Summary
颅内脑转移建模由于无法以精确和及时的方法监测肿瘤大小和治疗反应而变得复杂。该方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，结合后，培养精确一致的注射，增强动物监测，并精确测量肿瘤体积。
Abstract
癌症的转移性传播是疾病进展、侵略性癌症亚型和/或晚期诊断的不幸后果。脑转移是特别具有破坏性的，难以治疗，并造成不良的预后。虽然美国脑转移的准确发生率仍然难以估计，但随着颅外疗法在治疗癌症方面继续变得更加有效，这种发病率可能会增加。因此，有必要确定并开发新的治疗方法，以治疗转移在这个网站。为此，癌细胞颅内注射已成为模拟脑转移的成熟方法。以前，无法直接测量肿瘤生长一直是该模型的技术障碍;然而，增加小动物成像模式（如磁共振成像（MRI）的可用性和质量，极大地提高了监测肿瘤随时间增长和推断实验期间大脑内变化的能力。在这里，在颅内注射莫林乳腺肿瘤细胞到免疫功能小鼠，其次是MRI证明。提出的注射方法采用异氟兰麻醉和立体定向设置，采用数字控制、自动钻头和针头注射，提高精度，减少技术误差。MRI 是随着时间的推移测量使用 9.4 特斯拉仪器在俄亥俄州立大学詹姆斯综合癌症中心小动物成像共享资源。肿瘤体积测量通过使用 ImageJ 在每个时间点进行演示。总体而言，这种颅内注射方法允许精确的注射、日常监测和精确的肿瘤体积测量，这极大地增强了该模型系统的实用性，以测试大脑转移驱动因素的新假设。
Introduction
脑转移是成人原发中枢神经系统肿瘤1的10倍，而且几乎每一种实体肿瘤类型中都有肺癌、乳腺癌、黑色素瘤，发病率最高2。无论原发性肿瘤位点如何，大脑转移的发展导致预后不良，通常与认知衰退、持续性头痛、癫痫发作、行为和/或性格变化,1、3、4、534,相关。1在乳腺癌方面，在预防和治疗该疾病方面有许多进展。然而，30%的乳腺癌诊断妇女将继续发展转移，和那些有第四阶段疾病，约7%（SEER 2010-2013）有脑转移6,6，7。目前脑转移的治疗方案包括手术切除、立体定向放射外科和/或全脑放射治疗。然而，即使这种积极的治疗，这些患者的中位数生存是短短的8-11个月7,7，8，9。,9这些严峻的统计数字有力地支持了确定和实施新颖、有效的治疗策略。因此，与转移至大脑的所有癌症一样，在实验室中正确模拟与乳腺癌相关的脑转移 （BCBM） 以确保该领域的显著进展至关重要。
迄今为止，研究人员已经利用各种方法研究转移大脑的机制，每种机制都有其独特的优点和局限性,。实验转移方法，如尾静脉和心内注射将肿瘤细胞扩散到全身，并可能导致其他转移部位的巨大肿瘤负担，具体取决于注射的细胞。如果这些结果被具体研究到大脑的转移，那么这些结果会混淆。胡萝卜内动脉注射方法是有利的，因为它特别针对肿瘤细胞的大脑播种，但是有限的，因为它可能在技术上很难执行。正畸原发肿瘤切除通常被认为是最临床相关的转移模型，因为它重述了整个转移级联。然而，这种方法涉及长时间等待自发转移发生，大脑转移率显著低于其他转移位点，如淋巴结，肺和肝脏。通常，动物必须从研究中去除由于肿瘤负担在这些其他转移位点之前，大脑转移的发展。其他涉及脑热带细胞系的方法在转移至大脑时是有效的;然而，这些模型是有限的，因为它们需要时间来发展，并经常失去他们的tropism与传播。,鉴于这些局限性，研究人员经常使用颅内注射方法，以不同方法,,,,15、16、17、18、19,等不同方法对癌症转移11、12、13、1418进行模型模型。121314 1617人们承认，这种方法同样有局限性，最重要的是，它不允许调查早期转移步骤，包括从原发性肿瘤中进，通过血脑屏障的切开，以及在大脑内建立。然而，它确实允许研究人员测试（1）哪些肿瘤衍生因素调解大脑内的生长（例如，肿瘤细胞中致癌因子的基因操作），（2）转移性微环境的变化如何改变本部位的癌症生长（例如，转基因小鼠与改变的频基成分的比较）和（3）新治疗策略对既定病变生长的有效性。
