Summary
Передний генетический экран, основанный на высоте Ca2 " в качестве считывания, приводит к выявлению генетических компонентов, участвующих в зависимых от кальция сигнальных путей в растениях.
Abstract
Передние генетические экраны были важными инструментами в объективной идентификации генетических компонентов, участвующих в нескольких биологических путей. Основой экрана является создание популяции мутантов, которые могут быть проверены с фенотипом интереса. EMS (сульфонат этилового метана) является широко используемым алкилатированием для индуцирования случайных мутаций в классическом переднем генетическом экране для выявления нескольких генов, участвующих в том или ином процессе. Цитосорический кальций (Ca2")высота является ключевым ранним сигнальным путем, который активируется при восприятии стресса. Однако личность рецепторов, каналов, насосов и транспортеров Ca2 "по-прежнему неуловимы во многих системах исследования. Aequorin является клеточным кальция репортер белка изолированы от Aequorea Виктория и стабильно выражается в Arabidopsis. Используя это, мы разработали передний генетический экран, в котором мы EMS-мутагенизированные трансгенные аекворин. Семена из растений-мутантов были собраны (M1) и скрининг на фенотип интереса был проведен в сегрегации (M2) населения. Используя 96-хорошо высокопроизводительный протокол измерения Ca2, можно определить несколько новых мутантов, которые имеют различную реакцию кальция и измеряются в режиме реального времени. Мутанты с фенотипом интереса спасаются и распространяются до получения гомозиготной популяции растений-мутантов. Этот протокол обеспечивает метод для передних генетических экранов в Ca2 "репортер фон и определить роман Ca2 " регулируемых целей.
Introduction
Изменение в цитозолических кальция (Ca2 ")концентрация на восприятие биотического или абиотического стимула является хорошо изучены раннего сигнализации событие, которое активирует многие сигнальные пути1,2,3,4. Клетка в его базальном состоянии отдыха поддерживает более низкую концентрацию Ca2 "в цитозоле и секвестраторов избыток Ca2 " в различных внутриклеточных органелл и внеклеточной апопласт, ведущих к крутой Ca2 "градиент5,6. При восприятии сигнала, Ca2 "уровни поднимаются в цитозоле из-за притока Ca2 " из внеклеточных и / или внутриклеточных источников и генерировать стимулы конкретных подписи кальция7,8,9. Ca2 "высоты в цитосол активируются многими стимулами, но специфика поддерживается различных магазинов, выпускающих Ca2 ",уникальный Ca2 " подпись и соответствующие белки датчика10,11.
Использование алкилатового агента, этил-метанового сульфоната (ЭМС) для мутагенеза является мощным инструментом в классических передних генетических экранах для выявления нескольких независимых генов, участвующих в процессе. EMS является химическим мутагеном, преимущественно вызывающим C к T и G к переходу случайным образом по всему геному и производит 1 bp изменение в каждых 125 кб генома. EMS mutagenesis вызовет изменения ≈1000 однобазовой пары, либо вставки / удаления (InDel) или одного нуклеотида полиморфизма (SNP) на геном12. МУТАЦИи, индуцированные EMS, представляют собой множественные точечные мутации с частотой мутаций от 1/300 до 1/30000 за локус. Это уменьшает количество растений M1, необходимых для поиска мутации в данном гене. Диапазон популяций семян M1 2000-3000 обычно используется для получения мутаций, представляющих интерес в Arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin трансгенитики являются Arabidopsis Колумбия-0 (Col-0) экотип растений, выражающих p35S-apoaequorin (pMA'2) вцитозоле 15. Aequorin является Ca2 "связывающий белок, состоящий из апопротеина и протезной группы, состоящей из молекулы люциферина, коэлентеразин. Связывание Ca2 "к aequorin, который имеет три Ca2 " связывающих EF-руки сайтов, приводит к coelenterazine окисляется и циклизируются, чтобы дать диоксетанон промежуточных, а затем конформационное изменение белка сопровождается выпуском двуокиси углерода и синглет-возбужденных coelenteramide16. Coelenteramide так производится испускает синий свет(no max, 470 нм), которые могут быть обнаружены люминесометр17. Таким образом, чрезвычайно быстрые высоты Ca2 можно измерять в режиме реального времени и использовать для быстрого перемотки на задние экраны. Этот протокол направлен на использование специфичности кальция ответ для выявления новых ключевых игроков, которые участвуют в Ca2 "подпись. Для достижения этой задачи мы используем МУТагенез EMS в трансгенном акурерине и идентифицируем SNPs, связанные с измененной сигнализацией Ca2. Протокол определяет мутантов, которые не показывают или уменьшены Ca2 "высоты при добавлении стимулов. Эти мутанты могут быть отображены для определения генов, ответственных за ответ Ca2. Метод применим к любому виду жидких стимулов в растениях, что приводит к ca2 "высота. Так как высота Ca2 является одним из первых ответов в пути сигнализации защиты растений, идентификация компонентов реагирования вверх по течению может обеспечить кандидатов на генную инженерию для разработки устойчивых растений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. МУТагенез EMS и одна родословная на основе коллекции семян (1-3 месяца)
- Взвесьте 150 мг семян (7500) аекворина для эмагенеза EMS (M0). Взвесьте еще 150 мг семян, которые будут использоваться в качестве контроля.
