbara med de resultat som erhållits från kommersiella kit med spinnkolumnbindningar.
Introduction
Strukturella gendata kan transkriberas till en funktionell produkt genom genuttryck. RNA-analys används för att upptäcka skillnader i genuttryck över olika förhållanden. Det finns ett antal metoder för att extrahera nukleinsyror enligt följande: guanidiniumtiocyanat, extraktion via fenol-kloroform, cellulosabaserad kromatografi, extraktion genom kiseldioxidmatriser, och anjon-utbyte1,2.
Korrekt detektion av genuttryck påverkas av integriteten hos RNA som isolerats från vävnader; därför är det livsviktigt att utvärdera integriteten hos RNA som isolerats från vävnader innan ytterligare tester genomförs eftersom kompletterande molekylära tester på RNA av låg kvalitet kan äventyra diagnostiska applikationsresultat. Således är hög integritet RNA behövs för molekylärbiologiska tester med olika diagnostiska tillämpningar: kvantitativa RT-PCR, mikro-arrayer, ribonukleas skydd assay, norra blot analys, RNA-mappning, och cDNA bibliotekkonstruktion 3,4.
RNA blir ganska instabilt efter att ha hållits länge. Långa mRNA-fragment över 10 kb är särskilt känsliga för nedbrytning5,6. Således måste forskare överväga olika faktorer som påverkar integriteten hos renat RNA. Renheten hos RNA måste skyddas mot RNaser, proteiner, genomiskt DNA, och enzymatisk hämmar kontaminering. Dessutom måste det bästa och acceptabla absorptionsförhållandet för RNA till UV (260/280) ligga inom intervallet 1,8-2,0 med minsta fragmentering över elektrofores. Nyligen utvecklade laboratorietekniker har gjort det möjligt för forskare att utvärdera integriteten hos molekylär analysprov mer praktiskt7,8.
Det är mycket svårare att extrahera oskadade RNA från bukspottskörteln vävnad än andra typer av vävnader på grund av den höga mängden av ribonukleases (RNases). Dock har befintliga extraktionsmetoder, nämligen den snabba utskjutningen av bukspottskörteln vävnad från bukhålan och homogenisering vid låga temperaturer för att hindra RNases, visat sigvara ineffektiva 7,8,9,10,11,12,13,14.
Syftet med den föreliggande jämförande experimentella studien är att modifiera och jämföra befintliga metoder för att bestämma de mest effektiva metoderna. För detta ändamål ändrades och jämfördes olika protokoll för RNA-utvinning. Det var särskilt syftar till att fastställa den billigaste metoden kräver en minsta mängd bukspottskörteln vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt godkännande för denna studie erhölls från Shiraz University of Medical Sciences (Godkännandenummer: 93-01-01-7178\03-07-2014). approval
OBS: Använd handjur Sprague–Dawley råttor som väger 250 g. Placera injektionsflaskan som innehåller en flisa av bukspottskörtelns vävnad nedsänkt i RNA-stabiliserande reagens i en tank för flytande kväve vid -80 °C och använd RNA-utvinningsreagenslösning för att upprätthålla RNA:s integritet.
1. Avlägsnande av råttpanspottkörtelvävnaden
- Förbered operationssalen och placera alla erforderliga material under huven.
- Sterilisera alla kirurgiska instrument (Dressing-tång, Brun-Adson-tång, Iris sax och Littler-sax) i en ugn i minst 4 h vid 240 °C för att inaktivera RNases15. Sterilisera ytan av kirurgi plats med 70% alkohol under huven.
- Injicera ketamin/xylazin intraperitoneally med hjälp av en insulinspruta [80/8 mg/kg]. Kontrollera anestesidjupet genom att nypa råttans tår för en brist på svar.
- Tillsätt 1 mL RNA-stabiliseringsreagens i rätt mikrorör (2 mL) för att hämma aktivering av endonukleaser i strukna vävnader.
- Placera omedelbart råttan på operationskortet (huvudet bort från kirurgen) för ett medelstrecksansion.
- Sterilisera hela bukytan med 70% alkohol och ta bort råtthår med hjälp av en hårklippare med #40 blad.
- Gör ett V-form snitt för att öppna buken från blygdområdet till frambenen med Dressing-tämpningar, Brown-Adson-forceps, Iris-sax och Littler-sax.
- Vänd bukorganen till vänster sida för att exponera bukspottkörteln. Hitta försiktigt bukspottskörteln vävnad, som sprider sig i bukhålan. Lokalisera området under mjälte för att hitta bukspottkörteln utan att förväxlas med fettvävnaden.
- Omedelbart ta bort 20-30 mg bukspottkörtel från bukhålan på mindre än 2 min. Sätt den borttagna vävnaden i 2 mL mikroröret snabbt och skär den med en steril fräs för att tränga igenom de separerade vävnaderna med RNA-stabiliseringsreagens.
- Placera mikroröret i en kvävetank för att frysa omedelbart. Förvara mikroröret i en -80 °C frys i 24 h16.
- Efter 24 h överför du de små bitarna av bukspottskörtelns vävnader till en isbehållare.
- Injicera kaliumklorid (KCl) intracardially för dödshjälp av råttor efter operation.
2. RNA-utvinning
- Sterilisera ytan under huven med 70% alkohol.
- Sätt 1 mL av RNA-utvinningsreagensen, som innehåller guanidiniumtiocyanat för att hämma RNase, i det sterila mikroröret.
- Överför den separerade bukspottskörteln vävnad till mikroröret. Överför mikroröret till det flytande kvävet för att frysa omedelbart.
- Homogenisera vävnaden med mikrospetssondens ljudiker vid 4 °C inställd på nivå 20 för 60 s på och 5 s av.
- Inkubera varje homogeniserat prov i 5 min vid 4 °C med hjälp av krossad is för att låta nukleoproteinkomplexen vara helt dissocierade.
- Berika proverna med 0,2 mL kloroform för varje 1 mL RNA-utvinningsreagens. Kapa röret ordentligt och skaka det kraftfullt i 15 s.
- Inkubera röret i 15 min på den krossade isen (4 °C) för att separera reagensen i tre faser.
- Kör centrifugen i 12 000 x g i 15 min vid +2 till +8 °C. Överför den färglösa vattenfasen till ett nytt mikrorör.
- Tillsätt 0,5 mL av 100% isopropanol till vattenfasen. Stäng röret och sedan invertera det minst 3 gånger för att blanda RNA noggrant.
- Inkubera provet i 5-10 min på en kall låda (4 °C) för att möjliggöra RNA-nederbörd.
- Kör centrifugen i 12 000 x g i 15 min vid +2 till +8 °C. Kassera supernatanten.
- Berika vart och ett av centrifugeringsrören med 1 mL på 75% etanol.
- Tvätta RNA-pelleten genom att vända röret inåt minst 3 gånger.
- Kör centrifugen vid 7 500 x g vid +2 till +8 °C i 5 min. Kassera supernatanten för att avlägsna överskottet av etanol från RNA-pelleten genom lufttorkning.
- Åter upphäva RNA pelleten i diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat RNase-fritt vatten.
- För lösningen genom en pipettspets flera gånger för att lösa upp RNA-pelleten. Därefter, inkubera lösningen i 10-15 min vid +65 °C.
3. Utvärdera RNA Integrity med denatureringselektrofores
- Förbered gel körbuffert: 50 mM NaAc (DEPC-behandlad) och 0,5 M EDTA (pH 8,0) i DEPC-behandlad H2O.
- Förbered 5x formaldehyd gel-running buffert (MOPS körbuffert): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Lös upp 20,6 g MOPS i 800 mL DEPC-behandlat 50 mM natriumacetat. Justera pH-värdet till 7,0 med 2 N NaOH. Tillsätt 10 mL DEPC-behandlad 0,5 M EDTA (pH 8,0). Justera lösningens volym till 1 L med DEPC-behandlat vatten.
- Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm filter och håll den i rumstemperatur borta från ljus för steriliseringens skull. Bufferten blir gul med tiden om den utsätts för ljus eller autoklaveras. En halmfärgad buffert fungerar bra, men mörkare inte17.
- Förbered en 1,5% agarosgel18. För 50 mL, tillsätt 0,75 g agaros och 31 mL av H2O. Mikrovågsugn lösningen i mikrovågsugnen i 1 min. Lägg till 9 mL formaldehyd och 10 mL 5x MOPS kör buffert.
- Förbered proverna för gelen. Blanda följande i ett sterilt mikrofugeringsrör:
X μL RNA (upp till 30 μg)
2 μL av 5x gel-lastning buffert
10 μL av formamid
4 μL mops-körbuffert
1 μL av 0,1 mg/mL EtBr
3 μL formaldehyd 5-x μL av DEPC-H2O - Inkubera proverna vid 65 °C i 15 min och kyl dem på is. Centrifugera i 5 s tills all vätska är deponerad.
- Förkör gelen vid 5 V/cm i 5 minuter.
- Ladda proverna i gelens körfält omedelbart och lägg sedan ner gelen i 1x formaldehyd gel-kör buffert. Kör på 3-4 V/cm19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvärdering av RNA:s integritet i RNA-utvinningsreagensen enligt ett rutinmässigt och modifierat kirurgiskt protokoll utan RNA-stabiliseringsreagens
Oacceptabla band observerades efter extraktionen av RNA med RNA-extraktionsreagensen från ett rutinmässigt kirurgiskt protokoll. Lane 1 visar RNA från levern som en kontroll. Lane 2 visar den försämrade statusen för 28S/18S rRNA-band i totalt RNA som erhållits från ett rutinmässigt kirurgiskt protokoll. När mängden bukspottskörteln vävnad minskades till 50 mg (lane 3) eller 20-30 mg (lane 4) och operationen utfördes omedelbart (modifierat protokoll) utan RNA stabilisering reagens, RNA separation var mindre framgångsrik än i levern vävnad kontroll och ospecifika band observerades.
Utvärdering av integriteten hos RNA-prover enligt ett modifierat kirurgiskt protokoll som är nedsänkt i RNA-stabiliseringsreagens
Integriteten hos RNAs som produceras med RNA-utvinningsreagensen beror på konserveringstiden och -temperaturen (körfält 5-8). I jämförelse med kontrollen levervävnaden var RNA separation inte framgångsrik när mängden bukspottskörteln vävnad var 50 mg (lane 5) eller 20-30 mg (lane 6). RNA extraherades omedelbart efter vävnaden var nedsänkt i RNA stabilisering reagens. Inget specifikt band observerades när 20- 30 mg vävnad var nedsänkt i RNA-stabiliseringsreagens vid -80 °C för 48 h och RNA extraherades baserat på protokollet. Enligt elektroforesresultaten försämrades RNA:na helt (körfält 7). Som avbildas i körfält 8, var godtagbara band (28S/18S rRNA) observerades efter nedsänkt 20-30 mg bukspottskörteln vävnad i RNA stabilisering reagens vid -80 °C för 24 h, och sedan RNA extraherades.
Figur 1: Bedömning av RNA-systemets integritet som isolerats från vävnader i råttpanspottskörteln med hjälp av RNA-utvinningsreagens enligt protokollen under undersökningen. Lane 1 skildrar integriteten hos RNA som erhållits från levern som en kontroll. Lane 2 representerar status 28S/18S rRNA band i totalt RNA erhålls från en rutinmässig kirurgiska protokoll. Lane 3 representerar status för 28S/18S rRNA-band i totalt RNA som erhållits från ett modifierat kirurgiskt protokoll och 50 mg vävnad. Lane 4 representerar status för 28S/18S rRNA-band i totalt RNA som erhållits från ett modifierat kirurgiskt protokoll och 20-30 mg vävnad. Lane 5 representerar status för 28S/18S rRNA-band i totalt RNA som erhållits från ett modifierat kirurgiskt protokoll och 50 mg vävnad som extraheras omedelbart efter att ha varit nedsänkt i reagens för RNA-stabilisering. Lane 6 visar integriteten hos RNA som erhållits från 20-30 mg bukspottskörteln vävnad från en modifierad kirurgiska protokoll extraheras omedelbart efter att vara nedsänkt i RNA stabilisering reagens. Lane 7 skildrar integriteten hos RNA som erhållits från 20–30 mg vävnad från ett modifierat kirurgiskt protokoll efter 48 h nedsänkning i ett reagens för RNA-stabilisering vid -80 °C. Lane 8 skildrar integriteten hos RNA som erhållits från 20-30 mg vävnad från ett modifierat kirurgiskt protokoll efter 24 h nedsänkning i ett reagens för RNA-stabilisering vid -80 °C. Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inom molekylärbiologi är det livsviktigt att få RNA av hög kvalitet. Förekomsten av ribonukleasenzymerna i celler och vävnader försämrar snabbt RNA och gör extraktionen komplex. RNaser är stabila enzymer fungerar utan några co-faktorer. Små mängder av RNase är tillräckliga för att förstöra RNA. När råttpanspottskörtelns vävnad avlägsnas från bukhålan är det nödvändigt att desinficera de kirurgiska instrumenten genom starka rengöringsmedel, skölj dem noggrant och lägg dem i en ugn i minst 4 h vid 240 °C för att inaktivera RNases före operation. Med tanke på att RNase-nivån är extremt hög i bukspottkörteln, är platsen för kirurgi steriliseras med NaOH och milt blekmedel för att avaktivera RNaserna. Medan bukspottskörteln vävnad tas bort under dissekering, RNA skulle försämras. För att öka effektiviteten är det nödvändigt att dissektionen slutförs så snabbt som möjligt20,21,22,23,24.
Bukspottkörteln är en kritisk vävnad för kroppens homeostatiska mekanismer. Därför, förbättrad bukspottskörteln RNA extraktion förfaranden hjälpa forskare att bättre förstå aktiva vägar. Det föreliggande protokollet föreslog en modell för en effektiv, enkel och optimerad metod för RNA-utvinning från bukspottkörteln. Olika vanliga RNA extraktion metoder från bukspottskörteln vävnad utvärderades. Det var koncentrerat på effekten av fryst lagring och RNase hämning strategier påverka RNA kvalitet. De två mest betydande faktorer som påverkar integriteten hos RNA är kirurgi varaktighet och mängden samlade bukspottskörteln vävnad. Nyligen genomförda studier har visat att det finns en positiv korrelation mellan RNA nedbrytning och mängden pankreasvävnad8,13,20.
I detta protokoll erhölls 20-30 mg bukspottskörteln vävnad i mindre än 2 min från de sövda råttor. Långa kirurgiska steg kan leda till aktivering av endogena endonucleases i bukspottkörteln och försämrar RNA snabbt. I denna studie isolerades RNA från olika prover med guanidiniumtiocyanat, och fenol-kloroform utvinning tekniker används flytande kväve för att hindra RNA verksamhet. Metoden uppnådde tre mål: snabb genomsläppning av RNA-stabiliseringsreagens i bukspottskörteln vävnader, skydd av cellulära RNA, och ökad bevarande tid. Resultaten var optimala när proverna som innehöll RNA-stabiliseringsreagens hölls vid -80 °C i 24 h.
RNA-integriteten ökade dock betydligt när reagens för RNA-stabilisering infördes. Dessutom var denna process reproducerbar. En liten del av bukspottkörteln (20-30 mg) var dissekeras under kirurgi från sövda råttor och nedsänkt i 1 mL av RNA stabiliserings reagens vid -80 ° C för 1-2 dagar. Som sett i körfält 8, lagring för 24 h var den optimala tiden.
De tidigare nämnda metoderna tillät en mindre mängd RNA-stabiliseringsreagens att tränga in i organet. Vidare avbröt nedbrytningsprocessen kort efter experimenten eftersom storleken på de bitar som dissekerades var liten. I detta protokoll är det vitala steget att skära den nedsänkta vävnaden i RNA-stabiliseringsreagens till mycket små bitar så snart som möjligt tills den tränger in i cellerna och dämpar aktiveringen av RNase. I det homogeniserande steget är det mycket avgörande att förhindra att man kan förhindra att det bildas en bubbelproduktion i RNA-extraktionsreagensen och utföra alla steg vid 4 °C. Det är avgörande att separera aquafasen (fasen som innehåller RNA) mycket noggrant för att undvika DNA-kontaminering. Även autolys och förekomsten av endogena RNases kompromiss intakt RNA isolering från råtta bukspottkörteln, integriteten hos RNA bibehölls i den föreslagna bukspottkörteln perfusion metod. Den föreslagna metoden är alltså ett okomplicerat, reproducerbart och billigt förfarande som kräver mindre mängder RNA-stabiliseringsreagens än de andra befintliga metoderna.
Liksom alla studier, har detta protokoll vissa begränsningar. För det första är integriteten och utbytet hos erhållet RNA mindre än att använda hela bukspottskörtelns vävnad eftersom endast 20-30 mg vävnad används. För det andra kan ett stort antal prover inte tas på en dag eftersom RNA-extraktion och även cDNA-syntestester måste göras snabbt och i följd för att minska RNA-nedbrytningen. För det tredje, att utföra forskningsprojekt med olika råtta grupper, är det viktigt att ta exakt 20-30 mg vävnad från samma kirurgiska område för att minska variation av data eftersom råtta bukspottskörteln vävnaden sprider sig helt i bukhinnan hålighet.
Att sluta sig till, med hjälp av RNA extraktion reagenslösning efter RNA stabilisering reagens perfusion är ett bra alternativ till dyra och kolumn-baserade RNA extraktion kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen deklarerad.
Acknowledgments
Den föreliggande studien stöddes ekonomiskt av Shiraz University of Medical Sciences (anslag nr 93-01-01-7178\03-07-2014). Vi tackar Mr Zomorodian och Mr Rostami vid institutionen för e-lärande i medicinska vetenskaper, Virtual School och Center of Excellence i e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences för redigering av video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
- McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
- Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
- Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
- Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
- Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
- Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
- Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
- Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
- Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
- Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
- Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
- Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J.
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
- Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
- Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
- Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
- Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
- Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).