鉴于颅内注射模型的潜在效用，绝对有必要减少注射过程中的技术误差，并精确监测肿瘤的生长。本文描述的方法包括连续注射气体麻醉，并使用立体定向钻和注射支架将肿瘤细胞直接植入脑中。管理气体麻醉剂可以微调麻醉的深度和长度，并确保快速和顺利的恢复。数字控制的自动钻头和针注射系统提高了喷注现场的精度，并减少了钻孔和手注射方法经常产生的技术错误。磁共振成像（MRI）的使用进一步提高了监测肿瘤生长、肿瘤体积、组织反应、肿瘤坏死和治疗反应的精度。MRI是软组织20、21,的成像方式。这种成像技术不使用电离辐射，比计算机断层扫描 （CT） 更可取，尤其是在研究过程中进行多次成像。MRI 具有比 CT 或超声波成像 （USG） 更大的可用软组织对比度范围，并更详细地呈现解剖学。它更敏感和具体的大脑本身的异常。MRI 可以在任何成像平面上执行，而无需像 2D USG 或 2D 光学成像那样以物理方式移动主体。重要的是要提一下，头骨不像其他成像方式那样衰减MRI信号。MRI 允许评估可能被 CT 或 USG 中骨骼中的伪影遮盖的结构。另一个优点是，有许多对比剂可用于MRI，这增强了病变检测极限，具有相对较低的毒性或副作用。重要的是，MRI 允许实时监测，不像在尸检时进行组织学评估，而肿瘤体积的破译是有限的。其他成像模式，如生物发光成像，确实对早期肿瘤的检测和监测是有效的;然而，这种方法需要细胞系的遗传处理（例如，荧光酶/GFP标记），并且不允许进行体积测量。MRI 是进一步有利的，因为它反映了患者监测和下游体积分析的 MR 图像已知与肿瘤大小在尸检22强烈相关。使用 MRI 筛查进行串行监测也会增加神经损伤的临床监测（如果出现）。
总的来说，立体定向颅内肿瘤注射方法，以及连续MRI，使我们能够产生可靠、可预测和可测量的结果，以研究癌症中脑转移的机制。
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Protocol
本文描述的所有方法均获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（P.I.Gina Sizemore;协议#2007A0120）。所有啮齿动物生存手术的 IACUC 政策都遵循，包括使用无菌技术、用品、仪器，以及毛皮去除和切口部位的无菌制备。
1. 乳腺癌细胞颅内注射
注：本文描述的方法利用了从原发 MMTV-PyMT 肿瘤23衍生出的DB7乳腺肿瘤细胞系。先前的研究已经确定DB7细胞的颅内注射作为BBM的模型，其组织学模仿人类疾病12。重要的是，免疫能力FVB/N小鼠用于此模型，因为DB7细胞是从这种小鼠菌株派生的。由于这是一个乳腺癌模型，成年雌性小鼠用于这些研究。
- 准备单元格。
- 在无菌罩中，使用标准技术从细胞培养板中吸气介质。
- 使用 1x DPBS 清洗细胞，并使用制造商的协议进行尝试。
- 添加适当体积的含 FBS 介质，以停止三辛反应，并使用血细胞计或首选方法确定细胞的浓度。
- 在 300 x g 下颗粒 细胞，在 4 °C 下 4 分钟。
- 吸气介质，用 1x DPBS 清洗，在 300 x g 下重新 旋转 ，在 4 °C 下旋转 4 分钟。
- 将1x DPBS中的细胞重新注入到适当的浓度，每注射量约50，000个细胞，2μL。
注：细胞号取决于线路的侵略性，需要由调查员确定。我们经常使用2μL，但使用卷<6μL报告15，16，17，18，19。15,16,17,18,19低体积对于保持精度至关重要。 - 将重新注入的细胞放在冰上，直到注射以保持活力。
- 准备小鼠做手术。
- 对于有毛皮的老鼠：通过脱毛霜/皮毛或剃须，从化妆水皮中去除毛皮。手术前24-48小时内完成手术，因为执行此步骤太接近手术可能会干扰皮肤质量和缝合强度。
