Summary
血脑屏障 （BBB） 可以通过微泡介导的聚焦超声波 （FUS） 暂时中断。在这里，我们描述了一个逐步协议的高通量BBB打开体内使用模块化FUS系统，为非超声专家访问。
Abstract
血脑屏障 （BBB） 是治疗各种脑部疾病的主要障碍。内皮细胞，通过紧密的结点连接，形成生理屏障，阻止大分子（>500 Da）进入脑组织。微泡介导聚焦超声波 （FUS） 可用于诱导局部 BBB 开口，使较大的药物进入大脑帕奇马。
除了用于临床翻译的大型临床设备外，药物候选者治疗反应评估的临床前研究还需要专门的小型动物超声波设置，以便有针对性地打开 BBB。最好是，这些系统允许高吞吐量的工作流，既具有高空间精度，也可进行集成气穴监测，同时在初始投资和运行成本方面仍然具有成本效益。
在这里，我们展示了一个生物发光和X射线引导立体定向小型动物FUS系统，该系统基于市售组件，满足上述要求。特别强调高度自动化，以促进在大量药物前药物评估研究中通常遇到的挑战。这些挑战的例子是需要标准化，以确保数据可重复性，减少组内变异性，减少样本量，从而符合道德要求，减少不必要的工作量。拟议的BBB系统已在BBB开放范围内得到验证，方便了对患者衍生的胶质母细胞瘤多形式和弥漫中线胶质瘤模型的药物输送试验。
Introduction
血脑屏障 （BBB） 是药物输送到大脑帕伦奇马的主要障碍。大多数已经开发的治疗药物不会越过BBB，因为他们的物理化学参数（如嗜脂，分子量，氢键接受者和捐赠者），或不保留，因为他们的亲和力在大脑1，2的外流运输器。能穿过BBB的一小群药物通常是小脂质分子，它们只对数量有限的脑部疾病1、2有效。因此，对于大多数脑部疾病，药理治疗的选择是有限的，需要新的药物输送策略3，4。
治疗超声波是一种新兴技术，可用于不同的神经学应用，如BBB中断（BBBD），神经调节，和消融4，5，6，7。为了通过颅骨实现BBB开口，通过颅骨发射器，聚焦超声波（FUS）与微泡结合。微泡介导的FUS导致大脑中药物的生物利用率增加，第5、8、9。在声波的存在下，微泡开始振荡，引发转细胞化，并破坏BBB内皮细胞之间的紧密交汇点，使较大的分子10的准细胞传输。先前的研究证实了声学发射的强度与生物对BBB开口11、12、13、14的生物影响之间的相关性。FUS与微泡结合已用于临床试验，用于治疗胶质母细胞瘤，使用特莫佐洛米德或脂质多索鲁比辛作为化疗剂，或用于治疗阿尔茨海默氏症和肌萎缩性侧索硬化症5，9，15，16。
由于超声波介质 BBB 的开启为药物治疗提供了全新的可能性，因此需要临床翻译的临床前研究来评估选定药物候选者的治疗反应。这通常需要具有高空间精度的高吞吐量工作流，最好是用于监控具有高可重复性的定向 BBB 开口的集成腔检测。如果可能，这些系统在初始投资和运行成本方面都需要具有成本效益，以便根据研究规模进行扩展。大多数前CFUS系统都与MRI相结合，用于图像指导和治疗规划15、17、18、19。虽然MRI提供了有关肿瘤解剖学和体积的详细信息，但它是一种昂贵的技术，通常由训练有素/熟练的操作员执行。此外，高分辨率MRI可能并不总是可供药物前设施的研究人员使用，并且需要每个动物长时间的扫描时间，因此它不太适合高通量的药理学研究。值得注意的是，对于神经肿瘤学领域的前科研究，特别是渗透肿瘤模型，可视化和瞄准肿瘤的可能性对于治疗成功至关重要。目前，这一要求仅通过 MRI 或用光蛋白转化的肿瘤来实现，从而实现生物发光成像 （BLI） 与光蛋白基板管理相结合的可视化。
MRI制导的FUS系统通常使用水浴来确保超声波传播用于颅面应用，即动物的头部部分淹没在水中，即所谓的"自下而上"系统15、17、18。虽然这些设计在较小的动物研究中通常效果良好，但在动物准备时间、便携性和实际可维护的卫生标准之间是一种妥协。作为核磁共振成像的替代方案，立体定向导航的其他制导方法包括使用啮齿动物解剖图集21、22、23、激光笔辅助目视24、针孔辅助机械扫描装置25或BLI26。这些设计大多是"自上而下"的系统，其中传感器被放置在动物的头顶上，动物处于自然位置。"自上而下"的工作流程包括22、25、26或充满水的圆锥体21、24。在封闭的圆锥体内使用传感器的好处是更紧凑的占地面积、更短的设置时间和直接的净化可能性简化了整个工作流程。
声场与微泡的相互作用是压力依赖的，范围从低振幅振荡（称为稳定气泡）到瞬态气泡崩塌（称为惯性气泡）27，28。有一个既定的共识，超声波BBBD需要一个声压远远高于稳定的气穴阈值，以实现成功的BBBD，但低于惯性气泡阈值，这通常与血管/神经损伤29。最常见的监测和控制形式是分析（背）散发出声信号使用被动腔检测（PCD），如麦克丹诺德等人建议的12。PCD 依赖于微泡发射信号的 Fourier 光谱分析，其中稳定气泡特征（谐波、亚和声波和超谐波）和惯性气泡标记（宽带响应）的强度和外观可以实时测量。
由于微泡配方的多散射性（振荡幅度强烈取决于气泡直径）、品牌间气泡壳特性的差异以及声学振荡（这在很大程度上取决于频率和压力30、31、32），用于精确压力控制的"一刀切"PCD 分析变得复杂。因此，提出了许多不同的PCD检测方案，这些协议已适应所有这些参数的特定组合，并已用于各种应用方案（从体外实验小动物协议到PCD用于临床使用），用于强力气穴检测，甚至用于压力11、14、30、31、32、33、34、35的追溯性反馈控制。本研究范围内采用的PCD协议直接来自麦克丹诺德等人12，并监测谐波发射是否存在稳定的空腔和宽带噪声，用于惯性气穴检测。
我们已经开发了一个图像引导神经导航FUS系统，用于BBB的短暂打开，以增加药物输送到大脑的帕奇马。该系统基于市售组件，可根据动物设施中可用的成像技术轻松适应多种不同的成像方式。由于我们需要高通量工作流程，我们选择使用 X 射线和 BLI 进行图像指导和治疗规划。用光蛋白（如红素酶）转化的肿瘤细胞适合BLI成像20。光蛋白基底施用后，肿瘤细胞可在体内监测，肿瘤生长和位置可确定20、36。BLI是一种低成本的成像方式，它能够随时间跟随肿瘤生长，具有快速的扫描时间，它与MRI36，37测量的肿瘤生长密切相关。我们选择用一个装满水的锥体代替水浴池，以灵活地移动安装啮齿动物的平台。设计基于一个可拆卸平台，配备集成了（I）小动物立体定向平台（II）与X射线和光学图像兼容性（III）快速可拆卸麻醉面膜和（IV）集成温度调节动物加热系统。麻醉后，动物被安装在平台上的精确位置，在整个过程中，它仍然存在。因此，整个平台通过整个干预工作流程的所有站点，同时保持准确和可重复的定位和持续麻醉。控制软件允许自动检测假象标记，并自动将所有类型的图像和图像模式（即微CT、X 射线、BLI 和荧光成像）注册到立体定向平台的参考框架中。在自动校准程序的帮助下，超声波传感器的焦距在内部被精确认识，从而实现了介入规划、声学传输和后续成像分析的自动融合。如图1和图2所示，该设置提供了高度的灵活性，设计专用的实验工作流程，并允许在不同的站点交错处理动物，从而促进高通量实验。我们已使用这项技术成功地在小鼠异种移植的高档胶质瘤，如弥漫中线胶质瘤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有体内实验均由荷兰伦理委员会（许可证编号AVD114002017841）和荷兰阿姆斯特丹Vrije大学动物福利机构批准。调查人员接受了FUS系统基础知识的培训，以尽量减少动物的不适。
1. 聚焦超声波系统
注：描述的设置是基于市售组件的内部构建的 BBB 中断系统，包括一个 3D 打印定制圆锥体和可拆卸立体声平台。该系统设计为模块化，可根据现有设备和特定用途进行修改。该协议描述了小鼠大脑庞廷区域较大区域的声波化过程。通过调整目标位置，大脑的不同部分可以成为目标。在这项研究中，使用了1兆赫单元素传感器，焦距为75毫米，光圈为60毫米，焦区为1.5 x 1.5 x 5毫米（峰值压力的FWHM）。传感器的焦点平面通过动物的颅骨定位在与耳栏相交的水平平面上。
- 为啮齿动物的 BBB 开口选择合适的传感器。
注：根据微泡的特性和使用频率，声学设置，特别是机械指数（MI），可能会发生变化13，38。 - 将传感器放在 3D 打印的圆锥体中。
- 在圆锥体的底端采用声学透明的 mylar 膜，实现光束传播路径的声学耦合，并在圆锥体中填充脱气水。
- 将传感器安装在动物上方的机动线性阶段，如 图 1 所示，允许自动垂直定位传感器。
- 根据研究的要求设计一个可拆卸的立体定向平台，包括温度调节加热、咬合和耳栏、麻醉和多模式的纤维标记，如 图 1 和图 2所示。立体定向平台的安装由二维线性舞台系统组成，允许在光束下精确自动定位（< 0.1 毫米）动物。
- 将传感器连接到 图 1 中显示的声学发射链，该链由传感器、函数发生器和功率放大器组成。
- 设计一个图像处理管道来检测多模式的假象标记，使精确的声波瞄准感兴趣的大脑区域，并收集针水听器检测到的腔化数据。
- 校准系统并确定转导器对应动物在立体定向平台上的垂直定位的焦点。
2. 动物制备
注：以下协议为小鼠指定，但可以适应大鼠。对于这些实验，使用雌性水性裸体Foxn1-/-小鼠（6-8周大）。
- 允许动物在动物设施中适应至少一周，并定期称体重。
- 通过皮下注射（s.c.）注射30分钟之前，FUS治疗开始镇痛治疗，管理丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。
- 用3%异氟兰、2L/min O2 麻醉动物，验证动物是否深度麻醉。在整个过程中保持动物麻醉，并监测呼吸频率和心率，根据需要调整异氟素的浓度。
- 涂抹眼药膏，防止眼睛干燥，避免可能的伤害。
- 用剃须刀和脱毛霜去除头顶上的头发，然后用水清洗，以去除任何残留物，以避免对皮肤造成刺激。
- 对于BLI肿瘤模型的实验，注射150微L的D-露西芬（30毫克/mL）腹膜内（即.p.），用29G胰岛素注射器进行BLI图像指导。
- 插入 26-30 G 尾静脉导管，用少量肝素溶液（5 UI/mL）冲洗导管和静脉。用肝素溶液填充导管，以避免血液凝固。
注意：当血液倒流到导管中时，可以看到良好的导管。避免导管中的气泡，以防止浮雕。为了避免过多的注射压力，请确保导管的长度尽可能短。 - 将动物放在温度调节立体定向平台上，以避免体温过低。
注：体温过低可减少血液循环，可影响微泡和药物动力学的注射/循环。 - 使用耳栏和咬伤杆固定和固定立体定向平台上的动物头部。用带子固定身体，将动物的尾巴绑在平台上。
3. 体内图像引导聚焦超声波
注意：对于此协议，使用了 1 MHz 单元素传感器，其音冲脉冲持续时间为 10 ms，MI 为 0.4，脉冲重复频率为 1.6 Hz，240s 周期为 40 个周期。该协议被优化为微泡稳定含有硫六氟化物（SF6）作为无害气体，其中平均气泡直径为2.5微米，超过90%的气泡小于8微米。
- 将立体定向平台与安装的动物置于成像模式（如 BLI 或 X 射线）中， 并拍摄动物的图像。
- 使用多模式的假象标记与图像处理管道相结合，根据传感器的对焦点标记动物的位置。
- 通过在获得的 X 射线图像上放置大脑轮廓或使用 BLI 图像确定肿瘤中心（图 2）来确定目标区域。大脑特定部位的位置在Paxinos大脑图集40 中使用头骨标记布雷格玛和兰姆达作为参考点。例如，庞斯位于 x=-1.0，y=-0.8 和 z=-4.5 从兰姆达。
- 用胶带屏蔽动物的鼻孔和嘴部，防止超声波凝胶干扰呼吸。
- 在动物的头顶上涂抹超声波凝胶。
- 缩回动物颈部的皮肤，用超声波凝胶润滑针水听器，并将针水听器放在眼骨的直接附近。
- 使用图像处理管道和对焦点引导传感器到正确的位置。
- 将预配置设置应用到所有附加设备上，并针对感兴趣的大脑区域。
注：根据研究问题，肿瘤或脑区域可以作为单个焦点或体积形状，如 图2所示。 - 激活制造商描述的微泡。注入一个120微L（5.4微克）微泡的博卢斯。
- 用盐水冲洗尾静脉导管，检查导管的开口。
- 注入微泡并开始共振。
- 用针水听器记录微泡腔。
- 声波手术后施用血管内对比剂或药物。剂量、时间和计划取决于研究的目的和药物。
注：埃文斯蓝是一个常见的颜色代理评估BBB开幕41。 - 监视动物，直到预先确定的时间点或人道终点之前。
4. 微泡腔分析
注：这里描述了应用过程，它适用于SF6-磷脂微泡的体内实验，平均直径为2.5微米（80%的气泡低于8微米），在1MHz的频率下，爆音脉冲为10毫秒，最初由麦克丹诺德等人建议。
- 将录制的 PCD 信号从时间域转换为频率域。
- 集成由此产生的光谱功率，在 2号 和 3号 谐波（± 50 kHz）周围进行稳定空腔检测，如 图 3 所示（2 和 3 MHz 的绿色框）。
- 集成惯性腔检测的光谱功率，在主频、2号、3号谐波、1号和2号超谐波以及第一个亚谐波（±150 kHz）之间，如图3（红色框）所示。
- 将光谱功率集成在主频（1 MHz ± 50 kHz）周围，实现先前获得的两个 PCD 信号的正常化。
注：PCD信号，用于SF6-磷脂微泡在体内实验在1 MHz，不显示超谐波或亚和谐之前惯性气泡设置，如 图3所示。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
描述的FUS系统（图1和图2）和相关工作流程已用于100多只动物，并产生了健康小鼠和肿瘤携带小鼠的可重复数据。根据微泡泡泡注注峰值时记录的空腔和谐波的光谱密度，可以使用《议定书》第 4 步中解释的 Fourier 分析计算每个频率的光谱功率。基于声学协议（1 MHz，10ms脉冲持续时间），MI为0.4，结合微泡，在第二和第三谐波的标准化综合功率光谱使图3中观察到的激发频率的综合功率谱正常化。这提供了一种非常敏感和可靠的稳定气泡检测手段，相比之下，在没有注入微泡时没有探测亚和谐论，也没有在应用0.6 MI时观察惯性气泡。在惯性气泡的情况下，检测到高达 25 dB 的广带噪声地板增加，以及超谐波和亚谐波的外观。虽然MI的声压为0.4和0.6，没有造成宏观损害，但从技术上讲，微观损伤在MI为0.6，如图4所示。压力振幅进一步增加至MI为0.8，导致大型血管的宏观脑出血和红细胞外溢的广广组织裂解。组织学的发现与被动腔感官的声学数据相对应，如图3所示，证实了脑组织惯性空腔的破坏性特性。因此，0.4的MI被选为安全压力振幅，提供非常可重复的BBB开口，同时为惯性空腔系统提供安全边距，如11之前观察到的。
静脉注射埃文斯蓝色被注射，以验证BBB在庞廷地区的开放。埃文斯蓝色强白蛋白结合导致大于66 kDa42的大分子。在小鼠和部分小脑的水平上，观察到埃文斯蓝共白蛋白的奢侈，与没有微泡的老鼠相比，用FUS和微泡处理。这强调基于图像引导立体定向导航与内部构建的 FUS 系统和描述的协议对感兴趣的区域进行精确定位。
图1：聚焦超声波设置。
（A） 聚焦超声波设置的示意图表示。（B） 聚焦超声波设置的图片。该系统由自上而下安装的传感器组成，在第二个 2D 阶段的 1D 线性阶段进行自动 3D 定位。传感器建在充满水的光束锥中，底部封闭，带有声学透明的 mylar 膜，可将声音传导到动物的颅骨。传感器连接到电源放大器，该放大器会反过来连接到任意波形发生器 （AWG） 以用于信号生成。对于空腔检测，使用可拆卸水听器与低噪音电压放大器相结合。水听器放置在骨骼的直接附近。外部水听器具有 2 毫米的活动表面，与超声波凝胶在声学上耦合。兴奋脉冲的高压信号和记录的空腔信号均通过标准 200 MHz 示波器数字化，并传到控制计算机（未显示），以便进行即时处理和实时控制。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：聚焦超声波工作流程。
聚焦超声波系统的拟议工作流程从（A） 动物在可拆卸立体定向平台上的初始定位开始，注意声学耦合凝胶（应用后 BLI/X 射线）的应用。同时，可以进行多式联运成像，用于定位。（B） 起初X射线成像是一种可能性，而一个感兴趣的区域可以在大脑轮廓的帮助下定位（这反过来又被引用到小鼠大脑图集40，适应头骨的大小和姿势）。（C） 或者，在 X 射线最大强度投影上覆盖的路西法酶传染扩散中线胶质瘤肿瘤的 BLI 图像可用于定位。（D） 随后，立体定向平台与处于治疗位置的动物一起安装，并附加了水听器和传感器。传感器自动驱动在治疗位置，并声波选择的轨迹后，博卢斯注射。该系统为高通量实验进行了优化，通过该实验，多个平台允许交错工作，如上图所示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：屈化监测。
（A） 在MI 0.4在1兆赫（B）没有微泡管理的情况下进行体内实验的频率谱（B）显示的是注入微泡后峰值球的相应频谱。注意较高谐波的增加，这表明微泡的稳定空腔。（C） 在0.6的高MI与微泡注射相结合，在过渡带内观察到惯性气泡的开始，导致噪音地板增加至25分贝，并出现超谐波和亚和声波。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：BBB开篇及相关的病理学。
（A） 使用 0.4 的 MI 稳定腔化证明白光宏镜和 HE 染色显微镜中都具有完整的脑帕奇玛。（B） 在MI为0.6后，脑帕奇马局部不可逆转组织损伤的最初迹象在 HE 染色组织学数据中变得明显。（C） 对于 MI 0.8 更高的机械压力，宏观出血是显而易见的，以及脑帕奇马的广开组织裂解和红细胞因微出血而外溢。白光宏镜中的蓝色色调表示共同注入的血管内对比剂 Evans 蓝色表示 BBB 开口的外流（见 图 5， 了解下垂视图）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：BBB开口验证。
证明BBB在稳定腔系统（B）中成功开口与控制（A）相比，没有注入微泡。在这种情况下，埃文斯蓝色已被用作血管内对比剂。埃文斯蓝色强白蛋白结合导致大于66 kDa的大分子。因此，埃文斯蓝色外挤的证据表明，由于（部分）打开了狭窄的路口，因此在BBB上进行准细胞运输。 请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项研究中，我们开发了一个基于成本效益的基于FUS的图像引导系统，用于瞬时BBB中断，以增加药物输送到大脑的帕奇马。该系统主要由市售组件构建，并与 X 射线和 BLI 配合使用。拟议设计的模块化允许在高通量工作流程中使用多种成像模式进行规划和评估。该系统可以与更全面的高分辨率 3D 成像模式（例如高分辨率 MRI 或微型 CT）相结合，而对于大部分研究，2D 成像模式（如 2D X 射线和/或 BLI）都使用。2D X 射线和/或 BLI 由于采集时间短，因此具有更划算的性价比，而且非常适合大容量研究。这里描述的传感器非常适合在大脑深处（f数1.25）的较大区域（小鼠大脑的尺度上）产生BBBD。我们已经使用该系统在庞廷地区43，44扩散生长肿瘤。对于这些区域，需要进行更大的体积，包括整个肿瘤区域。模块化系统可以很容易地调整为其他类型的脑肿瘤在大脑的更超前的部分。为了决定传感器类型，一人应考虑 f 号、焦距和频率。
因此，与先前建议的设计相比，整体设计提出了两项改进方案。（一） 经常使用水浴进行治疗系统的超声波传输。对于小动物的颅面应用，这种类型的设计导致更大和倒置的设置，即动物被部分淹没11，22，25。虽然这些设计在较小的动物研究范围内通常效果很好，但在使用过程中，它们在设置时间、便携性和可实际维护的卫生标准方面是一种妥协。特别是后者在包括免疫功能低下动物和因此严格的卫生标准在内的范围研究中具有相当重要的意义。因此，为了设计一个更紧凑的占地面积、更短的设置时间、简单的净化可能性以及整个工作流程中动物的自然位置的系统，选择了"自上而下"的设计。（二） 与先前描述的几种设计不同的第二个设计选择是省略声学传送系统直接集成到医疗成像系统，如 MRI 或微型 CT 15、17、18、19、45。虽然完全集成的系统非常适合纵向药理动力学研究或对数量有限的动物进行探索性研究，但由于复杂性大大增加、运行成本高以及需要训练有素/熟练的操作员，此类设置通常不太适合大容量的药理学研究。此外，此类系统通常仅限于一种成像模式。因此，这里提议的设计依赖于一个模块化可拆卸立体定向平台，该平台与多种成像模式（微型 CT、小型动物 MRI、各种 BLI/荧光摄像机，无论是否集成的 X 射线成像）兼容，还提供多模式虚拟标记，用于在干预规划和 BBB 开放后的后续共同参考范围内自动融合所有图像数据。
关于实际考虑，程序中最关键的失败点是微泡的稳定性，因为微泡的寿命有限，性质脆弱。我们想强调，以下讨论涉及磷脂稳定微泡，并含有六氟化硫（SF6），作为无害气体46，47，而其他微泡配方一般会显示不同的特性。
微泡注射前的计时：重新水化后，商业上可用的微泡的广告寿命在3至4小时之间。虽然这适用于诊断超声波应用，但应当指出，在整个期间，微泡不断失去气体，因此平均气泡直径会从最初的平均大小 2.5 μm 持续向下漂移。对于治疗应用，如超声波介导的BBBD，这意味着更严格的定时要求，因为稳定空腔的振荡振幅（在给定的频率和压力）和惯性空腔的开始阈值也直接导致持续漂移。根据我们的经验，我们观察到微泡最好在补液后30分钟内使用，以获得可重复的结果，类似于先前的报告48。
微泡注射后的计时： 在较大的灵长类动物中，市售的SF6-磷脂微泡显示血浆消除半生约6分钟，超过80%的施用气体在11分钟后通过肺部呼出。在小哺乳动物，如老鼠和大鼠，由于心率较高的20，这种微泡的血浆消除半生在体内要短得多90-120秒。因此，在博卢斯注射后直接产生微泡浓度的快速动态，以及随后的快速血浆消除，加上气泡的连续气体体积损失，对声波/注入协议施加了严格的定时要求，以便在注射后的短时间内获得可重复的结果。更长的程序或更广泛的 BBBD 量最好是持续管理微泡。然而，这种方法由于注射器和喂食系统中气泡的浮力而变得复杂，而且由于所需的输液管，其死积也大大增加。根据我们的经验，将总注射量分成2到3个较小的亚剂量的更简单的解决方案提供了一个强大和可重复的结果。
此外，微泡非常对压力敏感，因此不建议在注射过程中施加高静水压。建议使用大针（>19 G）将微泡转移到塑料管中，或用注射器49制图微泡。建议在小鼠注射26-30G针：因为较大的针头更难插入尾静脉。建议使用 26 G 针，因为此针头的静水压力较低。但是，在静脉难以进入的情况下，建议使用 30 G 针头。
鼠标的颅骨是压力振幅的重要衰减器，显著降低对焦的压力振幅。衰减是由传感器的频率和超声波传播的介质密度决定的。较高的超声波频率和高组织密度，如骨骼导致高衰减。压力振幅被骨骼部分吸收，一些压力振幅因反射和散射50而丧失。在我们的实验中，我们在小鼠尸体中确定，1 MHz的衰减是14.5±1.3分贝/厘米，头骨平均厚度为0.9毫米，如21，50之前所示。强烈建议进行气穴监测，因为微泡在稳定气泡和惯性气泡期间反射出不同的声学排放。宽带发射是惯性气穴12的一种独特的声学发射。实时监控使检测惯性空腔和相应降低压力振幅成为可能，从而避免组织损伤。
先前的报告描述了麻醉类型对BBB渗透性11，31的影响。对于异叶素为基础的麻醉，麻醉开始后不久发生血管扩张，这与大脑血流量的轻微减少有关。此外，长时间麻醉，特别是在没有温度稳定的情况下，会导致心率降低。由于这两个因素都可能导致微泡或联合管理药物大脑浓度的较大差异，所以建议制定严格的麻醉协议，以达到可重复的结果。麻醉与1.5%的v/v异氟烷在2L/分钟氧气35至45分钟没有问题，如君士坦丁尼德斯等人建议51。与麦克丹诺德等人所表明的这种气体混合物与其微泡的特定类型相结合是有问题的52相反，我们没有观察到这种微泡的值得注意的问题。或者，动物可以麻醉与氯胺酮/西拉津的混合物，这是没有已知的血管活性作用53。
总之，此处描述的成像制导 BBB 开启技术已用于大量药物前评估研究，以证明建议的工作流程的效率。因此，由于自动化程度高，非技术人员在经过短期培训后可以操作该系统。这与设置的简单性相结合，导致高度标准化，这反过来又确保了实验的可重复性，减少了组内变异性，从而减少了所需的样本量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由KWF-STW资助（儿童扩散内在庞廷胶质瘤和高档胶质瘤的索诺波治疗药物交付）。我们感谢伊利亚·斯卡奇科夫和查尔斯·穆格诺特对该系统开发的投入。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
| 19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
| 23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
| 3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
| Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
| Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
| Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
| Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
| Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
| Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
| Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
| Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
| Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
| Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
| Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
| Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
| Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
| Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
| Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
| Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
| Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
| Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
| Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
| Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
| Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
| SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
| Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
| Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
| Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
| Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
| Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
| Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |
References
- Lipinski, C. A. Lead- and drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug Discovery Today: Technologies. 1 (4), 337-341 (2004).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Burgess, A., Hynynen, K. Noninvasive and targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. ACS Chemical Neuroscience. 4 (4), 519-526 (2013).
- Meng, Y., et al. Safety and efficacy of focused ultrasound induced blood-brain barrier opening, an integrative review of animal and human studies. Journal of Controlled Release. 309, 25-36 (2019).
- Darrow, D. P. Focused Ultrasound for Neuromodulation. Neurotherapeutics. 16 (1), 88-99 (2019).
- Zhou, Y. F. High intensity focused ultrasound in clinical tumor ablation. World Journal of Clinical Oncology. 2 (1), 8-27 (2011).
- O'Reilly, M. A., Hough, O., Hynynen, K. Blood-Brain Barrier Closure Time After Controlled Ultrasound-Induced Opening Is Independent of Opening Volume. Journal of Ultrasound in Medicine. 36 (3), 475-483 (2017).
- Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Dasgupta, A., et al. Ultrasound-mediated drug delivery to the brain: principles, progress and prospects. Drug Discovery Today: Technologies. 20, 41-48 (2016).
- O'Reilly, M. A., Waspe, A. C., Chopra, R., Hynynen, K. MRI-guided disruption of the blood-brain barrier using transcranial focused ultrasound in a rat model. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Physics in Medicine & Biology. 51 (4), 793 (2006).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (5), 834-840 (2008).
- Sun, T., et al. Closed-loop control of targeted ultrasound drug delivery across the blood-brain/tumor barriers in a rat glioma model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (48), 10281-10290 (2017).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Carpentier, A., et al. Clinical trial of blood-brain barrier disruption by pulsed ultrasound. Science Translational Medicine. 8 (343), 342 (2016).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Medical Physics. 36 (5), 1867-1874 (2009).
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Targeted delivery of antibodies through the blood–brain barrier by MRI-guided focused ultrasound. Biochemical and Biophysical Research Communications. 340 (4), 1085-1090 (2006).
- Larrat, B., et al. MR-guided transcranial brain HIFU in small animal models. Physics in Medicine & Biology. 55 (2), 365 (2009).
- Contag, C. H., Jenkins, D., Contag, P. R., Negrin, R. S. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. Neoplasia. 2 (1-2), New York, NY. 41 (2000).
- Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 33 (1), 95-104 (2007).
- Bing, C., et al. Trans-cranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using astereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2 (1), 13 (2014).
- Marquet, F., et al. Real-time, transcranial monitoring of safe blood-brain barrier opening in non-human primates. PloS One. 9 (2), (2014).
- Anastasiadis, P., et al. characterization and evaluation of a laser-guided focused ultrasound system for preclinical investigations. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 36 (2019).
- Liu, H. L., Pan, C. H., Ting, C. Y., Hsiao, M. J. Opening of the blood-brain barrier by low-frequency (28-kHz) ultrasound: a novel pinhole-assisted mechanical scanning device. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (2), 325-335 (2010).
- Zhu, L., et al. Focused ultrasound-enabled brain tumor liquid biopsy. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
- Bader, K. B., Holland, C. K. Gauging the likelihood of stable cavitation from ultrasound contrast agents. Physics in Medicine & Biology. 58 (1), 127 (2012).
- Neppiras, E. Acoustic cavitation series: part one: Acoustic cavitation: an introduction. Ultrasonics. 22 (1), 25-28 (1984).
- Aryal, M., Arvanitis, C. D., Alexander, P. M., McDannold, N. Ultrasound-mediated blood-brain barrier disruption for targeted drug delivery in the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 94-109 (2014).
- Tung, Y. S., Choi, J. J., Baseri, B., Konofagou, E. E. Identifying the inertial cavitation threshold and skull effects in a vessel phantom using focused ultrasound and microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (5), 840-852 (2010).
- Arvanitis, C. D., Livingstone, M. S., Vykhodtseva, N., McDannold, N. Controlled ultrasound-induced blood-brain barrier disruption using passive acoustic emissions monitoring. PloS One. 7 (9), (2012).
- Tsai, C. H., Zhang, J. W., Liao, Y. Y., Liu, H. L. Real-time monitoring of focused ultrasound blood-brain barrier opening via subharmonic acoustic emission detection: implementation of confocal dual-frequency piezoelectric transducers. Physics in Medicine & Biology. 61 (7), 2926 (2016).
- Chen, W. S., Brayman, A. A., Matula, T. J., Crum, L. A. Inertial cavitation dose and hemolysis produced in vitro with or without Optison. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (5), 725-737 (2003).
- Qiu, Y., et al. The correlation between acoustic cavitation and sonoporation involved in ultrasound-mediated DNA transfection with polyethylenimine (PEI) in vitro. Journal of Controlled Release. 145 (1), 40-48 (2010).
- Sun, T., Jia, N., Zhang, D., Xu, D. Ambient pressure dependence of the ultra-harmonic response from contrast microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4358-4364 (2012).
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging. Neoplasia. 2 (6), 491-495 (2000).
- Puaux, A. L., et al. A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals. International Journal of Molecular Imaging. 2011, (2011).
- Wu, S. K., et al. Characterization of different microbubbles in assisting focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 7, 46689 (2017).
- van den Broek, M. P., Groenendaal, F., Egberts, A. C., Rademaker, C. M. Effects of hypothermia on pharmacokinetics and pharmacodynamics. Clinical Pharmacokinetics. 49 (5), 277-294 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. Paxinos and Franklin's the mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic press. (2019).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 385, 385 (2015).
- Yao, L., Xue, X., Yu, P., Ni, Y., Chen, F. Evans blue dye: a revisit of its applications in biomedicine. Contrast Media & Molecular Imaging. 2018, (2018).
- Caretti, V., et al. Monitoring of tumor growth and post-irradiation recurrence in a diffuse intrinsic pontine glioma mouse model. Brain Pathology. 21 (4), 441-451 (2011).
- Yoshimura, J., Onda, K., Tanaka, R., Takahashi, H. Clinicopathological study of diffuse type brainstem gliomas: analysis of 40 autopsy cases. Neurologia Medico-Chirurgica. 43 (8), 375-382 (2003).
- Yang, F. Y., et al. Micro-SPECT/CT-based pharmacokinetic analysis of 99mTc-diethylenetriaminepentaacetic acid in rats with blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound. Journal of Nuclear Medicine. 52 (3), 478-484 (2011).
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science, Engineering & Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Greis, C. Technology overview: SonoVue. European Radiology. 14, Bracco, Milan. 11-15 (2004).
- Schneider, M. Characteristics of sonovue. Echocardiography. 16, 743-746 (1999).
- Talu, E., Powell, R. L., Longo, M. L., Dayton, P. A. Needle size and injection rate impact microbubble contrast agent population. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (7), 1182-1185 (2008).
- Pinton, G., et al. Attenuation, scattering, and absorption of ultrasound in the skull bone. Medical Physics. 39 (1), 299-307 (2012).
- Constantinides, C., Mean, R., Janssen, B. J. Effects of isoflurane anesthesia on the cardiovascular function of the C57BL/6 mouse. ILAR journal/National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 52, 21 (2011).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. The effects of oxygen on ultrasound-induced blood-brain barrier disruption in mice. Ultrasound in Medicine & Biology. 43 (2), 469-475 (2017).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-brain barrier disruption and vascular damage induced by ultrasound bursts combined with microbubbles can be influenced by choice of anesthesia protocol. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (8), 1259-1270 (2011).
