Summary
En främre genetisk skärm baserad på Ca2 + höjd som en avläsning leder till identifiering av genetiska komponenter som deltar i kalciumberoende signalering vägar i växter.
Abstract
Framåtgenetiska skärmar har varit viktiga verktyg för opartisk identifiering av genetiska komponenter som är involverade i flera biologiska vägar. Grunden för skärmen är att generera en mutant population som kan screenas med en fenotyp av intresse. EMS (etylmetaulfonat) är ett vanligt alkylerande medel för att inducera slumpmässig mutation i en klassisk framåt genetisk skärm för att identifiera flera gener som deltar i en viss process. Cytosoliskt kalcium (Ca2 +) höjd är en viktig tidig signalering väg som aktiveras vid stress perception. Men identiteten på receptorer, kanaler, pumpar och transportörer av Ca2 + är fortfarande svårfångade i många studiesystem. Aequorin är en cellulär kalcium reporter protein isolerat från Aequorea victoria och stabilt uttryckt i Arabidopsis. Utnyttja detta, utformade vi en framåt genetisk skärm där vi EMS-mutagenized aequorin transgena. Fröna från de muterade växterna samlades in (M1) och screening för fenotyp av intresse utfördes i segregerande (M2)befolkningen. Med hjälp av ett 96-väl hög genomströmningsprotokoll ca2 + mätprotokoll kan flera nya mutanter identifieras som har en varierande kalciumrespons och mäts i realtid. Mutanterna med fenotyp av intresse räddas och förökas tills en homozygous mutant växtpopulation erhålls. Detta protokoll ger en metod för framåt genetiska skärmar i Ca2 + reporter bakgrund och identifiera nya Ca2 + reglerade mål.
Introduction
En förändring i cytosoliskt kalcium (Ca2 +) koncentration vid uppfattning av biotiska eller abiotiska stimulans är en väl studerad tidig signalering händelse som aktiverar många signalering vägar1,2,3,4. En cell i sitt basala vilotillstånd upprätthåller en lägre Ca2 + koncentration i cytosol och bindare överskott Ca2 + i olika intracellulära organeller och extracellulära apoplast leder till en brant Ca2 + lutning5,6. Vid signaluppfattning, Ca2 + nivåer ökning av cytosol på grund av ett inflöde av Ca2 + från extracellulära och / eller intracellulära källor och generera en stimuli specifik kalcium signatur7,8,9. Ca2 + höjder i cytosolen aktiveras av många stimuli, men specificitet upprätthålls av distinkta butiker släppa Ca2 +, en unik Ca2 + signatur och lämpliga sensorproteiner10,11.
Användning av alkylerande medel, etyl-metansulfonat (EMS) för mutagenesis är ett kraftfullt verktyg i klassisk framåt genetiska skärmar för att identifiera flera oberoende gener som deltar i en process. EMS är en kemisk mutagen huvudsakligen inducera C till T och G till A övergångar slumpmässigt genomet och producerar en 1 bp förändring i varje 125 kb av arvsmassan. EMS mutagenesis kommer att inducera ≈1000 enda baspar förändringar, antingen insättning / borttagningar (InDel) eller enda nukleotid polymorfism (SNP) per genom12. EMS-inducerad mutationer är flera punkt mutationer med en mutation frekvens som sträcker sig från 1/300 till 1/30000 per locus. Detta minskar antalet M1 växter som behövs för att hitta en mutation i en viss gen. En M1 utsäde befolkningsintervall på 2000-3000 används vanligtvis för att få mutationer av intresse i Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgena är Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ekotyp växter uttrycker p35S-apoaequorin (pMAQ2) i cytosol15. Aequorin är ett Ca2+ bindande protein bestående av apoprotein och en protesgrupp bestående av luciferinmolekyl, coelenterazine. Bindningen av Ca2 + till aequorin, som har tre Ca2 + bindande EF-händer platser, resulterar i coelenterazine oxideras och cyklas för att ge dioxetanon mellanliggande, följt av en konformationell förändring av proteinet tillsammans med utsläpp av koldioxid och singlet-upphetsad coelenteramide16. Den coelenteramid som produceras på detta sätt avger ett blått ljus (λmax, 470 nm) som kan detekteras av luminometern17. Den extremt snabba Ca2 + höjder kan därmed mätas i realtid, och utnyttjas för snabb framåt genetiska skärmar. Detta protokoll syftar till att använda specificiteten av kalcium svar för att identifiera nya nyckelaktörer som är inblandade i Ca2 + signatur. För att uppnå denna uppgift använder vi EMS mutagenesis i transgena aequorin och identifiera SNPs i samband med förändrad Ca2 + signalering. Protokollet identifierar mutanter som inte visar några eller minskade Ca2 + höjder vid stimuli tillägg. Dessa mutanter kan sedan kartläggas för att identifiera de gener som är ansvariga för Ca2+ svaret. Metoden är tillämplig på alla typer av flytande stimuli i växter som resulterar i en Ca2 + höjd. Eftersom Ca2 + höjd är en av de första svaren i anläggningen försvar signalering väg, identifiering av uppströms responskomponenter kan ge kandidater för genteknik för att utveckla motståndskraftiga växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EMS mutagenesis och enda stamtavla-baserade utsäde samling (1-3 månader)
- Väg 150 mg frön (~ 7500) av aequorin för EMS mutagenesis (M0 frön). Väg ytterligare 150 mg frön som ska användas som kontroll.
- Överför fröna till ett 50 ml-rör och tillsätt 25 ml 0,2 % EMS (v/v) (VARNING) (för behandling) eller 25 ml autoklaverat vatten (för kontroll).
OBS: Etyl-metansulfonat är ett kemiskt medel för mutageniserande växtmaterial. - Försegla röret med parafilm och linda in det i aluminiumfolie. Rotera röret änd-over-end i 18 timmar vid rumstemperatur.
- Låt fröna att bosätta sig. Ta försiktigt bort EMS-lösningen och kassera i en avfallsbehållare som innehåller 1 M NaOH i lika stora mängder (NaOH hjälper till att neutralisera/inaktivera EMS vilket gör det säkert att kassera). Kassera de använda plastartiklarna i en 1 M NaOH-lösning.
OBS: Efter 24 h, kassera kasseras enligt farligt material laboratoriemetoder. - Tvätta mutageniserade frön noggrant med 40 ml autoklaverat vatten minst 8 gånger. Kassera EMS som innehåller vatten i en NaOH-avfallsbehållare enligt ovan.
- För den slutliga tvätten, tillsätt 40 ml 100 mM natriumtiosulfat och skölj 3 gånger för att avlägsna spår av EMS.
- Blötlägg fröna i 40 ml autoklaverat vatten för ~ 1 h att sprida EMS ur frön och sedan placera dem på filterpapper tills helt torr.
- Överför fröna till ett mikrocentrifugrör och stratifiera fröna vid 4 °C i 40 ml autoklaverat vatten i 2-4 dagar. Detta bidrar till att bryta utsäde dvala och säkerställer homogen tillväxt.
- Överför både mutageniserade frön (M0) och kontrollfrön på jord (jordsammansättning: agropet: jordrit, 1:1) och överför dem till tillväxtrum med en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod, en ljusintensitet på 150 μmol∙m−2∙s −1 och ~70% relativ fuktighet.
- För att avgöra om mutagenesen var framgångsrik, leta efter minskad grobarhet hastighet och planta tillväxt, och klorofyllsektoriär 18 (Figur 1A). Jämför mutagenized växter till kontroll växter för att identifiera dessa fysiologiska och utvecklingsmässiga skillnader.
OBS: Olika metoder kan användas för att skörda frön från M1 växter. I detta protokoll har vi använt den enda stamtavla-baserade utsäde insamling metod. Varje M1-anläggning får ett unikt nummer, från A1 till A3500. - Underhåll individuellt numrerade växter som diskreta anläggningslinjer (figur 1B).
- Vid mognad, skörda frön från dessa enskilda muterade växter och lagra som enskilda M1-linjer (figur 2). Från den enda stamtavla-baserade utsäde samling, fick vi cirka 5000 M1 rader varav 3500 M1 linjer visades.
2. Hög genomströmning screening för att välja mutanter (8 månader)
- Identifiera nya mutanter baserat på Ca2 + svar på en utvald stimulans. Här använde vi H2O2 som exempel.