注：由于研究转移性乳腺癌（一种主要为女性疾病），使用重约25克的雌性FVB/N小鼠。 - 管理由 IACUC 确定并参加兽医的镇痛药：布丙诺啡 SR-LAB 皮下注射（0.05-0.1 毫克/千克剂量， 丁丙诺啡库存：0.5毫克/mL，剂量为0.0025-0.088 mL）至少24小时手术前提供高达72小时镇痛，可重复48-72小时后，第一次剂量，如果需要。还要在手术前至少24-48小时服用NSAIDs（饮用水中20%布洛芬，例如1mg/5 mL），术后持续2-7天，以提供至少72小时术后镇痛。
注：在俄亥俄州立大学，布丙诺啡SR-LAB由大学实验室动物资源兽医工作人员管理，因为它是一种受控物质。
- 对于有毛皮的老鼠：通过脱毛霜/皮毛或剃须，从化妆水皮中去除毛皮。手术前24-48小时内完成手术，因为执行此步骤太接近手术可能会干扰皮肤质量和缝合强度。
- 为手术准备立体定向装置。
- 打开所有麻醉机、数字 Vernier 秤和数字喷油器。
注：所有手术工具应在手术前进行充分清洁和消毒。 - 在生物安全柜中使用带感应室附件的麻醉机（图1A）。
- 确保麻醉机的所有管子都连接到立体定向框架（图1B，内嵌1C），管上的夹子对于使用的所有单元都打开。关闭管子上的任何夹子，这些夹子将放在不用于手术的立体定向框架上。
- 根据鼠标重量（例如，25 g 动物重量：鼻锥流速 34 mL/min）将麻醉机设置为制造商推荐的鼻锥流速。
注：此立体定向设置中包含的头架仅推荐给成年小鼠。确保遵循立体声教学设置中包含的制造商建议。 - 确保注射器中预填充的适当麻醉剂（例如异氟兰）附着在麻醉机上（图1B）。
注：过度吸附注射器会导致手术期间将太多的麻醉送到小鼠体内，并导致麻醉过量。 - 通过扭曲舞台锁、将钻头位适配器和 1 mm 钻头插入每个钻头来准备钻头，然后通过手动拧紧钻头来锁定钻头。
- 将钻头连接到立体定向帧（图 1C）。
- 用 5 个交替洗涤 1x DPBS 的汉密尔顿注射器，然后用 70% 乙醇清洁，然后在 1x DPBS 中再次清洁。放在一边，直到动物准备注射。
- 将数字喷油器设置为 0.4 μL/min 和 2 μL 的目标。这种速率和体积允许缓慢地将肿瘤细胞引入大脑，从而减少压力和相关损伤。
- 打开所有麻醉机、数字 Vernier 秤和数字喷油器。
- 将鼠标放在立体定向帧上。
- 使用上述感应室麻醉小鼠（例如异氟兰）。
- 在整个手术过程中，将小鼠保持深麻醉面。机器麻醉的百分比取决于多种因素，包括：流速、刺激程度和体温。通过评估有节奏的呼吸（动物没有喘气），在整个手术过程中经常监测小鼠的麻醉深度;缺乏眼睑反射（用棉尖施用器刺激眼睑时飘动）;和缺乏头趾捏（在捏着趾的有毒刺激下断肢）。
注：不同菌株的小鼠对麻醉有不同的反应。 - 小鼠处于适当的深麻醉面后，将小鼠转移到立体定向单元。当鼠标在立体定向机器上时，使用加热垫以保持体温和适当的麻醉面。
注：为了实现低调，我们使用空气激活的暖手器放置在倒置移液器尖端盒内（图 1D中的鼠标提升盒）。 - 打开鼠标的嘴，将牙齿放在位于立体定向框架鼻片上的嘴杆的槽中（图2A）。将鼻锥滑过鼠标的鼻子/嘴（图2B）。
- 将头部水平的老鼠放在嘴栏上。用棉尖施用器的钝端轻轻张开嘴，然后滑入到位。确保鼻锥完全超过鼠标的鼻子，否则麻醉不会正确传递。如果牙齿不位于此凹槽内（插入图 2A），鼻锥不会与鼻子接触。
- 使用无菌棉签，将眼睛润滑剂放在每个小鼠的眼睛上。眼部润滑剂的应用可减轻角膜的干燥，减少角膜损伤和与角膜创伤相关的术后并发症的发生。
- 通过将左耳杆压在左耳的中拉器上，用立体图框上的螺钉将其锁定到位，从而稳定鼠标的头骨。然后将右耳杆滑到右耳的中拉器上，拧紧立体定向框架（图 2B）。