- Перенесите семена в трубку 50 мл и добавьте 25 мл 0,2% EMS (v/v) (CAUTION) (для обработки) или 25 мл автоклаведной воды (для контроля).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этил-метановый сульфонат является химическим агентом для мутагенизирующего растительного материала. - Печать трубки с парафильмом и оберните его в алюминиевую фольгу. Поверните трубку в конце конца на 18 ч при комнатной температуре.
- Разрешить семена, чтобы осесть. Тщательно удалите решение EMS и сбросьте его в контейнер для отходов, содержащий 1 M NaOH в равных объемах (NaOH помогает нейтрализовать/инактивировать EMS, что делает его безопасным для отбрасывания). Откажитесь от используемого пластмассового программного обеспечения в решении 1 M NaOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 24 ч, утилизировать сбросы в соответствии с опасными материалами лабораторных практик. - Тщательно вымойте мутагенизированные семена 40 мЛ автоклаведной воды не менее 8 раз. Откажитесь от EMS, содержащей воду в контейнере отходов NaOH, как упоминалось выше.
- Для окончательной стирки добавьте 40 мл 100 мМ тиосульфата натрия и промойте 3 раза, чтобы удалить следы EMS.
- Замочите семена в 40 мл воды с автоклаведом на 1 ч, чтобы рассеять EMS из семян, а затем поместить их на фильтровальную бумагу до полного высыхания.
- Перенесите семена в микроцентрифуговую трубку и расслоитейте семена при 4 градусах в 40 мл автоклаведной воды в течение 2-4 дней. Это помогает в нарушении семян спячки и обеспечивает однородный рост.
- Перенесите как мутагенизированные семена (M0) и контрольные семена на почву (состав почвы: агропет: почворит, 1:1) и перенесите их в комнаты роста с 16 ч света/8 л темной фотопериод, световая интенсивность 150мкмм 2с1 и 70% относительной влажности.
- Чтобы определить, если мутагенез был успешным, ищите снижение скорости прорастания и роста рассады, и хлорофилл сектора18 (Рисунок 1A). Сравните мутагенизированные растения с контрольными растениями, чтобы определить эти физиологические и отклонения в развитии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора семян растений M1 могут быть использованы различные методы. В этом протоколе мы использовали один метод сбора семян на основе родословной. Каждому заводу M1 дается уникальное число, начиная от A1 до A3500. - Поддерживать индивидуально пронумерованные растения как дискретные линии растений(Рисунок 1B).
- После созревания, урожай семян из этих отдельных растений мутантов и хранить как отдельные линии M1 (Рисунок 2). Из одной коллекции семян на основе родословной мы получили около 5000 M1 линий, из которых 3500 M1 линии были проверены.
2. Высокопроизводительный скрининг для выбора мутантов (8 месяцев)
- Определите новых мутантов на основе ответа Ca2 на выбранный стимул. В качестве примера мы использовали H2O2.
- Для идентификации мутантов экран M2 поколения. Так как рецессивные мутанты сегрегируются на частоте 1/8 в M2 поколения на EMS mutagenesis14, скрининг 8-12 M2- сегрегация растений охватывает одну линию M1 и определяет гомозиготный рецессивный мутант (использование 12 саженцев увеличивает вероятность нахождения мутанта). Из каждой независимой линии M1, тест 12 M2 саженцы для Ca2 "ответ на H2O2 (12 M2 саженцы на M1 линии).
- Используйте протокол стерилизации семян высокой пропускной способности и протокол роста гидропонных растений19. Поместите почти 12-15 M2 семена на линию M1 в отдельных колодцах 24-хорошо ткани культуры пластины и стерилизовать с использованием хлорного газа (40 мл 12% гипохлорита натрия и соляной кислоты, 3:1, v/ V) в desiccator для 4 h в дымовой капюшон. После процедуры откройте децикатор и оставьте на ночь, чтобы газ хлора испарился.
- После стерилизации, принести пластины снаружи и добавить жидкие 1 /2 MS средств массовой информации (пол-силы MS без агара) в отдельных скважин. Печать пластин с parafilm и стратифировать семена в течение 2-4 дней при температуре 4 градусов по Цельсию, а затем переместить семена в камеру роста с 10 ч света / 14 ч темной фотопериод при 20-22 градусов по Цельсию с 70% относительной влажности.
- После того, как саженцы 8-12 дней, место 12 M2 рассады от каждой линии индивидуально в 96-ну люминесометр пластины. Для измерения Ca2 "ответ на H2O2,используйте люминесометр считыватель пластины.
- После переноса рассады добавьте 150 мл 5-10 келентразином раствора (разбавленного в автоклаведированной воде из 5 мМ запаса в метаноле) (CAUTION) в отдельных скважинах в темной/низкой освещенности и хранить в темной зоне при 21 градусе Цельсия за 8 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Coelentrazine является протез группы, которая связывается с апо-аекворин и воссоздает его функциональный аекворин. Коэнтразин светочувствительный и, следовательно, хранится в темных цветах бутылок, защищенных от света. - На следующий день выполните мутантный экран с помощью 10 mM H2O2 в качестве стимула и измерьте последующую реакцию Ca2.
- Для одновременного измерения 24 скважин создайте автоматизированную кинетическую программу, которая измеряет фон в течение 1 мин, с последующим добавлением стимулов (40 мл) и измерением в течение 10 мин, за которым следует общий разряд aequorin (2 M CaCl2 в 150 мл 20% этанола) за 1-2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная разрядка для общего aequorin необходима для количественной оценки измеренного Ca2 "и в качестве дополнительного контроля для функционального aequorin. Конечный разряд короткий пробег 1-2 мин и не вызывает значительной смерти растений. Кроме того, если растения умирают после шага разряда, а затем переоспокоить конкретные линии M1 и спасти без разряда. Такие мутанты могут быть подтверждены в поколениях M3 и M4 с помощью шага разряда. - Используйте метод сканирования формата 24-ну, который измеряет каждую строку в интервале 7 с интервалом 300 мс за колодец на точку измерения. Используйте рассаду дикого типа в качестве контроля в каждом ряду для сравнения и оценки мутанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один 96 хорошо пластины, содержащие M2 саженцы будет охватывать 8 отдельных M1 линии (8 M1й 12 "96 M2) и может быть проверена в 2,5 ч и каждый день 32 M1 линии будут проверены, 640 M1 растений в месяц. Вся процедура скрининга после того, как растения будут готовы займет около 8 месяцев. - Определите мутантов на основе потери или уменьшенной реакции Ca2 с H2O2. Спасите выбранных мутантов с помощью процесса мытья на основе антибиотиков. Вымойте рассаду с 25 мг / L цефотаксиме решение дважды, а затем передать на спасательные среды, которая содержит 25 мг / L цефотаксим в 1/2 MS агар.
- Выращивайте пластины со светом 10 ч/14 ч темного фотопериода, чтобы получить мутантное растение. Мытье цефотаксиме помогает удалить любые вредные микроорганизмы на рассаду. Так как саженцы после восстановления хранятся негерметизированы, минимизируйте загрязнение при переходе обратно в стерильное состояние.
- Передача растения-мутанта в почву для получения гомозиготной популяции M3.
3. Анализ данных и идентификация мутантов (1-3 месяца)
ПРИМЕЧАНИЕ: Показания, предоставленные из вышеуказанного метода, находятся в относительных световых единицах (RLU).
- Для расчета концентрациикитта «Ca2»используйте следующее уравнение концентрации20.
pCa 0.332588 (лог (L/Lmax))
Количество люминесценции () и общее количество оставшихся пунктов(максимум). - Преобразуйте полученные значения pCa в значенияq 2'q qt, умножая на 106. Затем графически сюжет против aequorin (трансгенный Col-0 aequorin) контроль для выявления можноовых H2O2 мутантов Ca2 "ответ.
- Спасательные саженцы, показывающие потерю или уменьшенную реакцию на применение H2O2, спасены.
- После созревания, урожай семян от спасенного мутанта и повторно экран для ответа на H2O2 в M3 саженцев. Если все 12 M3 саженцы показывают Ca2 "ответ похож на материнское растение, считают население гомозиготной M3 мутантов населения. Если все 12 саженцев не показывают такой ответ, а затем принять их в M4 поколения и повторно экран для получения гомозиготной популяции.
- После получения гомозиготной линии растений определите ген, ведущий к изменению фенотипа с помощью секвенирования следующего поколения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Популяция EMS была проверена на H2O2 индуцированной высоты Ca2" . Как обсуждалось ранее, 12 отдельных M2 саженцы были проверены от каждой линии M1. На рисунке 3,одна такая линия M1 построена с каждой панелью, показывающей 12 отдельных саженцев M2. Аекворин дикого типа используется в качестве контроля для сравнения и оценки реакции мутантов. рецессивный мутант отделяется в соотношении 1:7 (мутант: не мутант). При скрининге 12 отдельных саженцев на линию M1 мы можем определить 1 или 2 мутанта на линию. Мы определили 2 putative мутантов из 12 M2 саженцев (Рисунок 3). Эти мутанты далее принимаются к M3 и M4 и гомозиготной популяции генерируется. Гомозиготный мутант дополнительно отображен для определения причинно-следственной связи.
Рисунок 1: EMS мутагенизированных арабидопсис. (A) Чтобы определить успешный МУТагенез EMS, мы искали хлорофилл сектора в мутагенных популяции растений (указано стрелкой). По статистике, от 0,1 до 1% растений M1 должны показывать хлоротические сектора. (B) Индивидуальный залив M1 растений было сделано для выполнения одной родословной основе коллекции семян. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематическое представление методологии передового генетического экрана. 7500 трансгенных растений арабидопсиса, выражающих цитозоличный экуорин (Aeq) в Col-0, мутагенируются этиловым метаносульфонатом (ЭМС) в поколении M0. Около 5000 саженцев из поколения M1 размножаются индивидуально одним родословным методом и распространяются до поколения M2. 12 растений из каждой линии M2 проверяются на фенотип интереса (около 3000-3500 M1 линий). Мутант для фенотипа интереса спасается и распространяется на M3 поколения и скрининг на гомозигозность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Идентификация мутантов с измененной реакцией на лечение H2O2. Показана репрезентативная фигура для изображения выбора мутанта из одной сегрегированной линии M1. Панели показывают результат скрининга (12 сегрегации M2 саженцев на отдельные M1 линии) при стимуляции с 10 mM H2O2. Контроль WT (Aequorin) (зеленая линия), в среднем всех 12 M2 саженцев является средним ответом (красная линия) и A1-X (черная линия) являются отдельные саженцы пронумерованы от 1-12. Для каждого графика, y-ось является "Ca2"й цит (м) и x-оси время (мин). (Ca2) уровни cyt были рассчитаны из относительных световых единиц (RLUs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EMS mutagenesis является мощным инструментом для генерации мутаций в популяции. Классические передние генетические экраны с использованием EMS были эффективным инструментом для выявления новых генов по двум основным причинам: во-первых, они не требуют каких-либо предварительных предположений о идентичности генов, а во-вторых, они не вводят каких-либо предубеждений. Есть несколько методов для создания скрининга населения, как EMS, T-DNA вставки, излучения и т.д. Из всех методов, НА основе EMS мутагенез имеет мало преимуществ по сравнению с другими методами. Во-первых, легче генерировать мутантную популяцию путем воздействия EMS, как описано в текущем протоколе21,22. Во-вторых, может быть создано достаточно большое количество популяций семян мутантов, которые могут быть использованы для нескольких экранов для одного или нескольких стимулов. В-третьих, можно определить слабый аллель важного гена, генерируемого из-за мутации ошибки. В-четвертых, с помощью экрана EMS можно определить массив эффектов функций генов, включая полную потерю функции, частичную потерю функции, измененную функцию и составную функцию гена. Это может помочь в выявлении двойных мутантов, что не представляется возможным другими методами мутогенеза23,24,25. Одна родословная на основе M1 коллекция семян, используемых в этом протоколе также выгодно, поскольку она позволяет вернуться к материнской популяции, чтобы определить тот же мутант снова, если потомство теряется в последующих будущих поколений. Он предлагает возможность для восстановления мутаций, которые являются бесплодными, когда гомозиготные и могут быть восстановлены через гетерозиготных братьев и сестер мутантов растений. Во-вторых, эта стратегия гарантирует независимость всех мутантов, изолированных по сравнению с ссыпанием семян в поколенииM 1. Это гарантирует, что мутации, выделенные из коллекции M2, являются различными аллелями в одном и том же локусе, а не одним и тем же мутационным событием26.
Гены, идентифицированные с помощью экранов МУТагенеза EMS, зависят от фенотипа, используемого для скрининга популяции. Чем быстрее можно будет отсеивать фенотип, тем легче определить новые пути. Ca2 " является вездесущим вторичным посланником, который является одним из первых сигнальных каскадов, которые будут активированы. Он выступает в качестве посредника для реакции растений против широкого спектра биотических и абиотических стимулов. Кроме того, кальций репортер aequorin может быть локализован в различных субклеточных отсеков и органелл27,28,29. Это открывает возможности для определения ролей белка, локализованного в этих отсеках в динамике реакции кальция30,,31,,32.
Вперед генетические экраны на основе EMS-мутагенез в aequorin и с использованием Ca2 ", как считывание остались современными с момента их открытия. Преимущества этого метода перевешивают подводные камни. Тем не менее, несколько ограничений техники еще должны быть тщательно оценены. Экран трудоемкий и трудоемкий и требует идентификации растений-мутантов из огромной мутагенизированной популяции. Поэтому необходимо осуществлять подробное планирование, основанное на наличии ресурсов, потребностях рабочего персонала и ограничении пространства, прежде чем приступить к осуществлению экспериментального плана. Второй серьезной проблемой с экранами Ca2 на основе aequorin является возможность ложных срабатываний без шага разряда. Таким образом, очень короткий шаг разряда включен в протокол. Случайные мутации также могут привести к генерации стерильных растений, которые не могут быть спасены из-за многочисленных мутаций. В-третьих, подпись Ca2 высоко специфична для ткани, а консистенция в скрининге должна быть обеспечена4.
Не многие передние генетические экраны определили рецепторы, каналы, насосы и транспортеры Ca2 ", как использование Ca2 ", как скрининг фенотип в передовой генетики было редко. Стимулы (например, H2O2) индуцированной высоты Ca2 "используется в качестве маркера для вперед генетического экрана в нашей методологии, для выявления новых генетических компонентов, участвующих в процессе. Аналогичная стратегия с использованием EMS mutagenized популяции аеквойрина привело к открытию многих рецепторов, как DORN1, который является рецептором eATP33, кальций канал OSCA34, LORE рецепторов, участвующих в липополизахарид зондирования35 и рибонуклеазы PARN136. Недавнее исследование, опубликованное Wu et al. использовало очень подобную методологию скрининга EMS-мутагенизированных растений aequorin на H2O2 для выявления нового датчика перекиси водорода HPCA137. Таким образом, протокол с использованием EMS mutagenesis в Ca2 "репортер фон является перспективным методом для новых открытий генов, участвующих в зондирования стимулов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеет каких-либо конфликтов интересов, чтобы объявить.
Acknowledgments
Мы благодарим Национальный институт исследований генома растений - Фитотронный фонд для роста растений, Bombay Locale за видеосъемка, и Департамент биотехнологии- eLibrary consortium за предоставление доступа к электронным ресурсам. Эта работа была поддержана Департаментом биотехнологии, Индия через Национальный институт исследования генома растений Основной Грант, Макс Планк Gesellschaft-Индия Партнерская группа программы; и стипендию CSIR-Junior Research fellowship (до D.M и S.M) и Кафедра биотехнологии-младшего научно-исследовательского стипендий (к Р.П.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
