Summary
혈액-뇌 장벽 (BBB) 일시적으로 마이크로 버블 매개 집중 초음파로 중단 될 수 있습니다 (FUS). 여기서는 비초음파 전문가가 액세스할 수 있는 모듈식 FUS 시스템을 사용하여 생체 내 고처리량 BBB 개방을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
혈액-뇌 장벽 (BBB) 다양 한 뇌 질환의 치료에 대 한 주요 장애물 되었습니다. 좁은 접합에 의해 연결된 내피 세포는 큰 분자 (>500 Da)가 뇌 조직에 진입하는 것을 방지하는 생리적 장벽을 형성합니다. 마이크로 버블 매개 집중 초음파 (FUS)는 과도 한 로컬 BBB 개방을 유도하는 데 사용할 수 있습니다, 더 큰 약물이 뇌 parenchyma입력 할 수 있도록.
임상 번역을 위한 대규모 임상 장치 이외에, 약 후보의 치료 반응 평가를 위한 전임상 연구는 표적으로 한 BBB 개방을 위한 전용된 작은 동물 초음파 설치를 요구합니다. 바람직하게는 이러한 시스템은 고공간 정밀도와 통합 캐비테이션 모니터링을 모두 갖춘 고처리량 워크플로우를 허용하면서도 초기 투자및 운영 비용 모두에서 비용 효율적입니다.
여기서는 시판되는 부품을 기반으로 하고 전술한 요구 사항을 충족하는 생물 발광 및 X선 유도 스테레오전술 소형 동물 FUS 시스템을 소개합니다. 특히 높은 수준의 자동화로 인해 일반적으로 대량의 전임상 약물 평가 연구에서 발생하는 과제를 용이하게 합니다. 이러한 과제의 예로는 데이터 재현성을 보장하고, 그룹 내 가변성을 줄이며, 샘플 크기를 줄이며, 윤리적 요구 사항을 준수하고 불필요한 워크로드를 줄이기 위해 표준화가 필요합니다. 제안된 BBB 시스템은 교모세포종 다중포메 및 확산 미드라인 신경교종의 환자 유래 xenograft 모델에 대한 BBB 개방 촉진 약물 전달 예심의 범위에서 검증되었습니다.
Introduction
혈액 뇌 장벽 (BBB)은 뇌 빈혈종으로 약물 전달의 주요 장애물입니다. 개발된 대부분의 치료약물은 그들의 물리화학적 파라미터(예를 들어, 리포필리시티, 분자량, 수소결합 수용자 및 기증자)로 인해 BBB를 교차하지 않거나뇌의efflux 수송자에 대한 친화력으로 인해 유지되지 않는다1,2. BBB를 교차할 수 있는 약물의 작은 단은 전형적으로 작은 리포필성 분자입니다, 이는 뇌 질환의 제한된 수에만 효과적이다1,2. 그 결과, 대부분의 뇌질환에 대해 약리학적 치료 옵션이 제한되어 있으며 신약 전달 전략이3,4가필요하다.
치료 초음파는 BBB 중단 (BBBD), 신경 변조 및 절제4,5,6,7과같은 다른 신경 학적 응용 프로그램에 사용할 수있는 새로운 기술이다. 두개골을 통해 초대형 초음파 방출기로 BBB 개구부를 달성하기 위해, 집중 초음파 (FUS)는 마이크로 버블과 결합된다. 마이크로버블 매개 FUS는 뇌 의 parenchyma5,8,9에서약물의 생체 이용률을 증가시합니다. 음파가 존재하여, 마이크로 버블은 BBB의 내피 세포 사이의 단단한 접합의 트랜시토시스 및 중단을 개시하기 시작하여 더 큰분자(10)의초세포 수송을 가능하게 한다. 이전 연구는 음향 방출의 강도와 BBB개방11,12,13,14에대한 생물학적 영향 사이의 상관 관계를 확인했습니다. FUS는 이미 화학요법제제로서 테모졸로미드 또는 리포소말 독소루비신을 이용한 교모세포종의 치료를 위한 임상시험에서 사용되거나, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭 경화증5,9,15,16의치료에 사용되고있다.
초음파 매개 BBB 개방은 약학에 대한 완전히 새로운 가능성에서 결과, 임상 번역을위한 전임상 연구가 선택 된 약물 후보의 치료 반응을 평가하는 데 필요합니다. 이를 위해서는 일반적으로 고공간 정밀도와 높은 재현성을 가진 표적 BBB 개구부를 모니터링하기 위한 통합 캐비테이션 감지가 모두 필요한 고처리량 워크플로우가 필요합니다. 가능하면 이러한 시스템은 연구 규모에 따라 확장 가능하기 위해 초기 투자 및 운영 비용 모두에서 비용 효율적이어야 합니다. 대부분의 전임상 FUS 시스템은 이미지 지도 및 치료 계획을 위한 MRI와 결합되어15,17,18,19. MRI는 종양 해부학 및 부피에 대한 자세한 정보를 제공하지만, 일반적으로 훈련 / 숙련 된 연산자가 수행하는 비싼 기술입니다. 또한, 고해상도 MRI는 전임상 시설에서 연구원을 위해 항상 유효하지 않을 수 있고 동물 당 긴 주사 시간을 필요로 합니다, 고처리량 약리학 연구 결과에 적게 적합합니다. 주목할 만한 점은, 신경 종양학 분야의 전임상 연구, 특히 침투종양 모델의 경우 종양을 시각화하고 표적으로 하는 가능성이 치료성공(20)에필수적이라는 점입니다. 현재, 이 요구 사항은 단지 MRI 또는 광단백질로 유도된 종양에 의해서만 성취되고, 광단백질 기판의 투여와 함께 생물 발광 화상 진찰(BLI)을 가진 시각화를 가능하게 합니다.
MRI 유도 FUS 시스템은 종종 수조를 사용하여 두개골 응용 프로그램에 대한 초음파 파 전파를 보장하며, 동물의 머리가 부분적으로 물에 잠겨 소위 '상향식'시스템(15,17,18)을사용합니다. 이러한 디자인은 일반적으로 작은 동물 연구에서 잘 작동 하지만, 그들은 동물 준비 시간 사이 타협, 휴대성 및 사용 하는 동안 현실적으로 유지 보수 위생 기준. MRI에 대한 대안으로, 스테레오테테네비게이션을 위한 다른 안내 방법은 설치류 해부학 아틀라스21,22,23,레이저 포인터 보조 시각 시력 24, 핀홀 보조 기계 스캐닝장치(25)또는 BLI26의사용을 포함한다. 이러한 디자인의 대부분은 트랜스듀서가 동물의 머리 위에 놓여있는 "하향식"시스템으로 동물이 자연적인 위치에 있습니다. '하향식' 워크플로우는수조 22,25,26 또는 물로 채워진 콘21,24로구성됩니다. 닫힌 콘 내부에 트랜스듀서를 사용하는 이점은 전체 워크플로우를 단순화하는 보다 컴팩트한 설치 공간, 짧은 설치 시간 및 직선 제거 가능성입니다.
마이크로 버블과 음향 필드의 상호 작용은 압력에 의존하며 저진폭 진동 (안정 캐비테이션이라고 함)에서 과도 기포 붕괴 (관성 캐비테이션이라고 함)27,28에이르기까지 다양합니다. 초음파-BBBD는 성공적인 BBBD를 달성하기 위해 안정적인 캐비테이션 임계값보다 훨씬 높은 음향 압력이 필요하다는 확고한 합의가 있지만 일반적으로 혈관/신경손상(29)과연관되는 관성 캐비테이션 임계값 미만이다. 가장 일반적인 모니터링 및 제어 형태는 McDannold 외12에서제안한 수동 캐비테이션 검출(PCD)을 사용하여 (백)산란된 음향 신호의 분석이다. PCD는 안정적인 캐비테이션 특징(고조파, 하모니, 초하모닉) 및 관성 캐비테이션 마커(광대역 응답)의 강도와 외관이 실시간으로 측정될 수 있는 마이크로 버블 방출 신호의 Fourier 스펙트럼 분석에 의존한다.
정밀압력제어를 위한 PCD 분석은 마이크로버블 제형의 다각성(진동 진폭은 버블 직경에 강하게 의존), 브랜드 간 버블 쉘 특성의 차이, 주파수 및압력(30,31,32)에크게 의존하는 음향 진동으로 인해 복잡하다. 그 결과, 이러한 모든 매개 변수의 특정 조합에 적응하고 다양한 응용 시나리오(작은 동물 프로토콜을 통해 시험관 내 실험에서 임상 사용을 위한 PCD에 이르기까지)에 사용되어 왔으며, 강력한 캐비테이션검출을 위해, 심지어 압력11,14,30,31, 31, 32,33, 33, 33의소급 피드백 제어를 위해 다양한 응용 시나리오에 사용되어왔다. 본 연구의 범위에 사용되는 PCD 프로토콜은 McDannold 외12에서 직접 파생되며 관성 캐비테이션 검출을 위한 안정적인 캐비테이션 및 광대역 소음의 존재를 모니터링합니다.
우리는 뇌 완두엽종으로 약물 전달을 증가시키기 위해 BBB의 일시적인 개방을위한 이미지 유도 신경 탐색 FUS 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 시판되는 구성 요소를 기반으로 하며 동물 시설에서 사용 가능한 이미징 기술에 따라 여러 가지 이미징 양식에 쉽게 적응할 수 있습니다. 높은 처리량 워크플로우가 필요하기 때문에 이미지 지도 및 치료 계획에 X선 및 BLI를 사용하기로 결정했습니다. 광단백질(예를 들어, 루시파아제)으로 유도된 종양 세포는 BLI이미징(20)에적합하다. 광단백질 기판의 투여 후, 종양 세포는 생체 내에서 모니터링될 수 있고 종양 성장 및 위치는20,36으로결정될 수 있다. BLI는 저비용 이미징 양상이며, 시간이 지남에 따라 종양 성장을 따를 수 있으며, 빠른 스캔 시간을 가지며 MRI36,37로측정된 종양 성장과 잘 연관된다. 우리는 설치류가 장착되는 플랫폼을 자유롭게 움직일 수 있도록 트랜스듀서에 부착된 수조를 수조로 교체하기로 결정했습니다8,24. 이 디자인은 (I) 소형 동물 스테레오테틱 플랫폼(II) 선및 광학 이미지 호환성(III) 급속 분리식 마취 마스크및 (IV) 통합 온도 조절 동물 가열 시스템을 모두 갖춘 분리형 플랫폼을 기반으로 합니다. 마취의 초기 유도 후, 동물은 전체 절차 동안 남아있는 플랫폼에 정확한 위치에 장착됩니다. 따라서 전체 플랫폼은 정확하고 재현 가능한 위치와 지속적인 마취를 유지하면서 전체 개입 워크플로우의 모든 스테이션을 전달합니다. 제어 소프트웨어는 fiducial 마커의 자동 감지를 허용하고 자동으로 이미지 및 이미지 양식의 모든 유형을 등록 (즉, 마이크로 CT, X 선, BLI 및 형광 이미징) 스테레오테틱 플랫폼의 참조 프레임에. 자동 교정 절차의 도움으로 초음파 트랜스듀서의 초점 거리는 개입 계획, 음향 전달 및 후속 이미징 분석의 자동 융합을 가능하게하는 내부에서 정확하게 알려져 있습니다. 도 1 및 도 2와같이 이 설정은 전용 실험 워크플로우를 설계하는 데 높은 수준의 유연성을 제공하며 다양한 스테이션에서 동물의 상호 처리가 가능하므로 높은 처리량 실험을 용이하게 합니다. 우리는 확산 중간 선 신경종과 같은 고급 신경교종의 마우스 xenografts에서 성공적인 약물 전달을 위해이 기술을 사용했습니다.
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Protocol
모든 생체 내 실험은 네덜란드 윤리위원회(면허 허가 번호 AVD11400202017841)와 네덜란드 브리제 유니버사이트트 암스테르담의 동물 복지 기구에 의해 승인되었습니다. 조사관은 동물의 불편함을 최소화하기 위해 FUS 시스템의 기본 교육을 받았습니다.
1. 집중 초음파 시스템
참고: 설명된 설정은 시판 되는 구성 요소를 기반으로 한 내부 구축 된 BBB 중단 시스템이며 3D 인쇄 된 사용자 정의 콘 및 분리 가능한 입체 플랫폼을 포함합니다. 이 시스템은 모듈식으로 설계되어 사용 가능한 장비 및 특정 용도에 따라 수정을 용이하게 합니다. 프로토콜은 마우스 두뇌의 pontine 지구에 있는 더 큰 지역의 sonoporing를 위한 절차를 설명합니다. 대상 위치를 조정 하 여, 뇌의 다른 부분을 대상으로 수 있습니다. 이 연구에서는 초점 길이75mm의 1MHz 모노 엘리먼트 트랜스듀서, 60mm의 조리개와 1.5 x 1.5 x 5mm(피크 압력의 FWHM)의 초점 영역이 사용되었습니다. 트랜스듀서의 초점 평면은 귀 막대와 교차하는 수평 평면에서 동물의 두개골을 통해 배치됩니다.
- 설치류에서 BBB 개구부에 적합한 트랜스듀서를 선택합니다.
참고: 마이크로버블 및 고용된 주파수의 특성에 따라 음향 설정, 특히 기계지수(MI)는13,38로변경될 수 있다. - 트랜스듀서를 3D 프린팅 원뿔에 놓습니다.
- 원뿔의 하단에 음향적으로 투명한 마일라 멤브레인을 사용하여 빔 전파 경로의 음향 결합을 달성하고 원뿔을 탈기물로 채웁니다.
- 도 1에 도시된 바와 같이 전동 선형 스테이지에서 동물 위에 트랜스듀서를 장착하여 트랜스듀서의 자동 수직 위치를 허용합니다.
- 도 1 및 도 2에도시된 바와 같이 온도 조절 가열, 물린 및 귀 바, 마취 및 다중 양식 유도 마커를 포함하는 연구의 요구 사항에 따라 분리 가능한 스테레오테틱 플랫폼을 설계한다. 스테레오전술 플랫폼의 장착은 2D 선형 스테이지 시스템으로 구성되어 있으며, 빔 아래 동물의 정확한 자동 포지셔닝(< 0.1mm)을 허용합니다.
- 트랜스듀서, 기능 발생기 및 파워 앰프로 구성된 도 1에 표시된 음향 방출 체인에 트랜스듀서를 연결합니다.
- 이미지 처리 파이프라인을 고안하여 바늘 하이드로폰에 의해 검출된 캐비테이션 데이터의 관심 영역과 수집의 두뇌 영역의 정확한 소포화 타겟팅을 허용하는 다중 양식 유도 마커를 검출한다.
- 시스템을 보정하고 스테레오테전술 플랫폼에서 동물의 수직 위치에 대응하여 트랜스듀서의 초점 점을 결정합니다.
2. 동물 준비
참고: 다음 프로토콜은 마우스에 대해 지정되지만 쥐에 맞게 조정할 수 있습니다. 이러한 실험을 위해 암컷 자티믹 누드 Foxn1-- 마우스(6-8주)가 사용되었다.
- 동물이 동물 시설에서 적어도 일주일 동안 적응하고 정기적으로 동물의 무게를 허용합니다.
- 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 피하(s.c.) 주사를 통해 FUS 치료 30분 전에 진통 치료를 시작한다.
- 동물을 3% 이소플루란, 2 L/min O2로 마취시키고 동물이 심히 마취되었는지 확인합니다. 전체 절차 동안 마취 된 동물을 유지하고 필요에 따라 이소플루란의 농도를 조정하기 위해 호흡 빈도와 심박수를 모니터링하십시오.
- 안구 건조증을 방지하고 가능한 부상을 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 면도기와 탈필 크림으로 머리 위에 있는 머리카락을 제거하고 물로 씻어 피부에 자극을 피하기 위해 잔류물을 제거합니다.
- BLI 종양 모델을 실험하기 위해 BLI 이미지 지도를 위한 29 G 인슐린 주사기와 함께 D-루시페린(30 mg/mL) 내역(i.p.)의 150 μL을 주입한다.
- 26-30 G 꼬리 정맥 카테터를 삽입하고 소량의 헤파린 용액 (5 UI / mL)으로 카테터와 정맥을 플러시하십시오. 혈연을 피하기 위해 헤파린 용액으로 카테터를 채웁니다.
참고 : 카테터에 혈액의 역류가있을 때 좋은 카테터 삽입이 보입니다. 색전을 방지하기 위해 카테터의 기포를 피하십시오. 과도한 사출 압력을 피하려면 카테터의 길이가 가능한 한 짧는지 확인하십시오. - 저체온증을 피하기 위해 온도 조절 된 입체 플랫폼에 동물을 놓습니다.
참고: 저체온증은 혈액 순환을 감소시켜, 이는 마이크로 버블의 주사/순환과 약물의약동학(39)에영향을 미칠 수 있다. - 이어 바와 바이트 바를 사용하여 고정 및 고정 플랫폼에서 동물의 머리를 고정하고 고정합니다. 스트랩으로 몸을 고정하고 동물의 꼬리를 플랫폼에 테이프로 붙입니다.
3. 생체 내 이미지 유도 중심 초음파
참고: 이 프로토콜의 경우 10ms 지속 시간이 있는 톤 버스트 펄스가 있는 1MHz 모노 엘리먼트 트랜스듀서, 0.4의 MI 및 240s에 대해 40사이클이 있는 1.6Hz의 펄스 반복 주파수가 사용되었습니다. 이 프로토콜은 무해한 가스로서 유황 헥사플루오라이드(SF6)를함유한 인지질에 의해 안정화된 마이크로버블에 최적화되어 있으며, 이에 따라 평균 기포 직경은 2.5 μm이고 기포의 90% 이상이 8 μm보다 작다.
- 이미징 양식(예:BLI 또는 X선)에 장착된 동물과 함께 스테레오전술 플랫폼을 배치하고 동물의 이미지를 촬영합니다.
- 이미지 처리 파이프라인과 함께 다중 양식 서두마커를 사용하여 트랜스듀서의 초점 지점에 따라 동물의 위치를 표시합니다.
- 획득한 X선 영상 위에 뇌 윤곽을 배치하거나 BLI 영상을 사용하여 종양의 중심을 결정함으로써 표적 영역을 결정한다(도2). 뇌의 특정 부분의 위치는 참조 점으로 두개골 표시 bregma와 람다를 사용하여 Paxinos 뇌 아틀라스40에 지정됩니다. 예를 들어 폰은 람다에서 x=-1.0, y=-0.8 및 z=-4.5에 있습니다.
- 초음파 젤이 호흡을 방해하는 것을 방지하기 위해 동물의 콧구멍과 입을 접착제 테이프로 보호합니다.
- 동물의 머리 위에 초음파 젤을 바르세요.
- 동물의 목의 피부를 철회하고, 초음파 젤로 바늘 수압을 윤활하고, 후두 뼈의 바로 근처에 바늘 수중전화를 놓습니다.
- 이미지 처리 파이프라인과 포커스 포인트를 사용하여 트랜스듀서를 올바른 위치로 안내합니다.
- 미리 구성된 설정을 연결된 모든 장치에 적용하고 관심 있는 뇌 영역을 타겟팅합니다.
참고: 연구 질문에 따라 종양 또는 뇌 영역은 도 2에도시된 바와 같이 단일 초점 또는 체적 모양으로 포포화될 수 있다. - 제조업체에서 설명한 대로 마이크로 버블을 활성화합니다. 마이크로 버블 120 μL (5.4 μg)의 볼러스 하나를 주입합니다.
- 카테터의 개구부를 확인하기 위해 식염수로 꼬리 정맥 카테터를 플러시하십시오.
- 마이크로 버블을 주입하고 소네이션을 시작합니다.
- 바늘 하이드로폰으로 마이크로 버블 캐비테이션을 기록합니다.
- 소포화 후 내항제 또는 약물을 투여한다. 복용량, 타이밍 및 계획 연구 와 약물의 목적에 따라 달라 집니다.
참고: 에반스 블루는 BBB 오프닝41을평가하는 일반적인 색상 에이전트입니다. - 미리 정해진 시점 또는 인도적 끝점 앞까지 동물을 모니터링합니다.
4. 마이크로 버블 캐비테이션 분석
참고: 여기에 적용 된 절차는 원래 McDannold et alal al 12에의해 제안 된 바와 같이, 1MHz의 주파수에서 10 ms 지속시간의 버스트 톤 펄스로 흥분 2.5 μm (8 μm 아래 기포의 80 %)의 평균 직경2.5 μm (8 μm 이하의 기포의 80 %)에 대한 생체 내 실험에 적합하다.
- Fourier는 시간 도메인에서 기록된 PCD 신호를 주파수 도메인으로 변환합니다.
- 그림 3(2MHz 및 3MHz의 녹색 상자)에 도시된 바와 같이2nd 및3rd 고조파(± 50kHz) 주변의 안정적인 캐비테이션 감지를 위한 결과 스펙트럼 전력을 통합합니다.
- 도 3(빨간 상자)에 도시된 바와 같이 주 주파수,2nd,3rd 고조파,1st 및2nd 초하모닉 및 첫 번째 서브 고조파(± 150kHz) 사이에 관성 캐비테이션 검출을 위한 스펙트럼 전력을 통합한다.
- 이전에 획득한 PCD 신호의 정규화를 위해 원리 주파수(1MHz ± 50kHz)를 중심으로 스펙트럼 전력을 통합합니다.
참고: PCD 신호는 1MHz에서 생체 내 의 SF6-인지질마이크로 버블에 대해, 도 3에도시된 바와 같이 관성 캐비테이션 이에 설정되기 전에 초하모닉 또는 하모니를 표시하지 않는다.
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Representative Results
설명된 FUS시스템(도 1 및 도 2)및 관련 워크플로우가 100마리 이상의 동물에서 사용되었으며 건강한 마우스와 종양 베어링 마우스 모두에 대한 재현 가능한 데이터를 생성하였다. 마이크로버블 볼루스 주입의 피크 순간에 고조파에서 기록된 캐비테이션 및 스펙트럼 밀도에 기초하여, 각 주파수의 스펙트럼 전력은 프로토콜의 4단계에서 설명된 바와 같이 Fourier 분석을 사용하여 계산될 수 있다. 마이크로버블과 결합하여 0.4의 MI를 가진 음향 프로토콜(1MHz, 10ms 펄스 지속시간)을 기반으로,2nd 및3rd 고조파에서 정규화된 통합 전력 스펙트럼은 도 3에서관찰된 흥분 주파수의 통합 전력 스펙트럼을 정규화하였다. 이는 마이크로버블을 주입하지 않았거나 0.6의 MI가 적용될 때 관성 캐비테이션의 관찰이 없을 때 서브하모닉의 검출이 없는 것과 비교하여 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 안정적인 캐비테이션 검출 수단을 제공했다. 관성 캐비테이션의 경우 최대 25dB의 광대역 소음 층이 증가하고 초고조파 및 하모니닉이 발견되었습니다. MI의 음향 압력은 0.4와 0.6의 음향 적 손상으로 인해 거시적 인 손상이 발생하지 않았지만, 그림 4에나타난 것처럼 현미경 손상은 0.6의 MI에서 조직학적으로 입증되었습니다. 0.8의 MI까지 압력 진폭의 추가 증가는 적혈구의 사치와 더 큰 혈관및 넓은 확산 조직 용액의 거시적인 두뇌 출혈귀착되었습니다. 조직학적 발견은 도 3에도시된 바와 같이 수동 캐비테이션 센서로부터의 음향 데이터에 대응하여 뇌 조직의 관성 캐비테이션의 손상 특성을 확인한다. 그 결과, 0.4의 MI는11전에관찰된 바와 같이 관성 캐비테이션 정권에 안전한 마진을 제공하면서 매우 재현 가능한 BBB-opening을 제공하는 안전한 압력 진폭으로 선택되었다.
정맥 에반스 블루는 폰틴 지역에서 BBB의 개방을 확인하기 위해 주입되었다. 에반스 블루의 강력한 알부민 결합은 66 kDa42이상의 큰 분자로 이어집니다. 폰의 수준과 부분적으로 소뇌, 에반스 블루-컨쥬게이트 알부민의 사치는 마이크로버블이 없는 마우스와 는 대조적으로 FUS 및 마이크로버블로 처리된 마우스에서 관찰되었다(도5). 이는 사내 빌드 FUS 시스템과 설명된 프로토콜을 통해 이미지 유도 스테레오테네이션을 기반으로 관심 영역의 정확한 타겟팅을 강조합니다.
그림 1: 집중 초음파 설정.
(A)집중 초음파 설정의 회로도 표현. (B)집중 초음파 설정의 사진. 이 시스템은 자동 3D 포지셔닝을 위해 두 번째 2D 단계에 걸쳐 1D 선형 스테이지의 하향식 장착 트랜스듀서로 구성됩니다. 트랜스듀서는 물로 채워진 빔 콘으로 제작되어 음향적으로 투명한 마일라 멤브레인으로 바닥에 닫혀 동물의 두개골에 사운드를 수행합니다. 트랜스듀서는 신호 생성을 위해 임의파형 발생기(AWG)에 차례로 연결된 전력 증폭기에 연결됩니다. 캐비테이션 검출을 위해 저소음 전압 증폭기와 함께 탈착식 하이드로폰이 사용됩니다. 하이드로폰은 후두 뼈의 바로 근처에 배치됩니다. 외부 하이드로폰은 2mm 활성 표면을 가지며 초음파 젤과 음향적으로 결합되어 있습니다. 각성의 고전압 신호와 기록된 캐비테이션 신호는 모두 표준 200MHz 오실로스코프에 의해 디지털화되고 즉석 처리 및 실시간 제어를 위해 제어 컴퓨터(도시되지 않음)에 중계됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 집중 초음파 워크플로우.
집중 초음파 시스템의 제안 된 워크플로우는(A)분리 가능한 스테레오전술 플랫폼에서 동물의 초기 위치로 시작하여 음향 커플링 젤 (적용 된 BLI / X 선)의 적용을 주목합니다. 동시에 다중 모달 이미징은 타겟팅을 위해 수행 될 수있다. (B)처음에는 엑스레이 이미징이 가능하지만, 관심 영역은 뇌의 윤곽선의 도움으로 표적으로 삼을 수 있지만(차례로 마우스 뇌 아틀라스(40)에 참조되어 두개골의 크기와 자세에 적응한다. (C)대안적으로, X선 최대 강도 투영에 겹쳐진 루시파래아제 전감염 확산 중성 신경종 종양의 BLI 영상을 표적화에 적용할 수 있다. (D)그 후, 스테레오테틱 플랫폼은 하이드로폰과 트랜스듀서가 부착된 치료 위치에 있는 동물과 함께 장착된다. 트랜스듀서는 자동으로 치료 위치에서 구동하고 선택한 궤적 후 볼루스 주입을 초음파 처리합니다. 이 시스템은 높은 처리량 실험에 최적화되어 있으며, 이에 따라 여러 플랫폼이 상단에 표시된 것처럼 인터리브 작업을 허용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 캐비테이션 모니터링.
(A)1MHz에서 0.4의 MI에서 마이크로버블 관리스테이션이 없는 생체내 실험의 주파수스펙트럼(B)은마이크로버블의 주입 후 피크볼루스에서 대응하는 스펙트럼을 나타낸다. 마이크로 버블의 안정적인 캐비테이션을 나타내는 높은 고조파의 증가를 유의하십시오. (C)마이크로버블 주입과 함께 0.6의 높은 MI에서 관찰된 해당 스펙트럼은 관성 캐비테이션의 발병으로 의전 대역 내에서, 최대 25dB의 소음 바닥의 증가와 초하모닉 및 하모니닉의 출현을 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: BBB 개폐 및 관련 히스토로지.
(A)0.4의 MI를 사용하여 안정적인 캐비테이션은 백색광 대시검사와 HE 염색 현미경 검사법 모두에서 손상되지 않은 뇌 완두엽을 입증하였다. (B)MI가 0.6의 첫 징후후 뇌의 돌이킬 수 없는 조직 손상은 HE 염색 조직학적 데이터에서 명백해지고 있다. (C)MI 0.8의 더 높은 기계적 압력의 경우, 거시적 출혈은 뇌 의 반골 세포의 광범위한 조직 용해뿐만 아니라 미세 출혈로 인한 적혈구의 사치가 명백합니다. 백색광 대시칼법의 파란색 색조는 BBB 개방을 나타내는 혈관 내 조영제 에반스 블루의 사치를 나타냅니다(처탈 뷰의 경우 도 5 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: BBB 개방 유효성 검사.
안정된 캐비테이션정권(B)에서성공적인 BBB 개구부를 도모하여 대조군(A)에 비해, 마이크로버블이 주입되지 않았다. 이 경우 에반스 블루는 내트라바스내 조영제로 사용되었습니다. 에반스 블루의 강력한 알부민 결합은 66 kDa 이상의 큰 분자로 이어집니다. 결과적으로, 에반스 블루 사치의 증거는 단단한 접합의 (부분) 개방으로 인해 BBB를 가로 질러 세포사포 수송을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는, 우리는 뇌 parenchyma로 증가한 약 납품을 위한 일시적인 BBB 중단을 위한 비용 효과적인 이미지 유도한 기지를 둔 FUS 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 주로 시판되는 구성 요소와 X 선 및 BLI와 함께 제작되었습니다. 제안된 설계의 모듈화를 통해 고처리량 워크플로우에서 계획 및 평가를 위한 여러 이미징 모듈을 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 고해상도 MRI 또는 마이크로 CT와 같은 보다 포괄적인 고해상도 3D 이미징 양식과 결합될 수 있으며, 2D X선 및/또는 BLI와 같은 연구의 대부분에 대해 사용된다. 2D X선 및/또는 BLI는 각각의 짧은 획득 시간으로 인해 훨씬 더 비용 효율적일 뿐만 아니라 대량 연구에 이상적입니다. 여기에 설명 된 트랜스듀서는 뇌의 깊은 부분 (1.25의 f 수)에서 더 넓은 영역 (마우스 뇌의 규모)에서 BBBD를 생산하는 데 적합합니다. 우리는 폰틴 영역43,44에서확산 성장 종양을 위한 시스템을 이용했습니다. 이들 지역에 대해 폰의 전체 종양 부위를 포괄하는 더 큰 부피가 충만화될 필요가 있다. 모듈형 시스템은 뇌의 더 많은 우세한 부분에서 다른 유형의 뇌종양에 쉽게 조절할 수 있습니다. 트랜스듀서 유형을 결정하기 위해 하나는 f-번호, 초점 거리 및 주파수를 고려해야 합니다.
전체 적인 디자인은 이전에 제안 된 디자인에 비해 두 가지 개선을 제안합니다. (I) 수조는 종종 치료 시스템의 초음파 파 전달에 사용됩니다. 작은 동물의 경두개 응용 프로그램의 경우 이러한 유형의 설계로 인해 동물이11,22,25에부분적으로 침수되는 더 크고 반전된 설정이 생성됩니다. 이러한 디자인은 일반적으로 작은 동물 연구의 범위에서 매우 잘 작동하지만, 사용 중 설정 시간, 휴대성 및 현실적으로 유지 관리 가능한 위생 표준에 대한 타협입니다. 특히 후자는 면역 손상 된 동물과 따라서 엄격한 위생 기준을 포괄하는 범위 연구에서 상당한 중요성이다. 그 결과, 보다 컴팩트한 설치 공간, 짧은 설치 시간, 쉬운 오염 제거 가능성 및 전체 워크플로우 동안 동물의 자연스러운 위치를 갖춘 시스템을 설계하기 위해 "하향식" 설계가 선택되었습니다. (II) 이전에 설명된 여러 설계와 다른 두 번째 설계 선택은 음향 전달 시스템의 직접 통합을 MRI 또는 마이크로 CT15,17,18,19,45와같은 의료 영상 시스템에 생략하는 것이었다. 완전히 통합된 시스템은 제한된 수의 동물에 대한 종방향 약동학 연구 또는 탐사 연구에 이상적이지만, 이러한 설정은 일반적으로 상당히 증가된 복잡성, 높은 실행 비용 및 숙련된 운영자의 필요성으로 인해 대량 약리학 연구에 적합하지 않습니다. 더욱이, 그러한 시스템은 일반적으로 하나의 이미징 양식으로 제한됩니다. 결과적으로, 여기에서 제안된 디자인은 여러 이미징 양식(마이크로 CT, 작은 동물 MRI, 다양한 BLI/형광 카메라, 통합 된 X 선 이미징 유무)과 호환되는 모듈식 분리형 입체 플랫폼에 의존하며, 또한 모든 이미지 데이터의 자동 융합을 위한 다단계 선유도 마커를 제공합니다.
실질적인 고려 사항과 관련하여 절차에서 가장 중요한 실패 지점은 제한된 수명과 연약한 특성으로 인해 마이크로 버블의 안정성입니다. 우리는 다음 논의가 인지질에 의해 안정화되고 유황 헥사플루오라이드 (SF6)를함유하는 마이크로 버블이 무해한 가스46,47로포함하는 반면, 다른 마이크로 버블 제형은 일반적으로 다른 특성을 표시할 것이라는 점을 강조하고 싶습니다.
마이크로 버블 주입 전에 타이밍 : 재수분 후 시판되는 마이크로버블의 보급 수명은 3시간에서 4시간 사이입니다. 이것은 진단 초음파 응용 프로그램에 적합하지만, 이 기간 동안 마이크로 버블은 지속적으로 가스를 잃고 결과적으로 평균 거품 직경은 2.5 μm의 초기 평균 크기에서 연속 하향 드리프트의 대상이된다는 점에 유의해야한다. 초음파 매개 BBBD와 같은 치료 응용 프로그램의 경우 안정적인 캐비테이션 (주어진 주파수 및 압력에서)의 진동 진폭과 관성 캐비테이션의 발병 임계 값은 또한 연속 드리프트의 직접적인 결과로 서있기 때문에 훨씬 더 엄격한 타이밍 -필수를 의미합니다. 우리의 경험에서, 우리는 마이크로 버블이 이전보고48과유사한 재현 가능한 결과를 얻기 위해 재수화 후 30 분 이내에 가장 잘 사용되는 것을 관찰했다.
마이크로 버블 주입 후 타이밍 : 더 큰 영장류에서, 시판되는 SF6-인지질마이크로버블은 약 6분의 혈장 제거 반감기를 표시하고 투여가스의 80% 이상이 폐를 통해 11분48분만에 내뿜는다. 생쥐와 쥐와 같은 작은 포유동물에서 생체내 마이크로버블의 이 모형의 혈장 제거 반감기는 90-120초로 인해 심박수가 높기 때문에 상당히 짧다20. 그 결과, 공수 주입 후 마이크로버블 농도의 급속한 역동성과 빠른 후속 플라즈마 제거와 버블의 연속 가스 부피 손실과 결합된 빠른 후속 플라즈마 제거는 3-4분 후 주입 후 짧은 기간 내에 재현 가능한 결과를 얻기 위해 초음파 처리/주입 프로토콜에 엄격한 타이밍 요구 사항을 부과한다. 더 긴 절차 또는 더 광범위한 양의 BBBD는 바람직하게는 마이크로 버블의 지속적인 투여가 필요합니다. 그러나, 이러한 접근법은 주사기와 급식 시스템 모두에서 기포의 부력에 의해 복잡하며, 또한 필요한 주입 튜브에 의해 상당히 증가한 죽은 부피를 소개한다. 우리의 경험에서 총 사출 볼륨을 분할의 간단한 솔루션 2 받는 것 3 작은 하위 복용량 강력하고 재현 가능한 결과 제공.
또한, 마이크로 버블은 매우 압력에 민감하고 주입 하는 동안 높은 정압 따라서 권장 하지 않습니다. 큰 바늘 (>19 G)는 플라스틱 튜브로 마이크로 버블의 전송또는 주사기(49)와마이크로 버블을 그리는 것이 좋습니다. 마우스26-30 G 바늘에서 i.v. 주사를 권장하는; 더 큰 바늘은 꼬리 정맥에 삽입하는 것이 더 어렵기 때문에. 26 G 바늘은 이 바늘로 정압이 낮기 때문에 권장됩니다. 그러나, 어려운 정맥 접근의 경우 30 G 바늘을 권장합니다.
마우스의 두개골은 초점에서 압력 진폭을 크게 낮추는 압력 진폭의 중요한 감쇠기입니다. 감쇠는 트랜스듀서의 주파수및 초음파 파가 전파되는 매체의 밀도에 의해 결정된다. 높은 초음파 주파수및 높은 조직 밀도, 뼈 와 같은 높은 감쇠결과. 압력 진폭은 부분적으로 뼈에 의해 흡수되고 일부 압력 진폭은 반사 및 산란50에의해 손실됩니다. 우리의 실험에서 우리는 마우스 시체에서 1 MHz에서 감쇠가21,50이전에 표시된 것과 같이 0.9mm의 평균 두개골 두께와 14.5 ± 1.3 dB / cm임을 결정했습니다. 미세 버블은 안정적인 캐비테이션 및 관성 캐비테이션 동안 뚜렷한 음향 배출을 반영하기 때문에 캐비테이션 모니터링을 권장합니다. 광대역 방출은 관성캐비테이션(12)에대한 뚜렷한 음향 방출이다. 실시간 모니터링을 통해 관성 캐비테이션을 감지하고 그에 따라 압력 진폭을 낮추어 조직 손상을 피할 수 있습니다.
이전 보고서는 달성 된 BBB 투과성11, 31에마취의 유형의 영향을 설명했다. 이소플루란 기반 마취의 경우 혈관 확장은 뇌혈류의 약간의 감소와 관련된 마취 개시 직후발생합니다. 더욱이, 장기간 에 걸쳐 마취, 특히 온도 안정화의 부재에서, 감소 된 심박수로 이끌어 냅니다. 두 요인 모두 잠재적으로 마이크로 버블 또는 공동 투여 약물의 대뇌 농도의 더 큰 분산으로 이어질 수 있기 때문에 엄격한 마취 프로토콜은 재현 가능한 결과를 달성하는 것이 좋습니다51. 콘스탄티니데스 외51의조언에 따라 35 내지 45분 동안 2L/min 산소에서 1.5% v/v 이소플루란을 가진 마취는 문제가 되지 않았다. McDannold 등과는 대조적으로 이 가스 혼합물이 특정 유형의 마이크로 버블과 병치가 문제가 있음을 보여주었습니다52,우리는 마이크로 버블의이 유형에 주목할만한 문제를 관찰하지 않았습니다. 또는, 동물은 알려진 혈관 활성 효과가 없는 케타민/자일라진의 혼합으로 마취될 수있다(53).
요약하자면, 여기에 설명된 이미징 유도 BBB-개방 기술은 제안된 워크플로우의 효율성을 입증한 대량 전임상 약물 평가 연구에 사용되어 왔다. 따라서 높은 수준의 자동화로 인해 짧은 교육을 받은 후 비기술 인력이 시스템을 운영할 수 있습니다. 이를 통해 설정의 단순성과 함께 높은 수준의 표준화가 발생하여 실험 재현성을 보장하고 그룹 내 가변성을 감소시켜 필요한 샘플 크기를 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 KWF-STW (어린 시절 확산 본질적인 Pontine 신경교종 및 고급 신경교종에서 소노포레이션에 의한 약물 전달)에 의해 투자되었습니다. 우리는 일리아 스카흐코프와 찰스 무게노가 시스템 개발에 대한 그들의 의견에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
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