نظام ثلاثي الأبعاد للتحفيز الميكانيكي أحادي الأبعاد هو مفاعل حيوي مثالي للتمايز التنغيم الخاص بالخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار وتكوين الأوتار الجديد.
اعتلال التناد هو مرض شائع من أمراض الوتر المزمن المتعلقة بالالتهاب والانحطاط في منطقة تقويم العظام. مع ارتفاع معدلات المراضة، والقدرة على إصلاح الذات محدودة، والأهم من ذلك، لا علاجات نهائية، اعتلال الأوتار لا يزال يؤثر على نوعية حياة المرضى سلبا. الخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار (TDSCs) ، كخلايا أولية أولية من خلايا الأوتار ، تلعب دورًا أساسيًا في تطور اعتلال الأوتار ، والاستعادة الوظيفية والهيكلية بعد اعتلال الأوتار. وهكذا، فإن الطريقة التي يمكن في المختبر تقليد التمايز في الجسم الحي من TDSCs في خلايا الأوتار سيكون من المفيد. هنا، يصف هذا البروتوكول طريقة تستند إلى نظام تمدد أحادي الأبعاد ثلاثي الأبعاد (3D) لتحفيز TDSCs على التفريق في أنسجة تشبه الأوتار. هناك سبع مراحل من البروتوكول الحالي: عزل ماوس TDSCs, ثقافة وتوسع فئران TDSCs, إعداد الحفز ثقافة المتوسطة لتشكيل ورقة الخلية, تشكيل ورقة الخلية عن طريق زراعة في التحفيز المتوسطة, إعداد 3D وتر الخلايا الجذعية بناء, تجميع مجمع التحفيز الميكانيكية أحادية التمدد, وتقييم الميكانيكية حفز في النسيج مثل وتر فيترو. وقد أثبتت الأنسجة فعالية. تستغرق العملية بأكملها أقل من 3 أسابيع. لتعزيز ترسب المصفوفة خارج الخلية، تم استخدام 4.4 ملغ/مل حمض الاسكوربيك في المحفزات المتوسطة الثقافة. غرفة منفصلة مع محرك خطي يوفر دقة التحميل الميكانيكية وقابل للنقل وتعديلها بسهولة، والتي يتم تطبيقها على مفاعل حيوي. وكان نظام التحميل في هذا البروتوكول 6٪ سلالة، 0.25 هرتز، 8 ساعة، تليها 16 ساعة من الراحة لمدة 6 أيام. يمكن أن يحاكي هذا البروتوكول تمايز الخلايا في الوتر ، وهو مفيد للتحقيق في العملية المرضية لاعتلال الوتر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم الأنسجة الشبيهة بالوتر لتعزيز شفاء الأوتار في إصابة الأوتار ككسب غير مشروع ذاتي هندسي. وخلاصة القول إن هذا البروتوكول بسيط واقتصادي ويمكن استنساخه وصحته.
اعتلال التتناد هو واحد من الإصابات الرياضية الشائعة. ويتجلى ذلك أساسا من الألم, تورم المحلية, انخفاض التوتر العضلي في المنطقة المصابة, والخلل الوظيفي. الإصابة باعتلال الوتار عالية. وجود اعتلال الأوتار أخيل هو الأكثر شيوعا للعدائين المسافات المتوسطة والطويلة (تصل إلى 29٪)، في حين أن وجود اعتلال الأوتار الرضفة أيضا عالية في الرياضيين من الكرة الطائرة (45٪)، وكرة السلة (32٪)، والمضمار والميدان (23٪)، وكرة اليد (15٪)، وكرة القدم (13٪)1،,2،,3،,4،,5. ومع ذلك ، بسبب قدرة محدودة على الشفاء الذاتي من وتر ، وعدم وجود علاجات فعالة ، والاعتلال لا يزال يؤثر على حياة المرضى سلبا6،7. وعلاوة على ذلك، لا يزال من غير الواضح التسبب في اعتلال التناد. كانت هناك العديد من التحقيقات حول مسببات المرض ، بما في ذلك أساسا “نظرية الالتهاب” ، “نظرية الانحطاط” ، “نظرية الإفراط في الاستخدام” ، وهكذا4. في الوقت الحاضر، يعتقد العديد من الباحثين أن اعتلال الأوتار كان بسبب فشل الإصلاح الذاتي للإصابات الدقيقة الناجمة عن التحميل الميكانيكي المفرط لتجارب وتر9،10.
