Применение трехмерной uniaxial механической системы стимуляции биореактора, чтобы вызвать теногенную дифференциацию стволовых клеток, полученных из тендрионов
Summary
Трехмерная одноаксиальная механическая система стимуляции биореактора является идеальным биореактором для теногенной специфической дифференциации стволовых клеток, полученных из сухожилия, и формирования неопалендров.
Abstract
Тендинопатия является распространенным хроническим заболеванием сухожилий, связанных с воспалением и дегенерацией в ортопедической области. При высокой заболеваемости, ограниченных самовостимывающихся мощностях и, самое главное, отсутствии окончательного лечения, тендинопатия по-прежнему негативно влияет на качество жизни пациентов. Стволовые клетки, полученные из тендона (TDSCs), как первичные клетки-предшественники клеток сухожилий, играют важную роль как в развитии тендинопатии, так и в функциональном и структурном восстановлении после тендинопатии. Таким образом, метод, который может in vitro имитировать in vivo дифференциации TDSCs в сухожилия клеток было бы полезно. Здесь, настоящий протокол описывает метод, основанный на трехмерной (3D) uniaxial растяжения системы для стимулирования TDSCs дифференцировать в сухожилия, как ткани. Есть семь этапов настоящего протокола: изоляция мышей TDSCs, культура и расширение мышей TDSCs, подготовка среды культуры стимуляции для формирования клеточного листа, формирование клеточных листов путем культивирования в среде стимуляции, подготовка 3D сухожилия стволовых клеток построить, сборка одноасстекциального растяжения механического стимуляции комплекса, и оценка механических стимулировали в пробирке сухожилия, как ткань. Эффективность продемонстрировала гистология. Вся процедура занимает менее 3 недель. Для содействия внеклеточной матричной о осаждении, 4,4 мг/мл аскорбиновой кислоты был использован в среде культуры стимуляции. Отделенная камера с линейным двигателем обеспечивает точную механическую нагрузку и является портативной и легко регулируется, что применяется для биореактора. Режим загрузки в настоящем протоколе составил 6% напряжения, 0,25 Гц, 8 ч, а затем 16 ч отдыха в течение 6 дней. Этот протокол может имитировать дифференциацию клеток в сухожилии, что полезно для исследования патологического процесса тендинопатии. Кроме того, сухожилия, как ткань потенциально используется для содействия заживлению сухожилий в сухожилия травмы, как инженерии аутологичный трансплантат. Подводя итог, можно сказать, что нынешний протокол прост, экономизен, воспроизводен и действителен.
Introduction
Тендинопатия является одним из распространенных спортивных травм. Это в основном проявляется боль, местные отеки, снижение мышечного напряжения в пораженной области, и дисфункции. Заболеваемость тендинопатией высока. Присутствие ахиллесовой тендинопатии наиболее распространено у бегунов средней и дальнего следования (до 29%), в то время как наличие у спортсменов волейбола (45%), баскетбола (32%), легкой атлетики (23%), гандбола (15%) и футбола(13%) 1,,2,,3,,4,,5. Однако, из-за ограниченной самовосстановления способности сухожилия, и отсутствие эффективных методов лечения, тендинопатия по-прежнему влияет на жизнь пациентов негативно6,7. Кроме того, патогенез тендинопатии остается неясным. Там было много исследований о его патогенеза, в основном в том числе “теория воспаления”, “теория дегенерации”, “теория чрезмерного использования”, и такдалее 8. В настоящее время многие исследователи считают, что тендинопатия была из-за неудачного саморемонта микро-травм, вызванных чрезмерной механической нагрузкой сухожилия опытом9,10.
Тендоновые стволовые клетки (TDSCs), как основные клетки-предшественники клеток сухожилий, играют важную роль как в развитии тендинопатии, так и в функциональном и структурном восстановлении после тендинопатии11,,12,13. Сообщалось, что механическая стимуляция стресса может вызвать пролиферацию и дифференциацию остеоцитов, остеобластов, гладких мышечных клеток, фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток и других чувствительных к силе клеток14,,15,,16,17,18. Таким образом, TDSCs, как один из механосчувствительных и многопотентных клеток, также может быть стимулирован, чтобы дифференцировать по механической нагрузке19,20.
Однако различные параметры механической загрузки (сила загрузки, частота погрузки, тип погрузки и период загрузки) могут вызвать дифференцирование TDSCs в различные ячейки21. Таким образом, эффективный и действительный механический режим загрузки очень важен для теномеза. Кроме того, существуют различные виды биореакторов в качестве систем стимуляции, которые в настоящее время используются для обеспечения механической нагрузки на ТДК. Принципы каждого вида биореактора различны, поэтому параметры механической загрузки, соответствующие различным биореакторам, также отличаются. Поэтому спросом пользуется простой, экономичный и воспроизводимый протокол стимуляции, включающий тип биореактора, соответствующую стимулирую среду и механический режим загрузки.
В настоящей статье описывается метод, основанный на трехмерной (3D) униасивной системы растяжения, чтобы стимулировать TDSCs дифференцировать в сухожилия, как ткани. Есть семь этапов протокола: изоляция мышей TDSCs, культура и расширение мышей TDSCs, подготовка среды культуры стимуляции для формирования клеточного листа, формирование клеточных листов путем культивирования в стимуляции среды, подготовка 3D сухожилия стволовых клеток построить, сборка uniaxial-растяжения механического стимуляции комплекса, и оценка механических стимулировали в пробирке сухожилия, как ткань. Вся процедура занимает менее 3 недель, чтобы получить 3D-клеточную конструкцию, которая намного меньше, чем некоторые существующие методы22,23. Настоящий протокол был доказан, чтобы быть в состоянии побудить TDSCs дифференцировать в сухожилия ткани, и это более надежным, чем в настоящее время обычно используется двумерная (2D) протягивающая система21. Эффективность продемонстрировала гистология. Короче говоря, нынешний протокол прост, экономистителен, воспроизводим и действителен.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сухожилие является механосенцитивной волокнистой соединительной тканью. Согласно предыдущим исследованиям, избыточная механическая нагрузка может привести к остеогенной дифференциации стволовых клеток сухожилий, в то время как недостаточная загрузка приведет к неупорядоченной ст…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование проводилось в то время, когда автор получил “Международную стипендию Университета Западной Австралии и премию аспиранта университета в Университете Западной Австралии”. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81802214).
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
| Histology processor | Leica | TP 1020 | |
| Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
| Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
| Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
| Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
| Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |
References
- Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
- Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative incidence of achilles tendon rupture and tendinopathy in male former elite athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 15 (3), 133-135 (2005).
- Lian, O. B., Engebretsen, L., Bahr, R. Prevalence of jumper’s knee among elite athletes from different sports: a cross-sectional study. The American Journal of Sports Medicine. 33 (4), 561-567 (2005).
- Zwerver, J., Bredeweg, S. W., vanden Akker-Scheek, I. Prevalence of Jumper’s knee among nonelite athletes from different sports: a cross-sectional survey. The American Journal of Sports Medicine. 39 (9), 1984-1988 (2011).
- van der Worp, H., et al. Risk factors for patellar tendinopathy: a systematic review of the literature. British Journal of Sports Medicine. 45 (5), 446-452 (2011).
- Lopez, R. G. L., Jung, H. -. G. Achilles tendinosis: treatment options. Clinics in Orthopedic Surgery. 7 (1), 1-7 (2015).
- Wren, T. A., Yerby, S. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clinical Biomechanics. 16 (3), 245-251 (2001).
- Rees, J. D., Wilson, A. M., Wolman, R. L. Current concepts in the management of tendon disorders. Rheumatology. 45 (5), 508-521 (2006).
- Magnan, B., Bondi, M., Pierantoni, S., Samaila, E. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot and Ankle Surgery. 20 (3), 154-159 (2014).
- Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
- Bi, Y., et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nature Medicine. 13 (10), 1219-1227 (2007).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. BMP-2 mediates PGE(2) -induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 30 (2), 47-52 (2012).
- Chen, L., et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. Journal of Orthopaedic Research. 30 (6), 991-997 (2012).
- Wang, J., et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death & Disease. 7 (5), 2221 (2016).
- Parvizi, M., Bolhuis-Versteeg, L. A. M., Poot, A. A., Harmsen, M. C. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular Tissue Engineeringineering. Biotechnology Journal. 11 (7), 932-944 (2016).
- Sun, L., et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells International. 2016, 9842075 (2016).
- Lin, X., Shi, Y., Cao, Y., Liu, W. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomedical Materials. 11 (1), 014109 (2016).
- Li, R., et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Research International. 2015, 873251 (2015).
- Zhang, J., Wang, J. H. C. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskeletal Disorders. 11, 10-10 (2010).
- Liu, X., Chen, W., Zhou, Y., Tang, K., Zhang, J. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 36 (2), 517-530 (2015).
- Wang, T., et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB Journal. 32 (9), 4804-4814 (2018).
- Calve, S., et al. Engineering of functional tendon. Tissue Engineering. 10 (5-6), 755-761 (2004).
- Kostrominova, T. Y., Calve, S., Arruda, E. M., Larkin, L. M. Ultrastructure of myotendinous junctions in tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Histology & Histopathology. 24 (5), 541-550 (2009).
- Wagner, J. R., Taguchi, T., Cho, J. Y., Charavaryamath, C., Griffon, D. J. Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56810 (2018).
- Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical Testing of Murine Tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
- Hsiao, M. Y., et al. The Effect of the Repression of Oxidative Stress on Tenocyte Differentiation: A Preliminary Study of a Rat Cell Model Using a Novel Differential Tensile Strain Bioreactor. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), (2019).
- Morita, Y., et al. The optimal mechanical condition in stem cell-to-tenocyte differentiation determined with the homogeneous strain distributions and the cellular orientation control. Biology Open. 8 (5), 0339164 (2019).
- Shukunami, C., Oshima, Y., Hiraki, Y. Molecular cloning of tenomodulin, a novel chondromodulin-I related gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (5), 1323-1327 (2001).
- Murchison, N. D., et al. Regulation of tendon differentiation by scleraxis distinguishes force-transmitting tendons from muscle-anchoring tendons. Development. 134 (14), 2697-2708 (2007).
- Liu, W., et al. The atypical homeodomain transcription factor Mohawk controls tendon morphogenesis. Molecular and Cellular Biology. 30 (20), 4797-4807 (2010).
- Chang, J., Thunder, R., Most, D., Longaker, M. T., Lineaweaver, W. C. Studies in flexor tendon wound healing: neutralizing antibody to TGF-beta1 increases postoperative range of motion. Plastic and Reconstructive Surgery. 105 (1), 148-155 (2000).
- Bennett, N. T., Schultz, G. S. Growth factors and wound healing: biochemical properties of growth factors and their receptors. American Journal of Surgery. 165 (6), 728-737 (1993).
- Wòjciak, B., Crossan, J. F. The effects of T cells and their products on in vitro healing of epitenon cell microwounds. Immunology. 83 (1), 93-98 (1994).
- Marui, T., et al. Effect of growth factors on matrix synthesis by ligament fibroblasts. Journal of Orthopaedic Research. 15 (1), 18-23 (1997).
- Ni, M., et al. Engineered scaffold-free tendon tissue produced by tendon-derived stem cells. Biomaterials. 34 (8), 2024-2037 (2013).
- Trumbull, A., Subramanian, G., Yildirim-Ayan, E. Mechanoresponsive musculoskeletal tissue differentiation of adipose-derived stem cells. Biomedical Engineering Online. 15, 43 (2016).
- Wang, T., et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnology and Bioengineering. 110 (5), 1495-1507 (2013).
- Nirmalanandhan, V. S., et al. Effect of scaffold material, construct length and mechanical stimulation on the in vitro stiffness of the engineered tendon construct. Journal of Biomechanics. 41 (4), 822-828 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly(ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Engineeringineering. Part A. 16 (11), 3457-3466 (2010).
- Altman, G. H., et al. Advanced bioreactor with controlled application of multi-dimensional strain for Tissue Engineeringineering. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (6), 742-749 (2002).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. Journal of Biomechanics. 39 (6), 1136-1144 (2006).
- Parent, G., Huppé, N., Langelier, E. Low stress tendon fatigue is a relatively rapid process in the context of overuse injuries. Annals of Biomedical Engineering. 39 (5), 1535-1545 (2011).
- Wang, T., et al. Bioreactor design for tendon/ligament engineering. Tissue Engineeringineering. Part B, Reviews. 19 (2), 133-146 (2013).
- Smith, R. K. Mesenchymal stem cell therapy for equine tendinopathy. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1752-1758 (2008).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Journal of Equine Veterinary Science. 44 (1), 25-32 (2012).
- Lacitignola, L., Crovace, A., Rossi, G., Francioso, E. Cell therapy for tendinitis, experimental and clinical report. Veterinary Research Communications. 32, 33-38 (2008).
- Del Bue, M., et al. Equine adipose-tissue derived mesenchymal stem cells and platelet concentrates: their association in vitro and in vivo. Veterinary Research Communications. 32, 51-55 (2008).
- Awad, H. A., et al. Repair of patellar tendon injuries using a cell-collagen composite. Journal of Orthopaedic Research. 21 (3), 420-431 (2003).
