Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.
La tendinopatía es una enfermedad del tendón crónico común relacionada con la inflamación y la degeneración en un área ortopédica. Con alta morbilidad, capacidad de autorreparación limitada y, lo que es más importante, sin tratamientos definitivos, la tendinopatía todavía influye negativamente en la calidad de vida de los pacientes. Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendones, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía. Por lo tanto, un método que puede imitar in vitro la diferenciación in vivo de los ETDSC en las células tendinosas sería útil. Aquí, el presente protocolo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejidos similares a los tendones. Existen siete etapas del presente protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. La eficacia fue demostrada por la histología. Todo el procedimiento toma menos de 3 semanas. Para promover la deposición de matriz extracelular, se utilizó 4,4 mg/ml de ácido ascórbico en el medio de cultivo de estimulación. Una cámara separada con un motor lineal proporciona una carga mecánica precisa y es portátil y se ajusta fácilmente, que se aplica para el biorreactor. El régimen de carga en el presente protocolo fue 6% cepa, 0,25 Hz, 8 h, seguido de 16 h de descanso durante 6 días. Este protocolo podría imitar la diferenciación celular en el tendón, lo cual es útil para la investigación del proceso patológico de tendinopatía. Por otra parte, el tejido similar al tendón se utiliza potencialmente para promover la cicatrización del tendón en la lesión del tendón como un injerto autólogo diseñado. En resumen, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.
La tendinopatía es una de las lesiones deportivas comunes. Se manifiesta principalmente por el dolor, hinchazón local, disminución de la tensión muscular en la zona afectada, y disfunción. La incidencia de tendinopatía es alta. La presencia de tendinopatía de Aquiles es más común para los corredores de media y larga distancia (hasta 29%), mientras que la presencia de tendinopatía rotuliana también es alta en los atletas de voleibol (45%), baloncesto (32%), pista y campo (23%), balonmano (15%), y fútbol (13%)1,,2,3,,4,5. Sin embargo, debido a la limitada capacidad de autocuración del tendón, y la falta de tratamientos eficaces, la tendinopatía todavía influye en la vida de los pacientes negativamente6,7. Además, la patogénesis de la tendinopatía sigue sin estar clara. Ha habido muchas investigaciones sobre su patogénesis, incluyendo principalmente “teoría de la inflamación”, “teoría de la degeneración”, “teoría del uso excesivo”, y así sucesivamente8. En la actualidad, muchos investigadores creían que la tendinopatía se debía a la reparera fallida de las microlesiones causadas por la carga mecánica excesiva del tendón experimenta9,,10.
Las células madre derivadas del tendón (TDSC), como células precursoras primarias de las células tendonesas, desempeñan un papel esencial tanto en el desarrollo de la tendinopatía como en la restauración funcional y estructural después de la tendinopatía11,12,13. Se informó que la estimulación mecánica del estrés podría causar la proliferación y diferenciación de osteocitos, osteoblastos, células musculares lisas, fibroblastos, células madre mesenquimales y otras células sensibles a la fuerza14,15,16,17,18. Por lo tanto, los TDSC, como una de las células mecanósensibles y multipotentes, pueden ser estimulados de manera similar para diferenciar por carga mecánica19,20.
Sin embargo, diferentes parámetros de carga mecánica (fuerza de carga, frecuencia de carga, tipo de carga y período de carga) pueden inducir a los TDSC a diferenciarse en diferentes celdas21. Por lo tanto, un régimen de carga mecánica eficaz y válido es muy significativo para la tenogénesis. Además, existen diferentes tipos de biorreactores como sistemas de estimulación utilizados actualmente para proporcionar carga mecánica a los TDSC. Los principios de cada tipo de biorreactor son diferentes, por lo que los parámetros de carga mecánica correspondientes a diferentes biorreactores también son diferentes. Por lo tanto, se demanda un protocolo de estimulación simple, económico y reproducible, incluyendo el tipo de biorreactor, el medio de estimulación correspondiente y el régimen de carga mecánica.
El presente artículo describe un método basado en un sistema de estiramiento uniaxial tridimensional (3D) para estimular a los TDSC a diferenciarse en tejido similar al tendón. Hay siete etapas del protocolo: aislamiento de ratones TDSC, cultivo y expansión de ratones TDSC, preparación de medio de cultivo de estimulación para la formación de láminas celulares, formación de láminas celulares mediante el cultivo en medio de estimulación, preparación de la construcción de células madre del tendón 3D, montaje del complejo de estimulación mecánica de estiramiento uniaxial, y evaluación del tejido mecánico estimulado en forma de tendón in vitro. Todo el procedimiento tarda menos de 3 semanas en obtener la construcción de la célula 3D, que es mucho menor que algunos métodos existentes22,,23. Se ha demostrado que el presente protocolo es capaz de inducir a los ETS para que se diferencien en tejido tendino, y es más fiable que el sistema de estiramiento bidimensional (2D) de uso comúnactual 21. La eficacia fue demostrada por la histología. En definitiva, el presente protocolo es simple, económico, reproducible y válido.
El tendón es un tejido conectivo fibroso mecanosensible. Según investigaciones anteriores, el exceso de carga mecánica podría conducir a la diferenciación osteogénica de las células madre del tendón, mientras que la carga insuficiente conduciría a una estructura desordenada de la fibra de colágeno durante la diferenciación del tendón21.
Una opinión común es que la clave para un biorreactor ideal es la capacidad de simular el microambiente celular in vitro …
The authors have nothing to disclose.
La investigación se llevó a cabo mientras el autor estaba en la recepción de “una beca de tasa internacional de la Universidad de Australia Occidental y un premio de postgrado de la universidad en la Universidad de Australia Occidental”. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81802214).
Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
Histology processor | Leica | TP 1020 | |
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |