三维单轴机械刺激生物反应器系统是肌腱衍生干细胞和新肌腱形成具有致源特异性分化的理想生物反应器。
肌腱病是一种常见的慢性肌腱疾病,与骨科区域的炎症和退化有关。由于发病率高,自我修复能力有限,最重要的是,没有明确的治疗,肌腱病仍然对患者的生活质量产生负面影响。肌腱衍生干细胞(TDSCs)作为肌腱细胞的原发性前体细胞,在肌腱病的发育以及肌腱病后的功能和结构恢复都起着至关重要的作用。因此,一种在体外模拟TDSC在体内分化为肌腱细胞的方法将是有用的。在这里,本协议描述了一种基于三维(3D)单轴拉伸系统的方法,以刺激TDSC分化成跟腱样组织。本方案分为七个阶段:小鼠TDSC的分离、小鼠TDSC的培养和扩张、细胞表形成刺激培养的制备、刺激培养的细胞片的形成、3D肌腱干细胞结构的准备、单轴拉伸机械刺激复合物的组装以及体外肌腱类组织的机械刺激评估。组织学证明了这种有效性。整个过程需要不到3周的时间。为了促进细胞外基质沉积,在刺激培养基中使用了4.4mg/mL抗坏血酸。带线性电机的分离室提供精确的机械载荷,便于携带且易于调整,适用于生物反应器。本协议的装载方案为6%应变,0.25赫兹,8小时,随后16小时休息6天。该协议可以模拟肌腱的细胞分化,有助于肌腱病的病理过程研究。此外,肌腱般的组织有可能用于促进肌腱愈合在肌腱损伤作为工程自体移植。综上关于本议定书简单、经济、可重复、有效的方案。
肌腱病是常见的运动损伤之一。它主要表现在疼痛、局部肿胀、受影响区域肌肉张力减轻和功能障碍。肌腱病的发生率很高。跟腱病的存在是最常见的中长跑运动员(高达29%),而在排球运动员(45%),篮球(32%),田径(23),手球(15%)和足球(13%)1,2,3,4,51,2,3,4的运动员也高。然而,由于肌腱自我修复能力有限,缺乏有效的治疗方法,肌腱病仍然对患者的生活产生负面影响,。此外,肌腱病的发病机制尚不清楚。关于其发病机制的研究已经很多,主要包括”炎症论”,”退化论”,”过度使用理论“等。目前,许多研究人员认为,肌腱病是由于自我修复失败造成的微损伤造成的过度机械负荷肌腱经验9,9,10。
肌腱衍生干细胞(TDSCs)作为肌腱细胞的原发性前体细胞,在肌腱病,11、12、13,12之后,在肌腱病的发育和功能及结构恢复中起着至关重要的作用。据报道,机械应激刺激可引起骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、中质干细胞和其他力敏感细胞的增殖和分化,14、15、16、17、18。14,15,16,17,18因此,TDSC,作为机械敏和多能细胞之一,同样可以通过机械载荷19,20来刺激,以区分。
然而,不同的机械载荷参数(装载强度、装载频率、载荷类型和装载周期)可以诱导TDSC分化成不同的单元21。因此,一个有效和有效的机械载荷制度对于肿瘤的发生具有非常重要意义。此外,还有不同类型的生物反应器作为刺激系统,目前用于向TDSC提供机械载荷。每种生物反应器的原理不同,因此对应不同生物反应器的机械载荷参数也不同。因此,需要一种简单、经济、可重复的刺激方案,包括生物反应器的类型、相应的刺激介质和机械载荷装置。
本文介绍了一种基于三维(3D)单轴拉伸系统的方法,以刺激TDSC分化成肌腱样组织。该协议分为七个阶段:小鼠TDSC的分离、小鼠TDSC的培养和扩张、细胞表形成刺激培养的制备、刺激培养的细胞表的形成、3D肌腱干细胞结构的准备、单轴拉伸机械刺激复合物的组装以及机外肌腱类组织的评价。整个过程需要不到3周的时间才能获得3D细胞构造,这远远低于一些现有的方法22,23。22,本协议已被证明能够诱导TDSC分化成肌腱组织,它比目前常用的二维(2D)拉伸系统21更可靠。组织学证明了这种有效性。简言之,本议定书简单、经济、可重复、有效。
肌腱是一种机械性纤维结缔组织。根据先前的研究,机械负荷过多可能导致肌腱干细胞的骨质分化,而负荷不足会导致肌腱分化期间胶原纤维结构紊乱。
一个普遍的观点是,理想的生物反应器的关键是能够模拟体内细胞微环境,细胞在体内经历的能力。因此,在体外模仿体内正常应激环境是刺激TDSC单谱分化到肌腱细胞的关键。在目前的协议中,TDSC构造的宽…
The authors have nothing to disclose.
这项研究是在提交人获得”西澳大利亚大学国际学费奖学金和西澳大利亚大学研究生奖”时进行的。这项工作得到了国家自然科学基金(81802214)的支持。
Ascorbic acid | Sigma-aldrich | PHR1008-2G | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibcoä by Life Technologies | 1908361 | |
Histology processor | Leica | TP 1020 | |
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM) | Gibcoä by Life Technologies | 2003802 | |
Mouse Tendon Derived Stem Cell | Isolated from Achilles tendons of 6- to 8-wk-old C57BL/6 mice. Then digested with type I collagenase (3 mg/ml; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) for 3 h and passed through a 70 mmcell strainer to yield single-cell suspensions. | ||
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | 441244 | |
Streptomycin and penicillin mixture | Gibcoä by Life Technologies | 15140122 | |
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System | Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia | Available from the corresponding author upon request. Or make it according to our design* *Wang T, Lin Z, Day RE, et al. Programmable mechanical stimulation influences tendon homeostasis in a bioreactor system. Biotechnol Bioeng. 2013;110(5):1495–1507. doi:10.1002/bit.24809 | |
Trypsin | Gibcoä by Life Technologies | 1858331 |