Summary
Un écran génétique avancé basé sur l’élévation de Ca2+ comme lecture conduit à l’identification des composants génétiques impliqués dans les voies de signalisation dépendantes du calcium dans les plantes.
Abstract
Les écrans génétiques avancés ont été des outils importants dans l’identification impartiale des composants génétiques impliqués dans plusieurs voies biologiques. La base de l’écran est de générer une population mutante qui peut être projeté avec un phénotype d’intérêt. Le SME (sulfonate de méthane éthylique) est un agent alcalinant couramment utilisé pour induire une mutation aléatoire dans un écran génétique avancé classique afin d’identifier plusieurs gènes impliqués dans un processus donné. L’élévation du calcium cytosolique (Ca2+) est une voie de signalisation précoce clé qui est activée lors de la perception du stress. Toutefois, l’identité des récepteurs, des canaux, des pompes et des transporteurs de Ca2+ est encore insaisissable dans de nombreux systèmes d’étude. L’aequorine est une protéine de journaliste de calcium cellulaire isolée d’Aequorea victoria et stablement exprimée dans l’Arabidopsis. En exploitant cela, nous avons conçu un écran génétique avancé dans lequel nous EMS-mutagationnized l’aequorin transgénique. Les graines des plantes mutantes ont été recueillies (M1) et le dépistage du phénotype d’intérêt a été effectué dans la population de ségrégation (M2). À l’aide d’un protocole de mesure Ca2+ de 96 puits, plusieurs nouveaux mutants peuvent être identifiés qui ont une réponse variable en calcium et sont mesurés en temps réel. Les mutants avec le phénotype d’intérêt sont sauvés et propagés jusqu’à ce qu’une population de plantes mutantes homozygotes soit obtenue. Ce protocole fournit une méthode pour les écrans génétiques avancés dans le contexte du journaliste Ca2+ et d’identifier les nouvelles cibles réglementées Ca2+ .
Introduction
Un changement dans la concentration de calcium cytosolic (Ca2+) sur la perception du stimulus biotique ou abiotique est un événement de signalisation précoce bien étudié qui active de nombreuses voies de signalisation1,2,3,4. Une cellule dans son état de repos basal maintient une concentration inférieure de Ca2+ dans le cytosol et séquestres excès de Ca2+ dans divers organites intracellulaires et apoplaste extracellulaire menant à un gradient raide de Ca2+ 5,6. Sur la perception du signal, les niveaux de Ca2+ augmentent dans le cytosol en raison d’un afflux de Ca2+ provenant de sources extracellulaires et/ou intracellulaires et génèrent une signature spécifique de calcium de stimuli7,8,9. Ca2+ élévations dans le cytosol sont activés par de nombreux stimuli, mais la spécificité est maintenue par des magasins distincts libérant Ca2 +, une signature unique Ca2 + et les protéines de capteur appropriée10,11.
L’utilisation d’un agent alkylating, le sulfonate d’éthyle-méthane (EMS) pour la mutagenèse est un outil puissant dans les écrans génétiques avant classiques pour identifier plusieurs gènes indépendants impliqués dans un processus. Ems est un mutagène chimique induisant principalement C à T et G à A transitions aléatoirement dans tout le génome et produit un changement de 1 pb dans chaque 125 kb du génome. La mutanéèse EMS entraînera 1000 changements de paires de base uniques, soit l’insertion/suppressions (InDel) soit le polymorphisme nucléotidique unique (SNP) par génome12. Les mutations induites par le SME sont des mutations à plusieurs points avec une fréquence de mutation allant de 1/300 à 1/30000 par locus. Cela réduit le nombre de plantes M1 nécessaires pour trouver une mutation dans un gène donné. Une gamme de population de semences M1 de 2000-3000 est généralement utilisée pour obtenir des mutations d’intérêt dans Arabidopsis thaliana13,14.
Les transgéniques d’Aequorin sont des plantes d’écotype Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) exprimant p35S-apoaequorine (pMAQ2) dans le cytosol15. L’aequorine est une protéine de liaison Ca2+ composée d’apoprotéine et d’un groupe prothétique composé de molécule de luciferine, coelenterazine. La liaison de Ca2+ à l’aequorin, qui a trois Ca2+ liant les sites de mains EF, a comme conséquence la coelenterazine étant oxydée et cyclisée pour donner la dioxétanone intermédiaire, suivie d’un changement conformational de la protéine accompagné par la libération de dioxyde de carbone et de coelenteramide singlet-excité16. Le coelentermine ainsi produit émet une lumière bleue (λmax, 470 nm) qui peut être détectée par le luminomètre17. Les altitudes extrêmement rapides de Ca2+ peuvent ainsi être mesurées en temps réel et exploitées pour des écrans génétiques avancés rapidement. Ce protocole vise à utiliser la spécificité de la réponse de calcium pour identifier les nouveaux acteurs clés qui sont impliqués dans la signature Ca2+. Pour réaliser cette tâche, nous utilisons la mutagène EMS dans l’aequorin transgénique et identifions les SNP associés à la signalisation Ca2+ modifiée. Le protocole identifie les mutants qui ne montrent pas ou réduit Ca2+ altitudes sur l’addition de stimuli. Ces mutants peuvent ensuite être cartographiés pour identifier les gènes responsables de la réponse Ca2+. La méthode s’applique à tout type de stimuli liquides dans les plantes qui se traduit par une altitude Ca2+. Puisque l’élévation de Ca2+ est l’une des premières réponses dans la voie de signalisation de défense de plante, l’identification des composants de réponse en amont peut fournir des candidats pour le génie génétique pour développer des usines résilientes.
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Protocol
1. Ems mutagènesis et collecte de semences à base de pedigree unique (1-3 mois)
- Peser 150 mg de graines (~7500) d’aequorine pour la mutagenèse EMS (graines M0). Peser 150 mg de graines à utiliser comme un contrôle.
- Transférer les graines dans un tube de 50 ml et ajouter 25 ml de SME à 0,2 % (v/v) (ATTENTION) (pour traitement) ou 25 ml d’eau autoclavée (pour contrôle).
REMARQUE : Le sulfonate d’éthyle-méthane est un agent chimique pour la mutagation des matières végétales. - Sceller le tube avec du parafilm et l’envelopper dans du papier d’aluminium. Faire pivoter l’extrémité du tube pendant 18 h à température ambiante.
- Laisser les graines s’installer. Retirez soigneusement la solution EMS et jetez-les dans un contenant de déchets contenant 1 M NaOH en volumes égaux (NaOH aide à neutraliser/inactiver le SME, ce qui le rend sécuritaire à jeter). Jetez la plastique usagée dans une solution NaOH de 1 M.
REMARQUE : Après 24 h, jetez les rejets selon les pratiques de laboratoire des matières dangereuses. - Laver soigneusement les graines mutagées avec 40 mL d’eau autoclavée au moins 8 fois. Jeter le SME contenant de l’eau dans un conteneur à déchets NaOH comme mentionné ci-dessus.
- Pour le lavage final, ajouter 40 mL de thiosulfate de sodium de 100 mM et rincer 3 fois pour enlever les traces de SME.
- Faire tremper les graines dans 40 mL d’eau autoclavée pendant ~1 h pour diffuser le SME hors des graines, puis les placer sur du papier filtre jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches.
- Transférer les graines dans un tube de microcentrifuge et stratifier les graines à 4 °C dans 40 ml d’eau autoclavée pendant 2-4 jours. Cela aide à briser la dormance des semences et assure une croissance homogène.
- Transférer les graines mutagées (M0)et les graines témoins sur le sol (composition du sol : agropet : sollerite, 1:1) et les transférer dans des salles de croissance avec une photopériode sombre de 16 h/8 h, une intensité lumineuse de 150 μmol•m−2•s−1 et ~70% d’humidité relative.
- Pour déterminer si la mutagenèse a réussi, recherchez une vitesse de germination réduite et la croissance des semis, et la chlorophylle sectoring18 (Figure 1A). Comparez les plantes mutagéenisées aux plantes témoins pour identifier ces différences physiologiques et développementales.
REMARQUE : Différentes méthodes peuvent être utilisées pour récolter des graines de plantes M1. Dans ce protocole, nous avons utilisé la méthode unique de collecte de semences à base de pedigree. Chaque usine M1 reçoit un numéro unique, à partir de A1 à A3500. - Maintenir les plantes numérotées individuellement en tant que lignées végétales discrètes (figure 1B).
- Lors de la maturation, récolter les graines de ces plantes mutantes individuelles et les stocker sous forme de lignées M1 individuelles (figure 2). À partir de la collection de semences à base de pedigree unique, nous avons obtenu environ 5000 M1 lignes dont 3500 M1 lignes ont été projetées.
2. Dépistage à haut débit pour sélectionner les mutants (8 mois)
- Identifiez les nouveaux mutants en fonction de la réponse ca2+ à un stimulus sélectionné. Ici, nous avons utilisé H2O2 comme exemple.
- Pour identifier les mutants, filtrez la génération M2. Puisque les mutants récessifs se séparent à 1/8 de fréquence dans la génération M2 sur ems mutagenesis14, le dépistage de 8-12 M2-plantes de ségrégation couvre une ligne M1 et identifie un mutant récessif homozygote (en utilisant 12 semis augmente la probabilité de trouver un mutant). De chaque ligne indépendante M1, testez 12 M2 semis pour la réponse de Ca2+ à H2O2 (12 M2 semis par ligne M1).
- Utilisez un protocole de stérilisation des semences à haut débit et de croissance hydroponique des plantes19. Placer près de 12-15 M2 graines par ligne M1 dans des puits individuels d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et stériliser à l’aide de gaz de chlore (40 mL d’hypochlorite de sodium et d’acide chlorhydrique de sodium, 3:1, v/v) dans un désiccateur pendant 4 h dans un capot de fumée. Après la procédure, ouvrez le desiccateur et laissez reposer toute la nuit pour que le gaz de chlore s’évapore.
- Après stérilisation, apportez les plaques à l’extérieur et ajoutez du liquide 1/2 MS (mi-résistance MS sans agar) à des puits individuels. Sceller les plaques avec le parafilm et stratifier les graines pendant 2-4 jours à 4 °C, puis déplacer les graines dans une chambre de croissance avec 10 h de photopériode sombre à 20-22 °C avec 70% d’humidité relative.
- Une fois que les semis ont entre 8 et 12 jours, placez 12 M2 semis de chaque ligne individuellement dans une plaque de luminomètre de 96 puits. Pour mesurer la réponse ca2+ à H2O2, utilisez un lecteur de plaque de luminomètre.
- Après le transfert des semis, ajouter 150 μL de solution de coelentrazine de 5 à 10 μM (dilué dans de l’eau autoclavée à partir d’un stock de 5 mM en méthanol) (ATTENTION) dans des puits individuels dans une zone sombre/faible lumière et conserver dans l’obscurité à 21 °C pendant 8 h.
REMARQUE : Coelentrazine est un groupe prothétique qui se lie à l’apo-aequorin et la reconstitue en aequorine fonctionnelle. Coelentrazine est sensible à la lumière et est donc stocké dans des bouteilles de couleur foncée, protégée de la lumière. - Le lendemain, effectuer écran mutant en utilisant 10 mM H2O2 comme un stimulus et mesurer la réponse suivante Ca2 +.
- Pour la mesure simultanée de 24 puits, créer un programme cinétique automatisé qui mesure l’arrière-plan pendant 1 min, suivi de l’ajout de stimuli (40 μL) et de la mesure pendant 10 min, suivi d’une décharge totale d’aéquorine (2 M CaCl2 dans 150 μL 20 % d’éthanol) pendant 1-2 min.
REMARQUE : Une décharge d’extrémité pour l’aequorin total est nécessaire pour quantifier le Ca2+ mesuré et comme contrôle supplémentaire pour l’aequorine fonctionnelle. La décharge d’extrémité est une courte course de 1-2 min et ne cause pas la mort importante de plante. Alternativement, si les plantes meurent après l’étape de décharge, puis ré-écran de la ligne spécifique M1 et de sauvetage sans décharge. Ces mutants peuvent être confirmés dans les générations M3 et M4 en utilisant l’étape de décharge. - Utilisez une méthode de numérisation au format 24 puits qui mesure chaque ligne en intervalle de 7 s avec un temps d’intégration de 300 ms par puits par point de mesure. Utilisez un semis de type sauvage comme contrôle dans chaque ligne pour la comparaison et l’évaluation du mutant.
REMARQUE : Une seule plaque de puits de 96 contenant des semis M2 couvrira 8 lignes M1 individuelles (8 M1*12= 96 M2) et peut être projetée en 2,5 h et chaque jour 32 M1 lignes seront examinées, 640 M1 plantes par mois. L’ensemble de la procédure de dépistage après les plantes sont prêtes prendrait environ 8 mois. - Identifier les mutants en fonction de la perte ou de la réduction de la réponse ca2+ avec H2O2. Sauvez les mutants sélectionnés grâce à un processus de lavage à base d’antibiotiques. Laver le semis avec une solution de céfotaxime de 25 mg/L deux fois, puis transférer vers un milieu de sauvetage qui contient 25 mg/L de céfotaxime dans 1/2 MS agar.
- Cultivez les plaques à une photopériode de 10 h/ 14 h foncée pour obtenir une plante mutante. Le lavage de cefotaxime aide à éliminer tous les micro-organismes nuisibles sur le semis. Étant donné que les semis après la reconstitution ne sont pas scellés, réduisez au minimum la contamination lors du transfert à l’état stérile.
- Transférer la plante mutante sur le sol pour obtenir la population d’homozygotes M3.
3. Analyse des données et identification des mutants (1-3 mois)
REMARQUE : Les lectures fournies par la méthode ci-dessus sont en unités de lumière relative (RLU).
- Pour calculer [Ca2+] la concentrationcyt, utilisez l’équation de concentration suivante20.
pCa = 0,332588(−log (L/Lmax)) + 5,5593
Compte de luminescence () et nombre total restant (max). - Convertir les valeurs pCa obtenues en valeurscyt [Ca2+] en μM en multipliant par 106. Puis graphiquement tracer contre un aequorin (transgénique Col-0 aequorin) contrôle pour identifier putatif H2O2 mutants à Ca2 + réponse.
- Les semis de sauvetage montrant une perte ou une réponse réduite à l’applicationH2O2 ont été secourus.
- Lors de la maturation, récolter les graines du mutant sauvé et ré-examiner la réponse aux semis H2O2 en M3. Si tous les 12 M3 semis montrent une réponse Ca2+ similaire à la plante mère, considérez la population comme une population mutante homozygote M3. Si les 12 semis ne montrent pas une telle réponse, puis les prendre à la génération M4 et re-écran pour obtenir la population d’homozygotes.
- Une fois qu’une lignée de plantes homozygotes a été obtenue, identifiez le gène conduisant à un phénotype altéré à l’aide du séquençage de la prochaine génération.