الخلايا الجذعية المشتقة من الأوتار (TDSCs) ، كخلايا أولية لخلايا الأوتار ، تلعب دورًا أساسيًا في تطوير اعتلال الأوتار والاستعادة الوظيفية والهيكلية بعد اعتلال الأوتار11،12،13. وأفيد أن التحفيز العصبي الميكانيكي يمكن أن يسبب انتشار وتمايز osteocytes، والعظام، والخلايا العضلية الملساء، الخلايا الليفية، والخلايا الجذعية mesenchymal وغيرها من الخلايا الحساسة للقوة14،15،16،17،18. ولذلك، TDSCs، باعتبارها واحدة من الخلايا الحساسية ومتعددة القدرات، ويمكن أيضا أن يكون حافزا للتمييز عن طريق تحميل الميكانيكية19،20.
ومع ذلك، يمكن أن المعلمات تحميل الميكانيكية المختلفة (قوة التحميل، تردد التحميل، نوع التحميل وفترة التحميل) يمكن أن تحفز TDSCs للتمييز في خلايا مختلفة21. وبالتالي ، فإن نظام التحميل الميكانيكية الفعالة والصالحة مهم جدًا بالنسبة لـ tenogenesis. وعلاوة على ذلك، هناك أنواع مختلفة من المفاعلات الحيوية كأنظمة تحفيز تستخدم حالياً لتوفير التحميل الميكانيكي للبلدان النامية. مبادئ كل نوع من مفاعلات الحيوية مختلفة ، وبالتالي فإن المعلمات التحميل الميكانيكية المقابلة لمختلف المفاعلات الحيوية هي أيضا مختلفة. ولذلك، فإن بروتوكول التحفيز البسيط والاقتصادي والقابل للاستنساخ مطلوب، بما في ذلك نوع مفاعل حيوي، ووسيلة التحفيز المقابلة، ونظام التحميل الميكانيكي.
وتصف هذه المقالة طريقة تستند إلى نظام تمدد أحادي الأبعاد ثلاثي الأبعاد (3D) لتحفيز TDSCs على التفريق في أنسجة تشبه الأوتار. هناك سبع مراحل من البروتوكول: عزل TDSCs الفئران، والثقافة والتوسع في الفئران TDSCs، وإعداد ثقافة التحفيز المتوسطة لتشكيل ورقة الخلية، وتشكيل ورقة الخلية عن طريق زراعة في التحفيز المتوسط، وإعداد 3D وتر الخلايا الجذعية بناء، وتجميع مجمع التحفيز الميكانيكية أحادية التمدد، وتقييم الميكانيكية حفز في الأنسجة مثل وتر فيترو. الإجراء كله يستغرق أقل من 3 أسابيع للحصول على بناء الخلية 3D، وهو أقل بكثير من بعض الأساليب القائمة22،23. وقد ثبت أن البروتوكول الحالي قادر على حث TDSCs على التفريق في أنسجة الأوتار ، وهو أكثر موثوقية من نظام التمدد ثنائي الأبعاد (2D) الحالي الشائع الاستخدام (2D). وقد أثبتت الأنسجة فعالية. وباختصار، فإن هذا البروتوكول بسيط واقتصادي ويمكن استنساخه وصحته.
وتر هو نسيج الضام الليفي الليفي النياني. وفقا للبحوث السابقة، التحميل الميكانيكية الزائدة يمكن أن تؤدي إلى تمايز العظم من الخلايا الجذعية وتر، في حين أن التحميل غير كافية من شأنه أن يؤدي إلى اضطراب هيكل الألياف الكولاجين خلال التمايز وتر21.
وهناك رأي شائع هو أن …
The authors have nothing to disclose.
وقد أجري البحث بينما كان صاحب البلاغ يحصل على “منحة دراسية من جامعة غرب أستراليا للحصول على رسوم دولية وجائزة للدراسات العليا الجامعية في جامعة غرب أستراليا”. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية الصينية (81802214).
Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
Histology processor | Leica | TP 1020 | |
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |