Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

Summary

تؤدي الشاشة الجينية الأمامية المستندة إلى ارتفاع Ca2+ كمطالعة إلى تحديد المكونات الوراثية المشاركة في مسارات الإشارة المعتمدة على الكالسيوم في النباتات.

Abstract

وكانت الشاشات الجينية الأمامية أدوات هامة في تحديد المكونات الجينية التي تنطوي عليها عدة مسارات بيولوجية غير متحيزة. أساس الشاشة هو توليد السكان المتحولين التي يمكن فحصها مع النمط الظاهري من الفائدة. EMS (سلفونات الميثان الإيثيلي) هو عامل الألكيلات الشائع الاستخدام لتحفيز الطفرة العشوائية في شاشة جينية أمامية كلاسيكية لتحديد جينات متعددة تشارك في أي عملية معينة. السيتوسوليك الكالسيوم (كاليفورنيا2+) ارتفاع هو مفتاح في وقت مبكر من مسار الإشارات التي يتم تنشيطها على الإدراك الإجهاد. ومع ذلك، فإن هوية المستقبلات والقنوات والمضخات وناقلات كاليفورنيا2+ لا تزال بعيدة المنال في العديد من أنظمة الدراسة. Aequorin هو بروتين مراسل الكالسيوم الخلوي المعزول من Aequorea فيكتوريا وsquly أعرب في arabidopsis. استغلال هذا، قمنا بتصميم شاشة الجينية إلى الأمام التي نحن EMS-mutagenized aequorin المعدلة وراثيا. جمعت البذور من النباتات متحولة ([م1و1و1') وفرز لل نوع ظاهريّة الفائدة كان نفذت في الفصل ([م2و2و2و2]." باستخدام بروتوكول قياس 96-77777777776-77766676-77766666766-7006، يمكن التعرف على العديد من المسوخ الجديدة التي لها استجابة مختلفة من الكالسيوم ويتم قياسها في الوقت الحقيقي.2+ يتم إنقاذ المسوخ مع النمط الظاهري من الفائدة ونشرها حتى يتم الحصول على سكان النباتات متحولة homozygous. يوفر هذا البروتوكول طريقة للشاشات الجينية الأمامية في Ca2+ خلفية مراسل وتحديد أهداف رواية Ca2+ المنظمة.

Introduction

وهناك تغيير في الكالسيوم السيتوسوليك (كاليفورنيا2 +) تركيز على إدراك من التحفيز الحيوي أو اللاأحيائي هو جيد درس مبكر إشارة الحدث الذي ينشط العديد من مسارات الإشارات1,2,3,4. وهناك خلية في حالته الراحة القاعدية يحافظ على أقل Ca2 + التركيز في السيتوسول وعزلات الزائد Ca2 + في مختلف العضيات داخل الخلايا وapoplast خارج الخلية مما يؤدي إلى حاد كاليفورنيا2 + التدرج5,6. عند إدراك الإشارة ، ترتفع مستويات Ca2+ في السيتوسول بسبب تدفق Ca2 + من مصادر خارج الخلية و / أو داخل الخلايا وتولد توقيع الكالسيوم محدد من المحفزات7،8،9. Ca2+ يتم تنشيط الارتفاعات في السيتوسول من قبل العديد من المحفزات، ولكن يتم الحفاظ على خصوصية من قبل مخازن متميزة الافراج عن كاليفورنيا2+، فريدة من نوعها كاليفورنيا2 + توقيع وبروتينات الاستشعار المناسبة10،11.

إن استخدام عامل الألكيلات، سلفونات الإيثيل-الميثان (EMS) في الطفرات الجينية هو أداة قوية في الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية لتحديد الجينات المستقلة المتعددة المشاركة في العملية. EMS هو مطفرة كيميائية في الغالب تحفيز C إلى T و G إلى A التحولات بشكل عشوائي في جميع أنحاء الجينوم وتنتج 1 BP تغيير في كل 125 كيلوبايت من الجينوم. سوف EMS الطفرات تحفز التغييراتدلفين 1000 قاعدة واحدة، إما الإدراج / الحذف (InDel) أو متعددة الأشكال النوكليوتيد واحد (SNP) لكل الجينوم12. الطفرات الناجمة عن EMS هي طفرات متعددة نقطة مع تردد طفرة تتراوح بين 1/300 إلى 1/30000 لكل مكان. وهذا يقلل من عدد النباتات M1 اللازمة للعثور على طفرة في جين معين. ويستخدم عادة مجموعة من السكان البذور M1 من 2000-3000 للحصول على طفرات من الاهتمام في Arabidopsis ثالينا13,14.

Aequorin هي aequorin transgenics arabidopsis Columbia-0 (Col-0) النباتات ecotype التي تعبر عن p35S-apoaequorin (pMAQ2) في cytosol15. أيكورين هو بروتين Ca2+ ملزم يتكون من أبوبروتين ومجموعة اصطناعية تتكون من جزيء لوسيفيرين، coelenterazine. إن ربط Ca2+ إلى aequorin ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع CA2 + ملزمة EF-hands ، يؤدي إلى coelenterazine يتم أكسدةه وcyclized لإعطاء dioxetanone الوسيط ، يليه تغيير في التشكل من البروتين مصحوبًا بإطلاق ثاني أكسيد الكربون وكويليناراميد وحيد متحمس16. coelenteramide حتى تنتج تنبعث منها الضوء الأزرق (λماكس، 470 نانومتر) التي يمكن الكشف عنها من قبل17luminometer. وهكذا يمكن قياس الارتفاعات Ca2+ السريعة للغاية في الوقت الفعلي، واستغلالها للشاشات الجينية السريعة إلى الأمام. يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام خصوصية استجابة الكالسيوم لتحديد اللاعبين الرئيسيين رواية التي تشارك في التوقيع Ca2+ . لتحقيق هذه المهمة، ونحن نستخدم EMS mutagenesis في aequorin المعدلة وراثيا وتحديد SNPs المرتبطة تغيير Ca2+ الإشارات. يحدد البروتوكول المسوخ التي لا تظهر أي ارتفاعات Ca2+ أو تخفضها عند إضافة المحفزات. ويمكن بعد ذلك تعيين هذه المسوخ لتحديد الجينات المسؤولة عن استجابة Ca2+ . الطريقة قابلة للتطبيق على أي نوع من المحفزات السائلة في النباتات التي تؤدي إلى ارتفاع كاليفورنيا2+ . منذ كاليفورنيا2 + الارتفاع هي واحدة من الاستجابات الأولى في مسار إشارة الدفاع النباتية، وتحديد مكونات استجابة المنبع يمكن أن توفر المرشحين للهندسة الوراثية لتطوير النباتات مرنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- تَمَتَّسُ تكوين نظم الإدارة البيئية وجمع البذور الأحادية النسب (1-3 أشهر)

  1. تزن 150 ملغ من البذور (~ 7500) من أيكورين لEMS mutagenesis (م0 البذور). تزن آخر 150 ملغ من البذور لاستخدامها كتحكم.
  2. نقل البذور إلى أنبوب 50 مل وإضافة 25 مل من 0.2٪ EMS (الخامس / الخامس) (تنبيه) (للعلاج) أو 25 مل من الماء autoclaved (للسيطرة).
    ملاحظة: سلفونات الإيثيل - الميثان هي عامل كيميائي في عملية التكاء في المواد النباتية.
  3. ختم الأنبوب مع parafilm والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم. قم بتدوير الأنبوب من النهاية إلى النهاية لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. السماح للبذور لتسوية. إزالة حل EMS بعناية والتخلص في حاوية النفايات التي تحتوي على 1 M NaOH في وحدات تخزين متساوية (NaOH يساعد على تحييد / تعطيل EMS مما يجعلها آمنة للتخلص). تجاهل البلاستيك المستخدمة في محلول 1 M NaOH.
    ملاحظة: بعد 24 ساعة، تخلص من المرتجعات وفقاً لممارسات مختبر المواد الخطرة.
  5. اغسل البذور المُمَتَمَّعة تمامًا مع 40 مل من الماء المُقلَد ذاتيًا 8 مرات على الأقل. تخلص EMS تحتوي على المياه في حاوية نفايات NAOH كما ذكر أعلاه.
  6. لغسل النهائي، إضافة 40 مل من 100 mM ثيوسلفات الصوديوم وشطف 3 مرات لإزالة آثار EMS.
  7. نقع البذور في 40 مل من الماء autoclaved ل ~ 1 ح لنشر EMS من البذور ومن ثم وضعها على ورقة مرشح حتى يجف تماما.
  8. نقل البذور إلى أنبوب microcentrifuge وطبقة البذور في 4 درجة مئوية في 40 مل من المياه autoclaved لمدة 2-4 أيام. وهذا يساعد في كسر النوم البذور ويضمن النمو متجانسة.
  9. نقل كل من البذور المطفرة (M0)والبذور التحكم على التربة (تكوين التربة: الزراعية: تربة، 1:1) ونقلها إلى غرف النمو مع 16 ساعة ضوء/ 8 ساعة ضوئية داكنة، وكثافة خفيفة من 150 ميكرومول •m−2•s −1 و ~ 70٪ الرطوبة النسبية.
  10. لتحديد ما إذا كان الطفرات قد نجحت، ابحث عن انخفاض سرعة الإنبات ونمو الشتلات، وقطاع الكلوروفير18 (الشكل 1A). قارن النباتات المطفرة مع النباتات التحكم لتحديد هذه الاختلافات الفسيولوجية والتنموية.
    ملاحظة: يمكن استخدام طرق مختلفة لحصاد البذور من النباتات M1. في هذا البروتوكول، استخدمنا أسلوب تجميع البذور أحادي النسب المستندة. كل مصنع M1 يعطى رقما فريدا، بدءا من A1 إلى A3500.
  11. الحفاظ على النباتات المرقمة بشكل فردي كلخطوط نباتية منفصلة (الشكل 1B).
  12. عند النضج، حصاد البذور من هذه النباتات متحولة الفردية وتخزينها على النحو الفردية خطوط M1 (الشكل 2). من مجموعة البذور على أساس نسب واحد، حصلنا على حوالي 5000 M1 خطوط من الذي تم فحص 3500 M1 خطوط.

2. فحص عالي الإنتاجية لتحديد المسوخ (8 أشهر)

  1. تحديد المسوخ الجديدة على أساس استجابة Ca2+ إلى حافز مختار. هنا، استخدمنا H2O2 كمثال.
  2. لتحديد المسوخ، قم بفحص الجيل M2. منذ المسوخ المتنحية فصل في 1/8 تردد في M2 جيل على EMS mutagenesis14، فحص 8-12 M2- تغطي النباتات الفصل واحد M1 خط ويحدد متحولة متجانسة homozygous (باستخدام 12 شتلة يزيد من احتمال العثور على متحولة). من كل خط M1 مستقل، اختبار 12 M2 الشتلات لCa2+ استجابة لH2O2 (12 M2 الشتلات لكل خط M1).
  3. استخدام عالية الإنتاجية التعقيم البذور والزراعة المائية بروتوكول نمو النباتات19. ضع ما يقرب من 12-15 M2 البذور لكل M1 خط في الآبار الفردية من 24 بئرا النسيج لوحة الثقافة وتعقيم باستخدام غاز الكلور (40 مل من 12٪ هيبوكلوريت الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، 3:1، v / الخامس) في desiccator لمدة 4 ساعة في غطاء الدخان. بعد الإجراء، افتحي جهاز الـ 1000 واتركيه بين عشية وضحاها ليتبخر غاز الكلور.
  4. بعد التعقيم، وجلب لوحات خارج وإضافة السائل 1/2 وسائل الإعلام MS (MS نصف قوة دون أجار) إلى الآبار الفردية. ختم لوحات مع parafilm وطبقات البذور لمدة 2-4 أيام في 4 °C ثم نقل البذور إلى غرفة النمو مع 10 ساعة خفيفة / 14 ساعة photoperiod الظلام في 20-22 درجة مئوية مع 70٪ الرطوبة النسبية.
  5. مرة واحدة الشتلات هي 8-12 يوما من العمر، مكان 12 M2 الشتلات من كل خط على حدة في لوحة مضيئة 96-جيدا. لقياس استجابة Ca2+ إلى H2O2، استخدم قارئ لوحة مضيئة.
  6. بعد نقل الشتلات، إضافة 150 ميكرولتر من 5-10 ميكرومتر محلول coelentrazine (المخفف في الماء المذاب من مخزون 5 mM في الميثانول) (تنبيه) في الآبار الفردية في منطقة مظلمة / منخفضة الإضاءة وتخزينها في الظلام في 21 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
    ملاحظة: Coelentrazine هي مجموعة اصطناعية تربط بـ apo-aequorin وتُعيد تشكيلها إلى الأيكورين الوظيفي. Coelentrazine هو ضوء حساس ومن ثم يتم تخزينها في زجاجات داكنة اللون، محمية من الضوء.
  7. في اليوم التالي، قم بأداء شاشة متحولة باستخدام 10 mM H2O2 كحافز وقياس استجابة Ca2+ اللاحقة.
  8. وللت وقياس 24 بئرًا في وقت واحد، أنشئ برنامجًا حركيًا آليًا يقيس الخلفية لمدة دقيقة، يليه إضافة منبهات (40 ميكرولتر) وقياس 10 دقائق، يليه إجمالي تصريف الـequorin (2 M CaCl2 في 150 ميكرولتر 20٪ إيثانول) لمدة 1-2 دقيقة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى التفريغ النهائي للـ aequorin الكلي لتحديد كمية درجة Ca2+ المقاسة والتحكم الإضافي للـ aequorin الوظيفية. التفريغ نهاية قصيرة من 1-2 دقيقة ولا يسبب وفاة النبات كبيرة. بدلا من ذلك، إذا كانت النباتات تموت بعد خطوة التفريغ، ثم إعادة فرز خط M1 محددة والإنقاذ دون تفريغ. ويمكن تأكيد هذه المسوخ في M3 و M4 الأجيال باستخدام خطوة التفريغ.
  9. استخدم طريقة مسح بتنسيق 24 بئرًا تقيس كل صف في فاصل زمني 7 s مع وقت تكامل 300 مللي ثانية لكل نقطة قياس. استخدام شتلة من نوع البرية كتحكم في كل صف للمقارنة والتقييم من متحولة.
    ملاحظة: ستغطي 96 بئرًا واحدة تحتوي على شتلات M2 8 خط M1 فردي (8 M1*12 = 96 M2)ويمكن فحصها في 2.5 ساعة وسيتم فحص 32 M1 خطوط في اليوم ، 640 M1 محطات في الشهر. يستغرق إجراء الفحص بالكامل بعد أن تصبح النباتات جاهزة حوالي 8 أشهر.
  10. تحديد المسوخ على أساس فقدان أو انخفاض استجابة كاليفورنيا2+ مع H2O2. إنقاذ المسوخ المختارة من خلال عملية غسل تعتمد على المضادات الحيوية. غسل الشتلات مع 25 ملغ / L محلول cefotaxime مرتين ثم نقل إلى وسط الإنقاذ الذي يحتوي على 25 ملغ / لتر cefotaxime في 1/2 MS agar.
  11. تنمو لوحات في ضوء 10 ساعة / 14 ساعة photoperiod الظلام للحصول على نبات متحولة. غسل cefotaxime يساعد على إزالة أي الكائنات الحية الدقيقة الضارة على الشتلات. منذ يتم الاحتفاظ بالشتلات بعد إعادة تشكيل غير مختومة، والحد من التلوث عند نقل مرة أخرى إلى حالة معقمة.
  12. نقل النبات متحولة إلى التربة للحصول على homozygous M3 السكان.

3 - تحليل البيانات وتحديد الهوية المتحولة (شهر إلى ثلاثة أشهر)

ملاحظة: القراءات المقدمة من الأسلوب أعلاه في وحدات الضوء النسبي (RLU).

  1. لحساب [Ca2+] تركيزالسيّدات، استخدم معادلة التركيز التالية20.
    pCa = 0.332588(−log (L/Lكحد أقصى))+ 5.5593
    التلألؤ التهم () ومجموع عدد المتبقية (كحد أقصى).
  2. قم بتحويل قيم pCa التي تم الحصول عليها إلى [Ca2+]قيمcyt في μM عن طريق الضرب في 106. ثم مؤامرة بيانيا ضد aequorin (المعدلة وراثيا كول-0 aequorin) السيطرة على تحديد المفترض H2س2 المسوخ إلى Ca2 + الاستجابة.
  3. شتلات الإنقاذ التي تظهر فقدان أو انخفاض الاستجابة إلى H2O2 تم إنقاذها.
  4. عند النضج، حصاد البذور من متحولة إنقاذها وإعادة فرز للاستجابة لH2O2 في الشتلات M3. إذا كانت جميع الشتلات 12 M3 تظهر استجابة كاليفورنيا2 + مماثلة للنبات الأم، والنظر في السكان أن تكون متجانسة M3 السكان متحولة. إذا لم تظهر جميع الشتلات 12 مثل هذا الرد، ثم تأخذهم إلى الجيل M4 وإعادة الشاشة للحصول على السكان homozygous.
  5. بمجرد الحصول على خط نبات متماثل ، حدد الجين الذي يؤدي إلى النمط الظاهري المتغير باستخدام تسلسل الجيل التالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم فحص السكان EMS لH2O2 الناجمة عن ارتفاع كاليفورنيا2+ . وكما نوقش آنفاً، تم فحص 12 شتلة من M2 من كل خط M1. في الشكل 3، يتم رسم خط M1 واحد مع كل لوحة تظهر 12 شتلة M2 فردية. ويستخدم أيكورين البرية من نوع كتحكم في مقارنة وتقييم استجابة متحولة. المتحول المتنحية يفصل في نسبة 1:7 (متحولة: غير متحولة). عند فحص 12 شتلة فردية لكل خط M1 ، يمكننا تحديد 1 أو 2 طفرات لكل خط. لقد حددنا 2 المسوخ المفترضة من 12 M2 الشتلات (الشكل 3). وتؤخذ هذه المسوخ كذلك إلى M3 و M4 ويتم إنشاء السكان homozygous. يتم تعيين متحولة homozygous كذلك لتحديد الجين السببية.

Figure 1
الشكل 1: EMS مُطَّوع العرب. ( أ) لتحديد الطفرات EMS ناجحة، بحثنا عن القطاعات الكلورو في عدد النباتات المطفرة (المشار إليها بواسطة السهم). إحصائياً، 0.1 إلى 1% من مصانع M1 يجب أن تظهر قطاعات الكلوروتيك. (ب)تم إجراء بوتينغ الفردية من M1 النباتات لأداء مجموعة البذور على أساس نسب واحد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لمنهجية الشاشة الجينية إلى الأمام. 7500 النباتات أرابيدوبسيس المعدلة وراثيا التي تعبر عن ايكورين السيتوسوليك (أيك) في 0 Col-0 هي مُتَمَتَّة مع ميثيل الميثان (EMS) في الجيل M0. يتم نشر حوالي 5000 شتلة من الجيل M1 بشكل فردي باستخدام طريقة نسب مفرد ويتم نشرها إلى جيل M2. يتم فحص 12 مصنعًا من كل خط M2 للبحث عن النمط الظاهري للفائدة (حوالي 3000-3500 M1 خطوط). يتم إنقاذ متحولة للنمط الظاهري من الفائدة ونشرها إلى الجيل M3 وفحصها ل homozygosity. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد المسوخ مع استجابة معدلة للعلاج H2O2. يتم عرض شخصية تمثيلية لتصوير اختيار متحول من سطر M1 واحد منفصل. تظهر اللوحات نتيجة الفحص (12 شتلة M2 في كل سطر M1) على التحفيز مع 10 mM H2O2. WT (Aequorin) السيطرة (الخط الأخضر)، متوسط جميع 12 M2 الشتلات هو متوسط الاستجابة (الخط الأحمر) و A1-X (الخط الأسود) هي الشتلات الفردية المرقمة من 1-12. لكل رسم بياني، يكون المحور ص هو [Ca2+]cyt (μM) والمحور س هو الوقت (دقيقة). [كاليفورنيا2+] تم حساب مستويات السيت من وحدات الضوء النسبي (RLUs). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن الطفرات التي تُنتج في نظام الإدارة البيئية هي أداة قوية لتوليد الطفرات في عدد السكان. كانت الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية باستخدام نظام الإدارة البيئية أداة فعالة لتحديد الجينات الجديدة لسببين رئيسيين: أولاً، أنها لا تتطلب أي افتراضات مسبقة حول هوية الجينات، وثانياً، أنها لا تقدم أي تحيز. هناك عدة طرق لتوليد مجموعات فحص مثل EMS ، وإدخالات T-DNA ، والإشعاعات وما إلى ذلك. من بين جميع الطرق، فإن الطفرات القائمة على نظام الإدارة البيئية لديها مزايا قليلة على الطرق الأخرى. أولاً، من الأسهل توليد مجموعة من المتحولين عن طريق التعرض لـ EMS كما هو موضح في البروتوكول الحالي21،22. ثانياً، يمكن توليد عدد كبير بما فيه الكفاية من البذور المتحولة، والتي يمكن استخدامها لشاشات متعددة لحافز واحد أو أكثر. ثالثاً، يمكن تحديد أليل ضعيف من جين أساسي تم إنشاؤه بسبب طفرة الضياع. رابعاً، يمكن تحديد مجموعة من تأثيرات وظائف الجينات باستخدام شاشة EMS بما في ذلك فقدان الوظيفة بالكامل وفقدان الوظيفة الجزئية والوظيفة المعدلة ووظيفة الجينات المكونة. ويمكن أن تساعد في تحديد المسوخ المزدوجة التي لا يمكن أن يكون ممكنا من قبل أساليب الطفرات الأخرى23,24,25. إن مجموعة البذور M1 التي تستند إلى النسب الواحد والمستخدمة في هذا البروتوكول مفيدة أيضًا لأنها تسمح للمرء بالعودة إلى السكان الأم لتحديد نفس المتحول مرة أخرى ، إذا فقدت النسل في الأجيال المستقبلية اللاحقة. وهو يوفر إمكانية استرداد الطفرات التي تكون عقيمة عندما homozygous ويمكن استردادها عن طريق الأشقاء heterozygous من النباتات متحولة. ثانيا، هذه الاستراتيجية تضمن استقلال جميع المسوخ المعزولة بالمقارنة مع يستكثر من البذور في الجيلM 1. فإنه يضمن أن الطفرات المعزولة من مجموعة M2 هي أليل مختلفة في نفس مكان بدلا من نفس الحدث الطفرة26.

تعتمد الجينات التي تم تحديدها من خلال شاشات الطفرات EMS على النمط الظاهري المستخدم في فحص السكان. كلما كان من الممكن فحص النمط الظاهري للاهتمام بشكل أسرع ، كان من الأسهل تحديد مسارات جديدة. Ca2+ هو رسول ثانوي في كل مكان الذي هو من بين الشلالات الإشارات الأولى التي سيتم تفعيلها. وهو يعمل كوسيط للاستجابة النباتية ضد مجموعة واسعة من المحفزات الحيوية وغير الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون موضعية مراسل الكالسيوم aequorin إلى مختلف المقصورات شبه الخلوية والعضيات27،28،29. هذا يفتح السبل لتحديد أدوار البروتين المترجمة في هذه المقصورات في ديناميات استجابة الكالسيوم30،31،32.

الشاشات الجينية إلى الأمام على أساس EMS-mutagenesis في aequorin واستخدام Ca2+ كما أن قراءات ظلت معاصرة منذ اكتشافها. مزايا هذا الأسلوب تفوق المزالق. ومع ذلك، لا يزال هناك القليل من القيود المفروضة على هذه التقنية التي تحتاج إلى تقييم دقيق. الشاشة هي العمالة وتكد على الوقت وتتطلب تحديد النباتات المتحولة من مجموعة واسعة من السكان المطهرة. ومن ثم، يجب أن يتم التخطيط التفصيلي القائم على توافر الموارد، ومتطلبات العاملين في العمل، والقيود المتعلقة بالحيز، قبل الشروع في الخطة التجريبية. التحدي الرئيسي الثاني مع aequorin القائم على شاشات Ca2+ هو إمكانية إيجابية كاذبة دون خطوة التفريغ. وبالتالي يتم تضمين خطوة قصيرة جدا التفريغ في البروتوكول. يمكن أن تؤدي الطفرات العشوائية أيضًا إلى توليد نباتات معقمة لا يمكن إنقاذها بسبب طفرات متعددة. ثالثا، Ca2+ التوقيع هو حد عالية من الأنسجة محددة والاتساق في الفحص يجب ضمان4.

لم تحدد العديد من الشاشات الجينية إلى الأمام المستقبلات والقنوات والمضخات والناقلين من كاليفورنيا2 + كما كان من النادر استخدام Ca2 + كنمط ظاهري للفحص في علم الوراثة إلى الأمام. المحفزات (على سبيل المثال، H2O2) المستحثة Ca2+ الارتفاع يستخدم كعلامة لشاشة جينية إلى الأمام في منهجيتنا، لتحديد المكونات الوراثية الجديدة المشاركة في العملية. وقد أدت استراتيجية مماثلة باستخدام EMS المطهرة أيكورين السكان إلى اكتشاف العديد من المستقبلات مثل DORN1 وهو مستقبلات eATP33, قناة الكالسيوم OSCA34, مستقبلات LORE المشاركة في استشعار lipopolysaccharide35 وPARN136. وقد استخدمت دراسة حديثة نشرتها Wu وآخرون منهجية مشابهة جدا لفحص EMS-المغيرة للنباتات aequorin على H2O2 استثارة لتحديد رواية استشعار بيروكسيد الهيدروجين HPCA137. ومن هنا فإن البروتوكول باستخدام EMS mutagenesis في Ca2 + مراسل الخلفية هو وسيلة واعدة لاكتشاف الجينات رواية تشارك في الاستشعار عن المحفزات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح يعلنه.

Acknowledgments

نشكر المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي - مرفق Phytotron لنمو النبات ، وبومباي المحلية لتصوير الفيديو ، وإدارة التكنولوجيا الحيوية - eLibrary كونسورتيوم لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية. وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية، الهند من خلال المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي منحة الأساسية، ماكس بلانك Gesellschaft الهند شريك برنامج المجموعة; و CSIR-جونيور زمالة البحث (لD.M و S.M) وقسم التكنولوجيا الحيوية - زمالة البحوث المبتدئين (إلى R.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Jetbiofil 11024 for growing seedlings
96 well white cliniplate Thermo Scientific 9502887 for luminometer measurements
Aequorin
Agropet Lab Chem India for plant growth
Calcium chloride Fisher Scientific 12135 for discharge solution
Coelenterazine PJK 55779-48-1 prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate Sigma Aldrich M0880-5G for seed mutagenesis
Ethanol Analytical reagent 1170 for discharge solution
Hydrochloric acid Merck Life Sciences 1.93001.0521 sterlization solution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific 15465 as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent Thermo Scientific 5300172 aequorin luminescence measurement
MES buffer Himedia RM1128-100G plant growth
Murashige and skoog media Himedia PT021-25L plant growth
Sodium hydroxide Fisher Scientific 27805 for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite Merck Life Sciences 1.93607.5021 sterlization solution
Sodium thiosulfate Fisher Scientific 28005 for seed washing in step 1.6
soilrite Lab Chem India for plant growth
Square pots Lab Chem India for plant growth
Sucrose Sigma Aldrich S0389 plant growth
Taxim Alkem 7180720 for seedling rescue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 162، أيكورين، أربيدبسيس، إشارات الكالسيوم، EMS، شاشة جينية إلى الأمام
إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mittal, D., Mishra, S., Prajapati,… More

Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter