Blod- hjärnbarriären (BBB) kan tillfälligt störas med mikrobubble-medierat fokuserat ultraljud (FUS). Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för hög genomströmning BBB-öppning in vivo med hjälp av ett modulärt FUS-system tillgängligt för icke-ultraljudsexperter.
Blod- hjärnbarriären (BBB) har varit ett stort hinder för behandling av olika hjärnsjukdomar. Endotelceller, förbundna med snäva korsningar, bildar en fysiologisk barriär som förhindrar att stora molekyler (>500 Da) kommer in i hjärnvävnaden. Microbubble-medierad fokuserad ultraljud (FUS) kan användas för att inducera en övergående lokal BBB öppning, så att större läkemedel kan komma in i hjärnan parenkym.
Förutom storskaliga kliniska enheter för klinisk översättning kräver preklinisk forskning för behandlingsresponsbedömning av läkemedelskandidater dedikerade smådjur ultraljudsinställningar för riktad BBB-öppning. Helst tillåter dessa system arbetsflöden med hög genomströmning med både hög rumslig precision och integrerad kavitationsövervakning, samtidigt som de är kostnadseffektiva i både initiala investeringar och driftskostnader.
Här presenterar vi ett bioluminescens- och röntgenstyrt stereotaktiskt FUS-system för smådjur som bygger på kommersiellt tillgängliga komponenter och uppfyller ovan nämnda krav. Särskild vikt har lagts vid en hög grad av automatisering som underlättar de utmaningar som vanligtvis uppstår i prekliniska läkemedelsutvärderingsstudier med hög volym. Exempel på dessa utmaningar är behovet av standardisering för att säkerställa data reproducerbarhet, minska variabiliteten inom gruppen, minska urvalsstorleken och därmed uppfylla etiska krav och minska onödig arbetsbelastning. Det föreslagna BBB-systemet har validerats inom ramen för BBB-öppnandet av underlättade läkemedelsleveransförsök på patientbaserade xenograftmodeller av glioblastom multiforme och diffusa midline glioma.
Blod- hjärnbarriären (BBB) är ett stort hinder för läkemedelsleverans till hjärnans parenkym. De flesta terapeutiska läkemedel som har utvecklats korsar inte BBB på grund av deras fysikaliskkemiska parametrar (t.ex. lipofilibilitet, molekylvikt, vätebindnings acceptorer och givare) eller behålls inte på grund av deras affinitet för utflödestransportörer i hjärnan1,2. Den lilla gruppen läkemedel som kan korsa BBB är vanligtvis små lipofila molekyler, som bara är effektiva i ett begränsat antal hjärnsjukdomar1,2. Som en följd av detta, för de flesta hjärnsjukdomar, är farmakologiska behandlingsalternativ begränsade och nya drug delivery-strategier behövs3,4.
Terapeutisk ultraljud är en framväxande teknik som kan användas för olika neurologiska applikationer såsom BBB-störningar (BBBD), neuromodulering och ablation4,5,6,7. För att uppnå en BBB-öppning med en extrakorpooreal ultraljudsemitterare genom kraniet kombineras fokuserat ultraljud (FUS) med mikrobubblor. Mikrobubble-medierad FUS resulterar i ökad biotillgänglighet av läkemedel i hjärnan parenkym5,8,9. I närvaro av ljudvågor börjar mikrobubblor svänga initiering av transcytos och störningar av de snäva korsningarna mellan endotelcellerna i BBB, vilket möjliggör paracellulär transport av större molekyler10. Tidigare studier bekräftade sambandet mellan intensiteten i det akustiska utsläppet och den biologiska påverkan på BBB-öppningen11,12,13,14. FUS i kombination med mikrobubblor har redan använts i kliniska prövningar för behandling av glioblastom med temozolomid eller liposomal doxorubicin som kemoterapeutiskt medel, eller för behandling av Alzheimers sjukdom och amyotrofisk lateral skleros5,9,15,16.
Eftersom ultraljud medierad BBB-öppning resulterar i helt nya möjligheter till farmakoterapi, behövs preklinisk forskning för klinisk översättning för att bedöma terapisvaret hos utvalda läkemedelskandidater. Detta kräver vanligtvis ett arbetsflöde med hög genomströmning med både hög rumslig precision och helst en integrerad kavitationsdetektering för övervakning av riktad BBB-öppning med hög reproducerbarhet. Om möjligt måste dessa system vara kostnadseffektiva i både initiala investeringar och driftskostnader för att kunna skalbara enligt studiestorleken. De flesta prekliniska FUS-system kombineras med MRT för bildvägledning och behandlingsplanering15,17,18,19. Även om MRI ger detaljerad information om tumör anatomi och volym, är det en dyr teknik, som i allmänhet utförs av utbildade / skickliga operatörer. Dessutom kanske högupplöst MRT inte alltid är tillgängligt för forskare i prekliniska anläggningar och kräver långa skanningstider per djur, vilket gör det mindre lämpligt för farmakologiska studier med hög genomströmning. Anmärkningsvärt är att för preklinisk forskning inom neuro-onkologi, i synnerhet infiltrativa tumörmodeller, är möjligheten att visualisera och rikta tumören avgörande för behandlingsframgång20. För närvarande uppfylls detta krav endast av MRI eller av tumörer transduced med ett fotoprotein, vilket möjliggör visualisering med bioluminescens imaging (BLI) i kombination med administrering av fotoprotein substrat.
MRI-styrda FUS-system använder ofta ett vattenbad för att säkerställa ultraljudsvågspridning för transkraniella tillämpningar, varigenom djurets huvud delvis är nedsänkt i vattnet, de så kallade “bottom-up”-systemen15,17,18. Även om dessa konstruktioner i allmänhet fungerar bra i mindre djurstudier, är de en kompromiss mellan djurberedningstider, bärbarhet och realistiskt underhållbara hygieniska standarder under användning. Som ett alternativ till MRI omfattar andra styrmetoder för stereotaktisk navigering användningen av en gnagare anatomisk atlas21,22,23, laserpekare assisterad visuell observation24, pinhole-assisted mekanisk skanning enhet25, eller BLI26. De flesta av dessa mönster är “top-down” -system där givaren placeras ovanpå djurets huvud, med djuret i en naturlig position. Arbetsflödet “uppifrån och ned” består antingen av ett vattenbad22,25,26 eller en vattenfylld kon21,24. Fördelen med att använda en givare inuti en sluten kon är det mer kompakta fotavtrycket, kortare installationstid och möjligheter till direkt sanering som förenklar hela arbetsflödet.
Interaktionen mellan det akustiska fältet och mikrobubblorna är tryckberoende och sträcker sig från oscillationer med låg amplitud (kallas stabil kavitation) till övergående bubbelkollaps (kallad inertial kavitation)27,28. Det finns en etablerad konsensus om att ultraljud-BBBD kräver ett akustiskt tryck långt över den stabila kavitation tröskeln för att uppnå framgångsrika BBBD, men under den inertiella kavitation tröskeln, som i allmänhet är associerad med vaskulär/neuronal skada29. Den vanligaste formen av övervakning och kontroll är analysen av den (rygg)spridda akustiska signalen med passiv kavitationsdetektering (PCD), som föreslagits av McDannold et al.12. PCD bygger på analys av Fourier-spektrat av mikrobubblors emissionssignaler, där styrkan och utseendet hos stabila kavitationsmärken (övertoner, subharmoniker och ultraharmoniker) och inerta kavitationsmarkörer (bredbandsrespons) kan mätas i realtid.
En “en storlek passar alla” PCD-analys för exakt tryckkontroll är komplicerad på grund av mikrobubbleformuleringens polydispersitet (oscillationsamlituden beror starkt på bubbeldiametern), skillnaderna i bubbelskalegenskaper mellan märken och den akustiska svängningen, som starkt beror på frekvens och tryck30,31,32. Som en följd av detta har många olika PCD-detekteringsprotokoll föreslagits, som har anpassats till särskilda kombinationer av alla dessa parametrar och har använts i olika applikationsscenarier (allt från in vitro-experiment över små djurprotokoll till PCD för klinisk användning) för robust kavitationsdetektering och även för retroaktiv återkopplingskontroll av trycket11,14,30,31,32,33,34,35. PcD-protokollet som används inom ramen för denna studie härleds direkt från McDannold et al.12 och övervakar det harmoniska utsläppet för förekomst av stabil kavitation och bredbandsbuller för inertiell kavitationsdetektering.
Vi har utvecklat ett bildstyrt neuronavigation FUS-system för övergående öppning av BBB för att öka läkemedelstillförseln till hjärnan parenkym. Systemet bygger på kommersiellt tillgängliga komponenter och kan enkelt anpassas till flera olika bildframställningsmetoder, beroende på tillgängliga bildtekniker i djuranläggningen. Eftersom vi behöver ett arbetsflöde med hög genomströmning har vi valt att använda röntgen och BLI för bildvägledning och behandlingsplanering. Tumörceller transduced med ett fotoprotein (t.ex. luciferas) är lämpliga för BLI imaging20. Efter administrering av fotoproteinsubstratet kan tumörceller övervakas in vivo och tumörtillväxt och plats kanbestämmas 20,36. BLI är en billig bildframställning modalitet, det gör det möjligt att följa tumörtillväxten över tid, den har snabba skanningstider och det korrelerar väl med tumörtillväxt mätt med MRI36,37. Vi har valt att ersätta vattenbadet med en vattenfylld kon fäst vid givaren för att möjliggöra flexibilitet att fritt flytta plattformen där gnagaren är monterad8,24. Designen är baserad på en avtagbar plattform utrustad med integrering av (I) smådjurs stereotaktiska plattform (II) fiducialmarkörer med både röntgen- och optisk bildkompatibilitet (III) snabbavtagbar anestesimask och (IV) integrerat temperaturreglerat djurvärmesystem. Efter den första induktionen av anestesi monteras djuret i ett exakt läge på plattformen där det förblir under hela proceduren. Följaktligen passerar hela plattformen alla stationer i arbetsflödet för hela insatsen, samtidigt som en korrekt och reproducerbar positionering upprätthålls och en ihållande anestesi upprätthålls. Kontrollprogramvaran gör det möjligt att automatiskt detektera fiducialmarkörerna och registrerar automatiskt alla typer av bilder och bildmodaliteter (dvs. mikro-CT, röntgen, BLI och fluorescensavbildning) i referensramen för den stereotaktiska plattformen. Med hjälp av ett automatiskt kalibreringsförfarande är ultraljudsgivarens brännvidd exakt känd inom, vilket möjliggör automatisk fusion av interventionell planering, akustisk leverans och uppföljande bildanalys. Som visas i figur 1 och figur 2ger denna inställning en hög grad av flexibilitet för att utforma dedikerade experimentella arbetsflöden och möjliggör interfolierade hantering av djuret på olika stationer, vilket i sin tur underlättar experiment med hög genomströmning. Vi har använt denna teknik för framgångsrik läkemedelsleverans i mus xenografts av hög kvalitet gliom såsom diffusa mittlinjen gliom.
I denna studie utvecklade vi ett kostnadseffektivt bildstyrt FUS-system för övergående BBB-störningar för ökad läkemedelstillförsel till hjärnans parenkym. Systemet byggdes till stor del med kommersiellt tillgängliga komponenter och i samband med röntgen och BLI. Den föreslagna designens modularitet gör det möjligt att använda flera bildframställningsmetoder för planering och utvärdering i arbetsflöden med hög genomströmning. Systemet kan kombineras med mer omfattande högupplösta 3D-bildframställn…
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt finansierades av KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma och High-grade Glioma). Vi tackar Ilya Skachkov och Charles Mougenot för deras bidrag i utvecklingen av systemet.
1 mL luer-lock syringe | Becton Dickinson | 309628 | Plastipak |
19 G needle | Terumo Agani | 8AN1938R1 | |
23 G needle | Terumo Agani | 8AN2316R1 | |
3M Transpore surgical tape | Science applied to life | 7000032707 | or similar |
Arbitrary waveform generator | Siglent | n.a. | SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s |
Automated stereotact | in-house built | n.a. | Stereotact with all elements were in-house built |
Bruker In-Vivo Xtreme | Bruker | n.a. | Includes software |
Buffered NaCl solution | B. Braun Melsungen AG | 220/12257974/110 | |
Buprenorfine hydrochloride | Indivior UK limitd | n.a. | 0.324 mg |
Cage enrichment: paper-pulp smart home | Bio services | n.a. | |
Carbon filter | Bickford | NC0111395 | Omnicon f/air |
Ceramic spoon | n.a | n.a. | |
Cotton swabs | n.a. | n.a. | |
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
Ethanol | VUmc pharmacy | n.a. | 70% |
Evans Blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Fresenius NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | n.a. | NaCl 0.9 %, 1000 mL |
Histoacryl | Braun Surgical | n.a. | Histoacryl 0.5 mL |
Hydrophone | Precision Acoustics | n.a. | |
Insulin syringe | Becton Dickinson | 324825/324826 | 0.5 mL and 0.3 mL |
Isoflurane | TEVA Pharmachemie BV | 8711218013196 | 250 mL |
Ketamine | Alfasan | n.a. | 10 %, 10 mL |
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | Envigo | 2918-11416M | |
Neoflon catheter | Becton Dickinson | 391349 | 26 GA 0.6 x 19 mm |
Oscilloscope | Keysight technologies | n.a. | InfiniiVision DSOX024A |
Plastic tubes | Greiner bio-one | 210261 | 50 mL |
Power amplifier | Electronics & Innovation Ltd | 210L | Model 210L |
Preamplifier DC Coupler | Precision Acoustics | n.. | Serial number: DCPS94 |
Scissors | Sigma Aldrich | S3146-1EA | or similar |
Sedazine | AST Farma | n.a. | 2% |
SonoVue microbubbles | Bracco | n.a. | 8 µl/ml |
Sterile water | Fresenius Kabi | n.a. | 1000 mL |
Syringe | n.a. | n.a. | various syringes can be used |
Temgesic | Indivior UK limitd | n.a. | 0.3 mg/ml |
Transducer | Precision Acoustics | n.a. | 1 MHz |
Tweezers | Sigma Aldrich | F4142-1EA | or similar |
Ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | 01-02 | Aquasonic 100 |
Vidisic gel | Bausch + Lomb | n.a. | 10 g |