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Representative Results
La population de SME a été examinée pour h2O2 induit Ca2+ altitude. Comme nous l’avons vu précédemment, 12 semis M2 individuels ont été examinés à partir de chaque ligne M1. Dans la figure 3, une telle ligne M1 est tracée avec chaque panneau montrant 12 semis M2 individuels. Une aequorine de type sauvage est utilisée comme contrôle pour comparer et évaluer la réponse mutante. Un mutant récessif sépare dans le rapport de 1:7 (mutant : non mutant). Lors du dépistage de 12 semis individuels par ligne M1, nous pouvons identifier 1 ou 2 mutants par ligne. Nous avons identifié 2 mutants putatifs de 12 M2 semis (Figure 3). Ces mutants sont en outre portés à M3 et M4 et une population d’homozygotes est générée. Le mutant homozygote est ensuite cartographié pour identifier le gène causal.
Figure 1 : Arabidopsis mutagenisé d’EMS. (A) Pour déterminer une mutagenèse du SMU réussie, nous avons cherché un secteur de chlorophylle dans la population de plantes mutagenisées (indiquée par flèche). Statistiquement, 0,1 à 1% des plantes M1 doivent présenter des secteurs chlorotiques. (B) Le potage individuel des plantes M1 a été fait pour effectuer une seule collection de semences à base de pedigree. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Représentation schématique de la méthodologie de l’écran génétique avancé. 7500 plantes transgéniques d’Arabidopsis exprimant l’aéquorine cytosolique (Aeq) dans le Col-0 sont mutagénisées avec le méthanesulphonate d’éthyle (EMS) dans la génération M0. Environ 5000 semis de la génération M1 sont propagés individuellement par la méthode d’un seul pedigree et propagés à la génération M2. 12 plantes de chaque ligne M2 sont examinées pour le phénotype d’intérêt (environ 3000-3500 M1 lignes). Mutant pour le phénotype d’intérêt est sauvé et propagé à la génération M3 et examiné pour l’homozygosité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Identification des mutants ayant une réponse altérée autraitement H2O2. Une figure représentative pour représenter la sélection mutante à partir d’une seule ligne de séparation M1 est affichée. Les panneaux montrent le résultat du dépistage (12 semis M2 séparants par ligne M1 individuelle) lors de la stimulation avec 10 mM H2O2. WT (Aequorin) contrôle (ligne verte), moyenne de tous les 12 M2 semis est la réponse moyenne (ligne rouge) et A1-X (ligne noire) sont des semis individuels numérotés de 1-12. Pour chaque graphique, l’axe y est lecyt [Ca2+] (μM) et l’axe x est le temps (min). [Ca2+] les niveaux de cyt ont été calculés à partir d’unités lumineuses relatives (RLUs). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La mutanéèse ems est un outil puissant pour générer des mutations dans la population. Les écrans génétiques avancés classiques utilisant le SME ont été un outil efficace pour identifier de nouveaux gènes pour deux raisons principales : premièrement, ils ne nécessitent aucune hypothèse préalable sur l’identité génétique et, deuxièmement, ils n’introduisent aucun biais. Il existe plusieurs méthodes pour générer un dépistage des populations comme le SME, les insertions d’ADN T, les radiations, etc. De toutes les méthodes, la mutagenèse basée sur le SME a peu d’avantages par rapport aux autres méthodes. Tout d’abord, il est plus facile de générer une population mutante par l’exposition au SME tel que décrit dans le protocole actuel21,22. Deuxièmement, un nombre suffisamment important de graines mutantes peut être généré, qui peut être utilisé pour plusieurs écrans pour un ou plusieurs stimuli. Troisièmement, un allèle faible d’un gène essentiel généré en raison d’une mutation de missense peut être identifié. Quatrièmement, un éventail d’effets de la fonction génique peut être identifié à l’aide de l’écran ems, y compris la perte complète de la fonction, la perte partielle de la fonction, la fonction altérée et une fonction génétique constitutive. Il peut aider à l’identification des mutants doubles qui n’est pas faisable par d’autres méthodes de mutagenèse23,24,25. La collection de graines M1 à base de pedigree unique utilisée dans ce protocole est également avantageuse car elle permet de retourner à la population mère pour identifier à nouveau le même mutant, si la progéniture est perdue dans les générations futures suivantes. Il offre la possibilité de récupérer des mutations qui sont stériles lors de l’homozygote et peuvent être récupérés par l’intermédiaire des frères et sœurs hétérozygotes des plantes mutantes. Deuxièmement, cette stratégie garantit l’indépendance de tous les mutants isolés par rapport au gonflement des graines de la génération M1. Il garantit que les mutations isolées de la collection M2 sont des allèles différents au même lieu plutôt que le même événement mutationnel26.