- För att identifiera mutanter, skärm M2 generationen. Eftersom Recessiva mutanter segregera vid 1/8 frekvens i M2 generation på EMS mutagenesis14, screening av 8-12 M2-segregerandeväxter täcker en M1 linje och identifierar en homozygous Recessiv mutant (med 12 plantor ökar sannolikheten för att hitta en mutant). Från varje oberoende M1-linje, testa 12 M2 plantor för Ca2+ svar på H2O2 (12 M2 plantor per M1 linje).
- Använd en hög genomströmning utsäde sterilisering och hydroponiska växttillväxt protokoll19. Placera nästan 12-15 M2 frön per M1 linje i enskilda brunnar av en 24-brunn vävnad kultur platta och sterilisera med klorgas (40 ml 12% natriumhypoklorit och saltsyra, 3:1, v / v) i en exsickator för 4 h i en fumhuva. Efter ingreppet, öppna exsickatorn och lämna över natten för klorgas att avdunsta.
- Efter sterilisering, ta plattor utanför och tillsätt vätska 1/2 MS media (halvstyrka MS utan agar) till enskilda brunnar. Försegla plattorna med parafilm och stratifiera fröna i 2-4 dagar vid 4 °C och flytta sedan frön till en tillväxtkammare med 10 h ljus/ 14 h mörk fotoperiod vid 20-22 °C med 70% relativ luftfuktighet.
- När plantorna är 8-12 dagar gamla, placera 12 M2 plantor från varje linje individuellt i en 96-brunns luminometerplatta. För mätning av Ca2+ svar på H2O2,använd en luminometerplattas läsare.
- Tillsätt 150 μl coelentrazinlösning på 150 μM coelentrazine efter plantanöverföring (utspädd i autoklaverat vatten från ett 5 ml-lager i metanol) (VARNING) i enskilda brunnar i ett mörkt/svagt ljusområde och förvaras i mörker vid 21 °C i 8 timmar.
OBS: Coelentrazine är en protesgrupp som binder till apo-aequorin och rekonstruerar den till funktionell aequorin. Coelentrazine är ljuskänslig och lagras därför i mörka flaskor, skyddade från ljus. - Nästa dag, utföra mutantskärm med 10 mM H2O2 som en stimulans och mäta den efterföljande Ca2 + svar.
- För samtidig mätning av 24 brunnar, skapa ett automatiserat kinetiskt program som mäter bakgrunden i 1 min, följt av stimuli addition (40 μL) och mätning i 10 min, följt av total aequorinurladdning (2 M CaCl2 i 150 μL 20% etanol) i 1-2 min.
OBS: En sluturladdning för det totala aequorin behövs för att kvantifiera den uppmätta Ca2+ och som ytterligare kontroll för funktionellt aequorin. Sluturladdningen är en kort körning på 1-2 min och orsakar inte betydande växtdöd. Alternativt, om växterna dör efter urladdning steg, sedan åter skärmen den specifika M1 linje och räddning utan utsläpp. Sådana mutanter kan bekräftas i M3 och M4 generationer med hjälp av urladdningssteget. - Använd en 24-brunnsformatskanningsmetod som mäter varje rad med 7 s intervall med 300 ms integrationstid per brunn per mätpunkt. Använd en vildliknande planta som kontroll i varje rad för jämförelse och utvärdering av mutanten.
OBS: En enda 96 brunnsplatta som innehåller M2 plantor täcker 8 individuella M1-linjen (8 M1 *12=96 M2) och kan avskärmas i 2,5 timmar och varje dag skulle 32 M1 linjer screenas, 640 M1 växter per månad. Hela screening förfarandet efter växterna är klara skulle ta cirka 8 månader. - Identifiera mutanter baserat på förlust av eller minskat Ca2+ svar med H2O2. Rädda de utvalda mutanterna genom en antibiotikabaserad tvättprocess. Tvätta plantorna med 25 mg/L cefotaximelösning två gånger och överför sedan till räddningsmedium som innehåller 25 mg/L cefotaxime i 1/2 MS agar.
- Odla plattorna med en 10 h ljus/ 14 h mörk fotoperiod för att få en mutantanläggning. Cefotaxime tvätt hjälper till att ta bort skadliga mikroorganismer på plantorna. Eftersom plantorna efter rekonstituering hålls oförseglade, minimera kontaminering vid överföring tillbaka till sterilt tillstånd.
- Överför den muterade växten till jorden för att erhålla den homozygous M3 befolkningen.
3. Dataanalys och mutantidentifiering (1-3 månader)
OBS: Avläsningarna från ovanstående metod är i relativa ljusenheter (RLU).
- För beräkning av [Ca2+]cytkoncentration, använd följande koncentrationsekvation20.
pCa = 0,332588(−log (L/Lmax)) + 5,5593
Luminescence räknas () och totalt återstående antal (max). - Konvertera de erhållna pCa-värdena till [Ca2+]cytvärden i μM genom att multiplicera med 106. Sedan grafiskt tomt mot en aequorin (transgen Col-0 aequorin) kontroll för att identifiera förmodade H2O2 mutanter till Ca2 + svar.
- Räddningsplantor som visar en förlust av eller minskat svar på H2O2 ansökan räddade.
- Vid mognad, skörda frön från den räddade mutanten och åter skärmen för svar på H2O2 i M3 plantor. Om alla 12 M3 plantor visar en Ca2 + svar som liknar moderväxten, anser befolkningen vara en homozygous M3 mutantpopulation. Om alla 12 plantor inte visar ett sådant svar, ta dem sedan till M4 generation och åter skärmen för att få homozygous befolkning.
- När en homozygous växtlinje har erhållits, identifiera genen leder till förändrad fenotyp med hjälp av nästa generations sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EMS-populationen kontrollerades för H2O2 inducerad Ca2 + höjd. Som diskuterats tidigare, 12 enskilda M2 plantor visades från varje M1 linje. I figur 3ritas en sådan M1-linje med varje panel som visar 12 individuella M2-plantor. Ett vildtypsaquorin används som kontroll för att jämföra och utvärdera mutantsvaret. En recessiv mutant segregnar i förhållandet 1:7 (mutant: icke mutant). Vid screening av 12 individuella plantor per M1-linje, kan vi identifiera 1 eller 2 mutanter per linje. Vi har identifierat 2 förmodade mutanter från 12 M2 plantor (figur 3). Dessa mutanter vidare tas till M3 och M4 och en homozygous population genereras. Den homozygous mutanten kartläggs vidare för att identifiera den kausala genen.
Figur 1: EMS mutagenized Arabidopsis. (A)För att fastställa en framgångsrik EMS mutagenenes, letade vi efter klorofyllsektoriärer i mutagenized växtpopulationen (indikeras med pil). Statistiskt sett måste 0,1 till 1 % av M1-anläggningarna uppvisa klorotiska sektorer. (B)Individuell krukväxt av M1 växter gjordes för att utföra en enda stamtavla-baserade utsäde samling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En schematisk representation av den främre genetiska skärmen metodik. 7500 transgena Arabidopsis växter som uttrycker cytosoliska Aequorin (Aeq) i Kol-0 mutageniseras med etylmetansulfonat (EMS) i M0-generationen. Omkring 5000 plantor från M1 generation förökas individuellt med enstamtavla metod och förökas till M2 generation. 12 växter från varje M2 linje är screenas för fenotyp av intresse (ca 3000-3500 M1 rader). Mutant för fenotyp av intresse räddas och spridas till M3 generation och screening för homozygosity. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Identifiering av mutanter med förändrat svar på behandlingmed H2O2. En representativ figur för att avbilda mutantval från en enda segregerande M1-rad visas. Panelerna visar screeningresultatet (12 segregerande M2 plantor per enskild M1 linje) vid stimulering med 10 mM H2O2. WT (Aequorin) kontroll (grön linje), genomsnitt av alla 12 M2 plantor är medelvärdet svar (röd linje) och A1-X (svart linje) är enskilda plantor numrerade från 1-12. För varje diagram är y-axeln [Ca2+]cyt (μM) och x-axeln är tid (min). [Ca2+] beräknas från relativa ljusenheter.cyt levels were calculated from relative light units (RLUs). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS mutagenesis är ett kraftfullt verktyg för att generera mutationer i befolkningen. De klassiska genetiska skärmarna med EMS har varit ett effektivt verktyg för att identifiera nya gener av två viktiga skäl: för det första kräver de inga tidigare antaganden om genidentitet och för det andra inför de inga fördomar. Det finns flera metoder för att generera en screening populationer som EMS, T-DNA infogningar, strålning etc. Av alla metoder har EMS-baserad mutagenesis få fördelar jämfört med de andra metoderna. För det första är det lättare att generera en mutantpopulation genom exponering för EMS enligt beskrivningen i det nuvarande protokollet21,22. För det andra kan ett tillräckligt stort antal mutanta utsäde population genereras, som kan användas för flera skärmar för en eller flera stimuli. För det tredje kan en svag allel av en viktig gen som genereras på grund av en missense mutation identifieras. För det fjärde kan en rad genfunktionseffekter identifieras med hjälp av EMS-skärmen, inklusive fullständig förlust av funktion, partiell funktionsförlust, förändrad funktion och en konstituerande genfunktion. Det kan hjälpa till att identifiera dubbla mutanter som inte är möjligt med andra mutagenesis metoder23,24,25. Den enda stamtavla baserad M1 utsäde samling som används i detta protokoll är också fördelaktigt eftersom det tillåter en att gå tillbaka till moderbefolkningen för att identifiera samma mutant igen, om avkomman går förlorad i de kommande kommande generationerna. Det ger möjlighet att återvinna mutationer som är infertila när homozygous och kan återvinnas via heterozygous syskon av mutanta växter. För det andra garanterar denna strategi oberoendet för alla mutanter som isolerats jämfört med sammanslagning av frön i M1-generationen. Det säkerställer att mutationer isolerade från M2 samlingen är olika alleler på samma locus snarare än samma mutationshändelse26.