注：放置耳条时，确保鼠标头部平直。如果头部弯曲或倾斜，注射将在大脑中不正确的位置。耳杆应收紧，直到头骨在刺激时通过适度的手动探测固定。
- 制作一个日历窗口。
- 准备和清洁头皮与3倍交替通过每个β丁溶液和70%乙醇。由于手术地点靠近眼睛，在手术磨砂上使用贝塔丁溶液。
- 使用无菌手术刀，沿着颅骨的中位线（沿着缝合线）通过皮肤进行3毫米切口。切口的出血应该最小。如果发生这种情况，使用无菌棉尖施用器在出血现场施加一致、坚定的压力，持续 >30 秒。
- 识别并定向垂直于啤酒的钻头（图2C），确保将数字Vernier刻度重置为零。
- 将钻头 2 mm 横向移动到下垂缝合线，将钻头向前移动 1 mm 至日冕缝合线（图 2C）。为可重复性，确保所有动物的下垂缝合线左侧或右侧的位置保持一致。
- 将钻头转动到最高速度。确保皮肤远离钻头，以避免旋转位造成组织损伤，并小心地将钻头启动到头骨上。钻一个大约 0.5 mm 深的孔，通过钙化，导致钙变窗口。小心不要把钻头降得太远，否则它会钻进大脑。在钻头运动时将无菌盐水滴在钻孔现场，可以抵消机器产生的任何热量，这些热量可能会对周围组织造成热损伤。
- 制作卡路里窗口后，小心地升起钻头并将其从立体定向框架中拆下。
- 使用 70% 乙醇清洁钻头，如果再次使用，请放在一边。如果没有，则去除钻头和 70% 乙醇中的潜水。
- 将癌细胞注入大脑
- 将自动喷油器单元连接到立体定向装置（图 1D）。
- 在干净的汉密尔顿注射器中拉起 >2 μL 的细胞，在 1x DPBS 中彻底重新注入。在填充注射器之前，请务必立即重新注入细胞，以减少团块形成，并确保细胞浆质均匀。最好拉起 6-8μL 的电池体积，以确保没有气囊/气泡。
- 将 Hamilton 注射器放在喷油器装置上，通过将少量体积分配到一次性无菌窗帘上，将针头用于注射，以确保喷油器正常工作。用棉尖施用器用 70% 乙醇擦拭注射器（图 1D，内嵌）。这可去除针轴外管中的肿瘤细胞，降低肿瘤细胞沿注射区播种的风险。
- 将针尖与钙化窗口中心对齐，几乎接触裸露的脑膜。
- 将数字Vernier比例重置为零。
- 慢慢地将针头插入3毫米的深度进入大脑，让针头在大脑中保持至少60秒，然后再继续。这个时间框架允许大脑帕伦奇玛在针头周围一致，从而减少背部压力和肿瘤细胞沿着针道的潜在驱逐。
- 选择 喷 油器屏幕上的"运行"，开始将电池传递到喷射部位。注入此卷大约需要 5 分钟。此步骤的长时间是减少注射力对脑筋造成的二次损伤。
- 注射方案完成后，让针头在大脑中至少休息3分钟，再次让大脑帕伦奇玛适应注射。
- 至少3分钟后，以0.75毫米/分钟的速度从大脑中抬起针头。以极其缓慢和一致的方式进行此工作，以减少背压和肿瘤追踪针头。
- 针头离开大脑后，小心地从喷油器中取出汉密尔顿注射器并清洁，如步骤 1.2.8 中所述。
- 使用无菌棉签将温暖的骨蜡涂抹到钙质窗口。骨蜡作为物理屏障，使肿瘤留在头骨内。
- 关闭切口（例如，5-0 PDS 可溶解缝合线在一个简单的中断模式或缝合夹，以外科医生最舒适的哪一个）。
- 停止麻醉，通过解锁和滑出耳杆、将鼻锥从鼠标上滑下来，以及将牙齿从嘴杆上拔掉，将鼠标从仪器上取下。
- 将鼠标放在一个干净的笼子中，该笼子位于 37°C 的加热器上，以便恢复。在恢复过程中监测小鼠，通常在麻醉停止后10-15分钟进行。
- 恢复鼠标后，监控由主机机构的 IACUC 确定的早期删除标准。
2. 磁共振成像
- 在成像前24 10-20分钟通过标准内丙酮注射24 10-20分钟，对小鼠施用基于Gadolinium的对比剂（100 μL/20 g体重小鼠0.1 M MultiHance）。然后使用与 95% O2 和 5% CO2（ 即提供的房间空气气体）混合的吸入麻醉剂（例如异氟）的感应室进行麻醉。
- 将鼠标放在加热支架上以保持体温。用耳塞和咬杆固定头部，并在配备鼠标脑表面线圈的 9.4 T 磁铁中放置支架。在成像期间保持麻醉，研究通常需要每只鼠标约20分钟。使用气动枕头和小型动物监测系统在整个过程中监测呼吸速率和心率（±70 bpm）。
- 获取本地化图像，然后使用 T2 加权 RARE 序列（TR = 3500-4228 ms，TE=12 ms，RARE 因子 = 8， FOV=2.0 x 2.0 厘米，矩阵大小 = 256 x 256，1 mm 或 0.5 mm 切片厚度，NA=2-4，15-30 连续切片）和后加多利尼姆基对比 T1 加权稀有序列（TR = 1200 ms，TE=7.5 ms，稀有因子 = 4，FOV=2.0 x 2.0 厘米，矩阵尺寸 = 256 x 256，1 mm 或 0.5 mm 切片厚度，NA=2-4，15-30 连续切片）。
- 成像后，将鼠标放在一个温度为 37 °C 的加热器上的笼子中，以进行恢复。
3. 体积肿瘤测量
- 获得总肿瘤体积
- 在 ImageJ 中打开 MRI DICOM 数据文件，这是一个图像处理软件，可通过国家卫生研究院（https://imagej.nih.gov/ij/） 25 免费下载。
注：ImageJ 允许查看 DICOM 文件，这是利用嵌入像素尺寸进行肿瘤体积计算所需的（请参阅图像，可根据需要设置"长度单位"的属性（例如 mm）。 - 使用 "手绘选择 "工具在肿瘤周围绘制轮廓。在黑暗的房间里执行这些选择，以提高可见性。不要调整亮度/对比度以保持会话之间的一致性。
- 在"分析"选项卡下，选择"度量"以获取所选区域的区域。如果在步骤 3.1.1. 中选择了毫米单位，则区域将以立方毫米为单位。如果需要，请通过选择ctrl+D 嵌入手绘选择。通过"编辑" 更改输出颜色|选项|颜色。将图像转换为 RGB 图像（图像|类型|RGB 颜色）在保存为.tif之前。
- 继续测量单个鼠标的所有含肿瘤切片，并复制值到适当的数据分析软件程序（例如，Microsoft Excel 或 GraphPad 棱镜）。
- 从每个切片的面积相和，以获得总肿瘤体积。确保根据切片厚度（面积/厚度）校正区域。
- 完成步骤 3.1.1.-3.1.5。直到所有的老鼠都有总的肿瘤体积鉴于概述肿瘤的主观性，如果采用相同方法重复多次并平均用于减少技术误差，则是理想的选择。
- 要设置比例条，请打开 DICOM 数据文件，然后转到 "分析 | " 工具 | 缩放栏。由于尺寸已嵌入到 DICOM 文件中，只需选择所需的长度/宽度。隐藏到 RGB 图像（图像 | 类型 | RGB 颜色）在保存为.tif之前。
- 在 ImageJ 中打开 MRI DICOM 数据文件，这是一个图像处理软件，可通过国家卫生研究院（https://imagej.nih.gov/ij/） 25 免费下载。
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Representative Results
图3概述了一只小鼠在两个时间点（第7天和第10天）注射后乳腺肿瘤细胞的肿瘤体积定量。在这个实验中，注射了50，000个DB7细胞，并且通过MRI对动物的大脑进行了评估。每次扫描，捕获 30 片（0.5 毫米厚度）。对每次扫描30片的评估显示，在注射后的第7天，5片表现出肿瘤负担（图3A），在注射后第10天，9片表现出肿瘤负担（图3B）。每个图像都按描述评估肿瘤区域，图3C中描述了每个帧的面积。根据切片厚度确定和调整肿瘤总体积。图4以公开格式描绘了具有代表性的数据，包括代表性图像（图4A）和肿瘤体积的直方图（图4B）。
图1：立体定向和麻醉系统。（A） 麻醉感应室设置在生物安全柜内。（B） 立体定向麻醉器输送装置，突出显示麻醉管从麻醉机到立体定向器械上的鼻锥（参见插入（C）。绿色箭头表示已交付的麻醉气体管，蓝色箭头表示已清除的气体管。（C） 带钻头附件的立体定向支架。内嵌显示麻醉管（绿色和蓝色箭头）、嘴条和耳条。（D） 带自动注射器泵和鼠标提升箱的立体定向支架。该盒是一个倒置的移液器尖端盒，包含用于将鼠标提升到适当高度并保持体温的暖手器。内嵌显示自动注射装置中汉密尔顿注射器的方向。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：在立体定向设备上牙齿放置的图形表示、耳杆位置和相对于 Bregma 的卡路里窗口。（A） 鼻锥上齿尖上最大切口的画像。（B） 左右耳杆在各耳的中耳杆内的位置。（C） 箭头表示白热化，红点表示应制作钙质窗口的位置（2毫米横向到下垂缝合线，1毫米左右的日冕缝合线）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：注射后两个时间点的单个小鼠肿瘤体积定量示例。注射后第10天含有肿瘤的切片图像（A） 第7天和（B）日。黄色表示图像J中量化的肿瘤区域。（C） 在 ImageJ 中确定的切片面积和总体积定量（*=切片厚度校正（0.5 mm）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：以出版格式具有代表性的肿瘤体积定量。（A） 具有刻度杆（±2 mm）的代表性图像。（B） 描述两个时间点的肿瘤体积 （mm3） 的直方图.注意到折叠更改。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
利用颅内注射，然后使用MRI进行串行监测，为肿瘤生长提供了独特的能力，使肿瘤体积在一段时间内具有准确性。数字成像分析的应用允许解释脑损伤的肿瘤体积，出血，坏死，和治疗的反应。
与任何过程一样，要取得成功，必须遵循一些关键步骤。首先，仔细设置立体定向设备是该技术成功的关键。由于小尺寸的鼠颅，轻微的不协调会导致肿瘤生长速度和实验动物的显著不同的影响。因此，有必要对使用这些文书进行适当的培训。其次，整个程序的加热源可确保麻醉面不会下降过低。低体温使动物面临在麻醉下突然死亡的风险，因为药物代谢减少和意外过量麻醉和/或可以延长恢复时间。预制加热垫可能笨重且难以在立体定向机器上四处操作，但通过任何商业供应商购买的小型空气激活手暖器可保持温度，且足够小，可放置在用于将鼠标提升到立体声设置的适当级别的倒置移液器尖端盒中。最后，量化是简单的，但往往确定什么是肿瘤与什么不是肿瘤可能是具有挑战性的。建议调查人员咨询成像人员，以确保准确的评估。重复肿瘤体积测量多次，以减少误差也很有帮助。此外，每个研究应该由同一个人分析所有图像。
根据用户首选项可以修改所介绍的协议。首先，注射麻醉（如氯胺酮/西拉辛）是常见的，当然可以使用代替吸入麻醉（例如，异氟烷），这取决于调查人员的喜好。然而，重要的是要考虑吸入麻醉的好处：（1）不是受控物质，（2）麻醉水平可以随着时间的推移进行调整（与动物体重决定的氯胺酮的前期剂量相比），（3）恢复相对较快，与氯胺酮/锡拉辛相比。其次，使用自动钻头可提供高精度，但考虑到设置和拆除装置所需的时间，可增加步骤的时间。如果需要，使用自由手法当然是合理的。
该协议既采用立体定向设置，也使用 MRI，两者都与成本增加有关。颅内注射的替代方法已描述前15，16，17，18，19。15,16,17,18,19其中一些方法还使用生物发光成像来监测肿瘤的生长在整个研究，如果愿意的话。
如上所述，根据所研究的模型系统确定正确的注射细胞号非常重要。将喃喃细胞注射到免疫功能宿主中往往比将人体细胞注射到免疫缺陷宿主中需要更少的细胞。MRI 注射后肿瘤负担监测有助于确定注射的细胞数量是否合适，因为可以查看肿瘤何时达到一定体积，以及小鼠何时开始达到早期切除标准。
MRI在非侵入性监测中的实用和广泛应用已被其他人用于小型动物研究26。虽然MRI提供了几个优点，正如已经讨论过的，确实有一些限制值得一提。首先，机器的使用取决于核心维修人员和机器的可用性。其次，使用成本可能很高。如果这些是关注，使用生物发光成像是肿瘤监测17，19,的有效替代。第三，肿瘤和周围组织（即大脑）之间的对比度可能因细胞系而异;然而，这种方法提供了在没有细胞标记的情况下识别体内肿瘤的最大机会。最后，MRI 的分辨率有限，它可以将肿瘤体积数据倾斜到似乎呈指数级增长的位置，而实际上增长是线性的。也有一个最大的肿瘤体积，可以通过 MR 成像获得，但这是一个不太令人担心的问题，因为它不太可能是小鼠生存的肿瘤在上端。肿瘤检测限值取决于肿瘤在大脑中的类型和位置、是否有血脑屏障渗漏，以及肿瘤是否受到良好限制或正在渗入周围组织。它还取决于它是否是一个对比增强肿瘤和使用什么类型的 MR 成像协议。根据我们的经验，平面体膜尺寸为 78x78 μm，切片厚度为 0.5 mm，我们经常可以观察到直径为 0.5 mm 的肿瘤，最小限制约为 0.3 mm。
关于颅内注射，有几个限制需要考虑。首先，颅内注射不反映转移级联，因为它们完全绕过了原发肿瘤内转移性的发展，进入血液，并通过血脑屏障11渗透。其次，通过直接注射到大脑中，这种方法诱导炎症，这可能混淆与神经炎症相关的发现。最后，直接注射这个网站可以在短时间内导致快速增长。监测小鼠的神经症状，包括后肢瘫痪、嗜睡和厌食症，是至关重要的。
所有考虑，直接注射到大脑允许监测肿瘤的接受率，它可以告诉研究人员在这个转移位点特别是生长以及与大脑转移微环境的相互作用。此外，随着时间的推移，肿瘤负担的监测使研究者能够直接比较改变的肿瘤表型、改变的微环境表型和对实验治疗策略的反应。鉴于小鼠模型中自发和实验脑转移的发生率相对较低，颅内技术确实是一个有价值的工具。
癌症转移到大脑是一个灾难性的诊断与不良反应目前的治疗策略1，11，27。,271,虽然乳腺癌是女性脑转移的主导因素，也是本文关注的焦点，而肺癌是所有癌症患者脑转移的最常见病因。此外，在诊断患有一系列实体肿瘤的患者中，脑转移报告，随着治疗颅外疾病的继续改善，预计发病率将继续增加。因此，虽然本建议的重点是BCBM，颅内癌注射和MRI分析适用于研究其他实体肿瘤类型以及原发性脑肿瘤的脑转移。利用脑转移的颅内注射模型，研究人员可以重述大量动物的疾病，以测试各种研究问题，希望得到更好的患者护理。通过将该模型与MRI获得的高分辨率数字图像耦合，可以监测多个时间点的肿瘤体积以及肿瘤对治疗的反应。
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Disclosures
提交人没有任何披露。
Acknowledgments
代表数据由国家癌症研究所（K22CA218472至G.M资助。在俄亥俄州立大学综合癌症中心目标验证共享资源（主任 – Reena Shakya 博士）中进行颅内注射，在俄亥俄州立大学综合癌症中心小动物成像共享资源（主任 – Kimerly Powell 博士）中进行 MRI。这两项共享资源都通过 OSUCCC、来自国家癌症研究所的 OSUCCC 癌症中心支持赠款 （P30 CA016058）、 与俄亥俄州立大学学院和部门的伙伴关系以及建立的退款系统提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M.
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S.
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al.
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J.
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