Les gènes identifiés à l’occasion des écrans de mutagenèse du SMU dépendent du phénotype utilisé pour le dépistage de la population. Plus vite le phénotype d’intérêt peut être projeté, plus il est facile d’identifier de nouvelles voies. Ca2+ est un messager secondaire omniprésent qui est parmi les premières cascades de signalisation à être activé. Il agit comme un médiateur pour la réponse des plantes contre un large éventail de stimuli biotiques et abiotiques. En outre, l’aequorin du journaliste de calcium peut être localisé à divers compartiments sous-cellulaires et organites27,28,29. Cela ouvre des voies pour identifier les rôles des protéines localisées dans ces compartiments dans la dynamique de réponse au calcium30,31,32.
Les écrans génétiques avancés basés sur l’EMS-mutagenèse dans l’aequorin et l’utilisation de Ca2+ comme lectures sont restés contemporains depuis leur découverte. Les avantages de cette méthode ont dépassé les pièges. Cependant, peu de limitations de la technique doivent encore être soigneusement évaluées. L’écran est laborieux et chronométrage et nécessite l’identification des plantes mutantes d’une vaste population mutagéenisée. Par conséquent, une planification détaillée fondée sur la disponibilité des ressources, les besoins en personnel de travail et les contraintes d’espace doit être effectuée avant d’entreprendre le plan expérimental. Le deuxième défi majeur avec les écrans Ca2+ à base d’aequorin est la possibilité de faux positifs sans étape de décharge. Par conséquent, une étape de décharge très courte est incluse dans le protocole. Les mutations aléatoires peuvent également conduire à la génération de plantes stériles qui ne peuvent pas être sauvées en raison de mutations multiples. Troisièmement, la signature Ca2+ est très spécifique aux tissus et la cohérence du dépistage doit être assurée4.
Peu d’écrans génétiques avancés ont identifié les récepteurs, les canaux, les pompes et les transporteurs de Ca2+ comme l’utilisation de Ca2+ comme phénotype de dépistage dans la génétique avancée était rare. Les stimuli (p. ex., H2O2) induits Ca2+ élévation est utilisé comme marqueur pour un écran génétique avant dans notre méthodologie, pour identifier de nouveaux composants génétiques impliqués dans le processus. Une stratégie similaire utilisant ems mutagationnized population d’aequorin a conduit à la découverte de nombreux récepteurs comme DORN1 qui est récepteur eATP33, canal de calcium OSCA34, récepteur LORE impliqué dans la détection de lipopolysaccharide35 et la ribonuclease PARN136. Une étude récente publiée par Wu et coll. a utilisé une méthodologie très similaire de dépistage des plantes d’équorine smugéenisées par EMS sur H2O2 pour identifier le nouveau capteur de peroxyde d’hydrogène HPCA137. Par conséquent, le protocole utilisant la mutagènesie EMS dans le fond de journaliste ca2+ est une méthode prometteuse pour la découverte de gènes nouveaux impliqués dans la détection de stimuli.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Nous remercions le National Institute of Plant Genome Research - Phytotron Facility for plant growth, Bombay Locale pour la séance vidéo et le Department of Biotechnology- eLibrary Consortium d’avoir fourni l’accès aux ressources électroniques. Ces travaux ont été soutenus par le Département de biotechnologie de l’Inde par l’intermédiaire du National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; et bourse de recherche CSIR-Junior (à D.M et S.M) et De la Bourse de recherche du Département de biotechnologie-junior (à R.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
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