De gener som identifieras genom EMS mutagenesis skärmar är beroende av fenotyp som används för screening befolkningen. Ju snabbare fenotyp av intresse kan screenas, desto lättare är att identifiera nya vägar. Ca2 + är en allestädes närvarande sekundär budbärare som är bland de första signalering kaskader som ska aktiveras. Det fungerar som en medlare för växt svar mot ett brett spektrum av biotiska och abiotiska stimuli. Dessutom kan kalcium reporter aequorin lokaliseras till olika subcellulära fack och organeller27,28,29. Detta öppnar vägar för att identifiera roller av protein lokaliserade i dessa delar i kalcium responsdynamik30,,31,32.
Framåt genetiska skärmar baserade på EMS-mutagenesis i aequorin och använda Ca2 + som avläsningar har förblivit samtida sedan upptäckten. Fördelarna med denna metod har uppvägt fallgroparna. Få begränsningar av tekniken behöver dock fortfarande utvärderas noggrant. Skärmen är arbets- och tidsintensiv och kräver identifiering av muterade växter från en stor mutageniserad population. Därför måste detaljerad planering baserad på resurstillgänglighet, krav på arbetspersonal och utrymmesbegränsningar göras innan den experimentella planen påbörjas. Den andra stora utmaningen med aequorin-baserade Ca2 + skärmar är möjligheten till falska positiva utan ansvarsfrihet steg. Därför ingår ett mycket kort utsläppssteg i protokollet. Slumpmässiga mutationer kan också leda till generering av sterila växter som inte kan räddas på grund av flera mutationer. För det tredje är Ca2 + signatur mycket vävnadsspecifik och konsekvens i screening måste säkerställas4.
Inte många framåt genetiska skärmar har identifierat receptorer, kanaler, pumpar och transportörer av Ca2 + som användning av Ca2 + som en screening fenotyp i framåt genetik var sällsynt. Stimuli (t.ex. H2O2) inducerad Ca2 + höjd används som markör för en framåt genetisk skärm i vår metodik, för att identifiera nya genetiska komponenter som deltar i processen. En liknande strategi med EMS mutagenized aequorin befolkningen har lett till upptäckten av många receptorer som DORN1 som är eATP receptor33, kalciumkanal OSCA34, LORE-receptorn som deltar i lipopolysackarid avkänning35 och ribonuclease PARN136. En färsk studie publicerad av Wu et al. har använt en mycket liknande metod för screening EMS-mutagenized aequorin växter på H2O2 elicitation för att identifiera den nya väteperoxid sensorn HPCA137. Därav protokollet med EMS mutagenesis i Ca2 + reporter bakgrund är en lovande metod för nya genupptäckt inblandade i stimuli avkänning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility för växttillväxt, Bombay Locale för videoinspelning, och Institutionen för bioteknik- eLibrary Consortium för att ge tillgång till e-resurser. Detta arbete stöddes av Institutionen för bioteknik, Indien genom National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; och CSIR-Junior Research Fellowship (till D.M och S.M) och Institutionen för bioteknik-Junior Research Fellowship (till R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
