Summary
Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.
Abstract
Die optogenetische Modulation von Neuronensubpopulationen im Gehirn hat es Forschern ermöglicht, neuronale Schaltkreise in vivo und ex vivo zu sezieren. Dies bietet eine Voraussetzung für die Bestimmung der Rolle von Neuronentypen innerhalb eines neuronalen Schaltkreises und ihrer Bedeutung für die Informationscodierung in Bezug auf das Lernen. Ebenso kann die Methode verwendet werden, um die physiologische Bedeutung von zwei oder mehr miteinander verbundenen Hirnregionen bei wachen und betäubten Tieren zu testen. Die aktuelle Studie zeigt, wie VTA-Glutamat-Neuronen die Feuerrate von mutmaßlichen Pyramidenneuronen im CA1 (Hippocampus) anästhesierter Mäuse modulieren. Dieses Protokoll verwendet adeno-assoziierte Virus (AAV)-abhängige Markierung von VTA-Glutamat-Neuronen für die Rückverfolgung von VTA-präsynaptischen Glutamat-Terminals in den Schichten des Hippocampus. Die Expression von lichtgesteuertem Opsin (Channelrhodopsin; hChR2) und Fluoreszenzprotein (eYFP), die durch den AAV-Vektor beherbergt werden, ermöglichte die anterograde Rückverfolgung von VTA-Glutamatterminals und die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronenzellkörpern (im VTA). Hochimige akute Siliziumelektroden wurden im CA1 positioniert, um Reaktionen von mehreren einheiten und einzelnen Einheiten auf VTA-Photostimulation in vivo zu erkennen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von präsynaptischen VTA-Glutamatterminals im Hippocampus (CA1, CA3 und DG). Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die Feuer- und Burst-Rate von mutmaßlichen CA1-Pyramideneinheiten in vivo.
Introduction
In den letzten zehn Jahren wurde eine Reihe genetischer Werkzeuge entwickelt, um die Spezifität der Modulation vom Neuronentyp und die Kartierung komplexer neuronaler Netze zu erhöhen1. Insbesondere neurotrope Viren mit einer inhärenten Fähigkeit, sich in neuronalen Zellen zu infizieren und zu replizieren, wurden eingesetzt, um bestimmte Proteine in Neuronensubtypen zu exprimieren oder abtränken. Bei der Unterung von Fluoreszenzproteinen oder genetisch kodierten synaptischen Aktivitätsindikatoren kennzeichnen und beschreiben transfizierte AAV-Vektoren neuronale Netzwerke über Gehirnregionen hinweg2,3. Die Wahl eines Promotors im AAV-Konstrukt steuert die Expression des Vektors in Neuronentypen mit einem gewissen Grad an Spezifität(promotorabhängige Expression). Durch die Cre-lox-Rekombination werden AAV-Konstrukte jedoch mit größerer Spezifität für die Neuronenmarkierung4,5,6,7eingesetzt. Bemerkenswert ist, dass photoaktivierte mikrobielle Opsine und Fluoreszenzproteine, die in AAV-Vektoren verpackt sind, in verschiedenen Neuronensubtypen8exprimiert werden können und ideal für die Bildgebung, die Verfolgung von Neuronenschaltungen und die Photomodulation9,10sind.
AAVs-Konstrukte, die stereotaktisch in eine Gehirnregion (oder einen Zellkern) injiziert werden, treiben die Expression des Reporterproteins in den Terminals soma, Dendriten und Axone an. Die neuronale Expression von AAV, die ein Reportergen (eYFP) beherbergt, erleichtert die Markierung von Neuronenzellkörpern und die anatomische Verfolgung von Projektionen zu und von anderen Gehirnregionen11,12,13,14. AAV-eYFP-Konstrukte, die lichtgesteuertes Opsin (z. B. hChR2) tragen, können als Werkzeug für die Bildgebungvon 6,15 und die stimulationsbasierte physiologische Verfolgung neuronaler Projektionen auf Hirnareale in vivo16eingesetzt werden. Abhängig vom AAV-Serotyp kann die Richtung der Neuronenmarkierung anterograde oder retrograd sein11,12. Frühere Studien haben ergeben, dass AAV5 anterograde in Neuronenreist 12. So erzeugt die Photostimulation von Zellkörpern, die hChR2 exprimieren, präsynaptische Effekte an anderer Stelle im Gehirn (Ziel)17.
Hier wurde AAV (Serotyp 5) mit einem CaMKIIα-Promotor verwendet, um eYFP (Reporter) und hChR2 (Opsin) in VTA-Glutamat-Neuronen und axonalen Projektionen zu exprimieren. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von VTA-Glutamat-präsynaptischen Terminals in den Hippocampusregionen CA1, CA3 und DG. Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die CA1-Feuerraten mit mehreren Einheiten und Einzeleinheiten in vivo im Vergleich zu den Ausgangswerten. Dieses Protokoll verwendet erschwingliche Tools und kommerziell erhältliche Software, die die Qualität der Daten aus neuronalen Schaltkreis-Tracing-Experimenten erhöhen können.
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Protocol
Alle experimentellen und Tierhandhabungsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Louisiana State University School of Veterinary Medicine genehmigt.
1. Versuchstier
- Verwenden Sie 5-6 Wochen alte Mäuse.
- Haus 3-5 Tiere pro Käfig unter Standardbedingungen von 12 h abwechselnd Hell-Dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser sollten ad libitum zur Verfügung gestellt werden.
2. Kraniotomie und tierische Zubereitung
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden prä- und perioperative Verfahren zur Kraniotomie bei der Maus beschrieben. Verwenden Sie Standard-stereotaktische Geräte und geeignete Koordinaten (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML und Dorsoventral: DV). Beziehen Sie sich auf einen Maus-Hirnatlas, um die Koordinaten für die interessierenden Gehirnregion zu bestimmen.
- Anästhesie von Mäusen durch intraperitoneale Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) Cocktailinjektion. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass vor Beginn der Operation keine Empfindung auftritt.
HINWEIS: Alternativ kann für diesen Schritt auch eine Isoflurananästhesie mit entsprechender Nasenkammer verwendet werden. - Befestigen Sie den Kopf des Tieres vorsichtig auf dem stereotaktischen Apparat.
HINWEIS: Es ist wichtig, während dieses Prozesses mit Tieren vorsichtig umzugehen. Überprüfen Sie auch die Atemfrequenz und andere Vitalwerte, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Lassen Sie das Tier für ~ 7 Minuten ruhen, um Stress abzubauen.- Legen Sie ein Heizkissen auf den stereotaxischen Rahmen, so dass der Körper des Tieres darauf liegt. Dies wird dazu beitragen, die Körpertemperatur zu halten und das Tier während des Verfahrens warm zu halten. Bewahren Sie das Heizkissen für die postoperative Pflege und Genesung auf.
- Verwenden Sie einen Clipper, um Haare über der Kopfhaut zu entfernen und reinigen Sie die Haut mit einer Jodlösung.
- Tragen Sie topisches Lidocain auf, um das Gefühl auf der Kopfhaut zu blockieren.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Mittellinienschnitt der Kopfhaut zu machen, der sich von der frontalen bis zur Okzipitalregion erstreckt.
- Reinigen Sie den Schnittbereich mit Jodlösung und legen Sie dann die Kalvarie frei.
HINWEIS: Eine kleine Menge 3% iger Wasserstoffperoxidlösung kann aufgetragen werden, um Periost aus der Calvaria zu entfernen. Dies erhöht die Sichtbarkeit von Landmarken (Bregma und Lambda) und Nähten. - Bestimmen Sie mit einem stereotaktischen Atlas des Mausgehirns ap- und ML-Koordinaten relativ zum Bregma.
- Positionieren Sie für die VTA-Injektion eine ultrafeine Stumpfpunktnadelspritze (z. B. Neuros-Spritze) an den Koordinaten AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm relativ zum Bregma.
- Verwenden Sie ein Bohrwerkzeug, um ein 1 mm Loch (Kraniotomie) in den Schädel an der markierten AP / ML-Koordinate zu bohren.
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert ein erhebliches Maß an Vorsicht. Während des Bohrens sollte minimaler Druck ausgeübt werden, um zu verhindern, dass der Bohrer das Hirngewebe zerquetscht. In der aktuellen Studie betrug der Bohrer 0,8 mm und die Bohrgeschwindigkeit wurde auf 15.000 U / min eingestellt.
VORSICHT: Wenn Wasserstoffperoxid bei der Reinigung des Schnitts oder der Kalvarie verwendet wurde, stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig entfernt wird oder lassen Sie vor dem Bohren eine vollständige Trockenheit zu.
3. AAV Cocktail Injektion
HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt den Prozess für die AAV-Injektion in den VTA von erwachsenen C57BL/6-Mäusen (23-27 g). Die beschriebene Methode kann für die AAV-Injektion in jede Gehirnregion unter Verwendung von Standard-stereotaktischen Geräten und geeigneten Koordinaten verwendet werden. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, wurden eYFP und hChR2 in VTA-Glutamat-Neuronen unter Verwendung einer AAV5-vermittelten Transfektion unter einem CaMKIIα-Promotor exprimiert (Abbildung 1). Cre-lox Rekombination kann auch für diesen Schritt verwendet werden.
- Montieren Sie eine Spritze mit ultrafeiner Stumpfpunktnadel (32 G; 5 μL Kapazität mit 100 nL Genauigkeit) auf einem Injektor. Befestigen Sie den Spritzenhalter auf einem Mikromanipulator.
HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde ein manueller Spritzenhalter mit 1,6 nL Kalibrierung verwendet. Ein automatisierter Injektor kann ebenfalls verwendet werden. - Füllen Sie die Spritze mit doppelt destilliertem Wasser, um den Flüssigkeitsfluss zu reinigen und zu testen.
- Aliquoten von AAV (Serotyp 5) Cocktail auf Eis auftauen. AAVs werden am besten bei -80 °C gelagert, um den viralen Titer für eine gute Expression aufrechtzuerhalten.
- Füllen Sie die montierte Spritze mit 1.000 nL AAV-Lösung (10 mM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4). Geben Sie 10 nL der AAV-Lösung ab, um den Flüssigkeitsfluss zu bestätigen, bevor Sie die Nadel in eine Injektionsstelle absenken.
- Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Nadel stereotaktisch in die gewünschte Tiefe (DV-Koordinate) abzusenken. Nachdem Sie die Nadel auf die gewünschte Tiefe abgesenkt haben, lassen Sie die Spritze vor der Injektion 10 Minuten an Ort und Stelle bleiben.
HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde die Nadel in einer Tiefe (DV) von 4,5 mm von der Pialoberfläche des Gehirns in den VTA abgesenkt. Für andere Hirnareale verwenden Sie die entsprechende dorsoventrale Koordinate (siehe Gehirnatlas der Maus). - Injizieren Sie 600–800 nL AAV in den VTA. Das Injektionsvolumen kann je nach Größe der Zielstelle angepasst werden.
- Liefern Sie die AAV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 60 nL/min (3-minütiges Intervall).
- Um eYFP und hChR2 in VTA-Glutamatneuronen und -projektionen zu exprimieren, injizieren Sie AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
HINWEIS: Die Cre-lox-Rekombinationsmethode kann auch abhängig vom Ziel des Experiments verwendet werden. - Lassen Sie die Nadel nach der AAV-Injektion 15 Minuten lang an Ort und Stelle bleiben. Dies reduziert Diffusion und Rückfluss.
- Ziehen Sie die Spritzennadel zurück und nähen Sie dann den Schnitt, um die Wunde zu schließen.
- Verabreichen Sie Antibiotika und Analgesie als Teil der postoperativen Versorgung. Legen Sie die Maus auf eine warme, gepolsterte Plattform und überwachen Sie das Tier bis zum Erwachen.
HINWEIS: Nach 3 Wochen Injektion kann die AAV-Expression durch Fluoreszenzdetektion von Reporterprotein (eYFP) in Gehirnabschnitten von Mäusen beobachtet werden. Auch Photostimulationsexperimente können nach 3 Wochen durchgeführt werden (Abbildung 2).
4. Einrichtung für in vivo neuronale Aufnahmen mit Optogenetik
HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Schritte für die akute neuronale Aufzeichnung mit der optogenetischen Nachverfolgung eines Gehirnschaltkreises (VTA-Glutamat-Neuronenprojektion auf das CA1). Überprüfen Sie ggf. das System (Verstärker und Anschlüsse) auf elektrisches Rauschen und Erdungsprobleme, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen. Wenn Sie diesen Schritt in einem Faradayschen Käfig ausführen, können Sie elektrisches Rauschen in der Aufnahme beseitigen.
- 3 Wochen nach der AAV-Injektion betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Urethan-Injektion (0,2 mg/kg).
ACHTUNG: Urethan ist krebserregend und muss mit Schutzausrüstung vorsichtig behandelt werden. Auch die Verabreichung von Urethananästhesie in dieser Konzentration ist kein Überleben. - Befestigen Sie den Kopf des Tieres wie zuvor beschrieben auf einem stereotaktischen Rahmen (Schritt 2.2, Abbildung 3A). Führen Sie eine Kraniotomie durch, um die Dura freizulegen (Abbildung 3A). Verwenden Sie ein Bohrwerkzeug (Bitgröße: 0,8 mm, Geschwindigkeit: 15.000 U / min), um einen Teil des Parietalknochens zu entfernen.
- Die Kraniotomie sollte etwa 3 mm x 4 mm breit sein. Tragen Sie Tropfen künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) über diesen Bereich auf, um Trockenheit zu verhindern.
- Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop (digital) eine gebogene Nadelspitze (27 G), um die freiliegende Dura zu entfernen. Achten Sie darauf, die empfindliche Pialbedeckung und das kortikale Gewebe in diesem Bereich nicht auseinander zu ziehen.
- Bohren Sie ein Loch in den Hinterhauptknochen (Bitgröße: 0,8 mm, Drehzahl: 10.000 U /min), um die Erdschraube (Schwenkkopf-Kreuzschlitzschraube; M0,6 x 2,0 mm).
- Schließen Sie einen Erdungsdraht aus Edelstahl an.
HINWEIS: Andere Arten von Drähten können ebenfalls verwendet werden (Abbildung 3b). - Für die kombinierte Photostimulation (VTA) und neuronale Aufzeichnung (CA1) verwenden Sie eine stereotaxische Mehrschienenvorrichtung, die mit ultrafeinen (10 μm oder 1 μm) Mikromanipulatoren ausgestattet ist. Montieren Sie die optische Faser und die aufzeichnungsneuronale Sonde auf einem Mikromanipulator im Bereich von 10 μm bzw. einem Mikromanipulator im Bereich von 1 μm.
- Verwenden Sie bei Bedarf einen Kopf-Stage-Probe-Adapter (Abbildung 3c).
HINWEIS: Im aktuellen Protokoll wurde eine 32-Kanal-Kopfstufe mit einem Adapter für eine 4-Kanal-Aufzeichnungselektrode ausgestattet (Abbildung 3d). Der Edelstahl-Erdungsdraht wurde an den Masseanschluss des Adapters gelöt.
- Verwenden Sie bei Bedarf einen Kopf-Stage-Probe-Adapter (Abbildung 3c).
- Bei Koordinaten AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, senken Sie die optische Faser mit einem Durchmesser von 400 μm in den VTA.
- Bevor Sie die Glasfaser absenken, verbinden Sie die Ferrule mit einem Glasfaserkabel (mit Edelstahl- oder Keramikferrule), das mit einer fasergekoppelten LED-Quelle verbunden ist.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Lichtintensität und Fokus wie gewünscht eingestellt sind. Die Wahl der LED-Lichtquelle sollte den anvisierten Opsinen entsprechen. Hier wurde ein 470 nm (blaues Licht) LED-Treiber für die hChR2-Photoaktivierung verwendet (Abbildung 4a). - Um den Lichtimpuls mit der neuronalen Aufzeichnung zu synchronisieren, schließen Sie den digitalen IN-Port des LED-Treibers und des Aufzeichnungscontrollers an einen Transistor-Transistor-Logik-Impulsgeber (TTL) an (Abbildung 4b). Dies kann mit einem BNC-Splitter erreicht werden.
HINWEIS: Die Verwendung eines TTL-Pulsers bietet die Flexibilität, die gewünschte Impulszugfrequenz und -dauer digital einzustellen. Im aktuellen Protokoll wurden 10 ms Lichtimpulse bei 50 Hz18ausgelöst. Für die TTL-Steuerung des LED-Treibers schalten Sie den Treiber auf "Trigger". In diesem Modus kann die Lichtintensität durch Drehen des "Knopfes" reguliert werden. Die Stimulationsfrequenz kann an experimentelle Variablen angepasst werden und kann zwischen 1 und 100 Hz liegen. Für die neuronale Schaltkreisverfolgung wird eine Stimulationsfrequenz von >20 Hz empfohlen. - Stellen Sie den Knopf ein, um die effektive Intensität zu bestimmen, die eine Reaktion erzeugen kann, ohne photoelektrische Artefakte zu erzeugen. Positionieren Sie die optische Faser bei Bedarf neu, um Artefakte zu beseitigen19.
HINWEIS: Der für das aktuelle Protokoll verwendete LED-Treiber erzeugt eine Lichtleistung von ~21,8 mW.
- Bevor Sie die Glasfaser absenken, verbinden Sie die Ferrule mit einem Glasfaserkabel (mit Edelstahl- oder Keramikferrule), das mit einer fasergekoppelten LED-Quelle verbunden ist.
5. Neuronale Aufzeichnung
- Verwenden Sie eine akute neuronale Sonde mit einem 15–50 μm dicken Schaft, der mindestens 5 mm lang ist.
HINWEIS: Die Aufnahme von tiefen Gehirnstrukturen erfordert neuronale Sonden mit einem längeren Schaft. In der aktuellen Studie wurde eine Sonde mit 20 mm Schaftlänge verwendet. - Schließen Sie die Vorverstärker-Kopfbühne über ein SPI-Kabel (Serial Peripheral Interface) an den Aufnahmecontroller an. Überprüfen Sie die Farbbeleuchtung der LEDs an den Anschlüssen des Aufnahmecontrollers. Grüne und gelbe LEDs zeigen die richtige Spannung auf der angeschlossenen Verstärkerplatine an. Rote LED zeigt eine funktionierende Software-Kopf-Bühnensteuerung an (Abbildung 5b).
- Positionieren Sie mit einem Mikromanipulator die Elektrodenkontaktstellen in der pyramidalen Zellschicht des CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 bis 1,2 mm).
HINWEIS: Die optische Faser und die Elektrode können in anderen gewünschten Gehirnregionen zur Photostimulation und Aufzeichnung positioniert werden.
6. Verstärker- und Filtereinstellungen
- Schließen Sie das Aufnahmecontroller-Verstärkersystem über einen USB 3.0-Anschluss an einen Computer an. Verbinden Sie die Kopfbühne über das SPI-Kabel mit dem Verstärker. Starten Sie die Controller-Software. Wenn die Verbindung nicht ordnungsgemäß hergestellt ist, zeigt das System die Meldung "Gerät nicht gefunden" an.
- Klicken Sie auf Ausführen, um die Aktivitäten auf den Kanälen anzuzeigen. Jede Wellenform wird als Spannung (y-Achse) versus Zeit (x-Achse) dargestellt. Passen Sie je nach Interessenbereich die Spannungs- und Zeitskalen an, um die Wellenformanzeige anzupassen.
- Wenn nur wenige Kanäle aktiv sind, deaktivieren Sie nicht verwendete Kanäle, um die Dateigröße auf dem Speicherdatenträger zu reduzieren.
- Legen Sie die Abtastrate und die Abschaltfrequenzen fest, indem Sie Bandbreitenparameter in der Erfassungssoftware bearbeiten. Für Einzelaufnahmen stellen Sie die oberen und unteren Cutoff-Frequenzen auf 300 Hz bzw. 5.000 Hz ein. Ändern Sie die Abtastrate des Verstärkers auf 30 kS/s.
HINWEIS: Wenn Sie eine hohe Abtastrate wählen, wird eine größere Dateigröße angezeigt. - Überprüfen Sie vor der Aufzeichnung die Integrität der Elektrodenkanäle, indem Sie die Impedanz bei 1.000 Hz messen. Dies kann durch Starten der Funktion in der Benutzeroberfläche (Controller-Software) erfolgen. Ein Arbeitskanal sollte einen Impedanzwert haben, der zwischen 0,1 und 5 MΩ liegt.
- Wenn ein Audioausgang (Lautsprecher) an den ANALOG OUT-Anschluss angeschlossen ist, passen Sie die Verstärkung und den Schalldämpfer für einen optimalen Spike-Sound an.
- Um den TTL-Impulszugmarker in der Spike-Aufzeichnung anzuzeigen, aktivieren Sie die Anzeige für den DIGITAL IN-Marker. Um den Pulszugzeitstempel aufzuzeichnen, aktivieren Sie die DIGITAL IN-Kanalanzeige vor dem Hauptexperiment.
HINWEIS: Es gibt normalerweise mehr als einen "DIGITAL IN" -Kanal (1 oder 2). Stellen Sie sicher, dass das BNC-Kabel des TTL-Pulsers an den "DIGITAL IN"-Port angeschlossen ist, der für die Anzeige in der Aufnahmecontroller-Software ausgewählt ist. - Um die Spitzenwellenform in Echtzeit anzuzeigen, öffnen Sie das Fenster spike scope und legen Sie den Schwellenwert mit dem Mausklick fest.
- Überprüfen Sie den Geräuschpegel, indem Sie das Root Mean Square (RMS in μV) überwachen. Für die aufzeichnung eines sauberen Spikes wird bevorzugt, dass der schwellenwert für den neuronalen Spike mindestens 5x RMS beträgt.
- Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie das Dateiformat aus.
HINWEIS: Hier wurde der ca1-neuronale Spike im .rhd-Format aufgezeichnet. Andere Dateiformate (.rhs und .dat) können ebenfalls ausgewählt werden, um den von der Analysesoftware zulässigen Dateiformaten zu entsprechen.
7. Optogenetische In-vivo-Aufzeichnung und -Einstellungen
- Öffnen Sie die Pulssteuerungssoftware (TTL), die verschiedene einstellbare Pulsparameter anzeigt. Wählen Sie den entsprechenden COM-Port in der Software aus. Stellen Sie die Pulsparameter ein, indem Sie die Zug- und Gruppeneinstellungen anpassen.
HINWEIS: Die Pulsbedingung sollte unter Berücksichtigung experimenteller Variablen und des Designs bestimmt werden. - Klicken Sie in der Verstärkersteuerungssoftware auf Ausführen, um neuronale Spitzen im Hippocampus oder im gewünschten Gehirnbereich zu erkennen. Passen Sie bei Bedarf die Elektrodentiefe an, um lebensfähige und aktive Neuronen zu erkennen.
- Sobald die extrazelluläre Spannungsaktivität erkannt wurde, beobachten Sie 15 Minuten lang Die Basislinienspitzen und überwachen Sie die Vitalwerte des Tieres. Testen Sie auch den Lichtpuls, um reaktionsschnelle Neuronen innerhalb des CA1 oder der gewünschten anatomischen Zielregion zu erkennen.
HINWEIS: Überprüfen Sie auf photoelektrische Artefakte und beseitigen Sie sie, indem Sie die Lichtintensität oder die Position der optischen Faser anpassen. - Zeichnen Sie die Basislinienaktivität für ~10 min auf, bevor Sie den Lichtimpuls mit der gewünschten Frequenz auslösen(Abbildung 5a,b). Dies ermöglicht den Vergleich von Feuer- oder Berstraten mit und ohne Beleuchtung.
HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde die Basisaktivität für 10 Minuten ohne Beleuchtung aufgezeichnet, gefolgt von einer Beleuchtung bei 50 Hz (Film 1).
8. Analyse
- Konvertieren Sie die .rhd-Datei in das Nex5-Ausgabeformat.
- Dateiname des Prozesses. Nex5-Datei in einer Offline-Sorter-Software zur Erkennung von Rasterzügen und Wellenformen mit einer Einheit (Abbildung 5a–b).
- Wählen Sie den gewünschten Kanal aus dem Dropdown-Fenster aus.
HINWEIS: Die kontinuierlich aufgezeichneten Spike-Daten können in einem separaten Fenster des OFSS angezeigt werden. Die Zeitskala kann ebenfalls angepasst werden. Wenn eine Tetrode verwendet wird, kann das OFSS so eingestellt werden, dass die 4 Kanäle als Tetrode sortiert werden. - Legen Sie den Spannungspegel für die Wellenformextraktion fest, die schwellenwertüberquerend ist.
ACHTUNG: Verwenden Sie mindestens 5x RMS für die ordnungsgemäße Spike-Erkennung. - Erkennen Sie Wellenformen und führen Sie dann eine Spike-Sortierung mit der Talsuche (automatisch) oder der K-Means-Methode (halbautomatisch) durch. Führen Sie bei Bedarf Einheiten zusammen, die ähnliche Bereiche des 3D-PcA-Raums (Principal Component Analysis) einnehmen.
- Export sortiert . Nex5-Dateien zur weiteren Analyse (Abbildung 5c–d).
HINWEIS: Analyseergebnisse für das Interspike-Intervall, die Feuerrate und die Burst-Rate können in andere Analyseplattformen exportiert werden.
- Wählen Sie den gewünschten Kanal aus dem Dropdown-Fenster aus.
9. Fluoreszenzdetektion der AAV-Expression
- Nach der Aufnahme das Tier in einer Isoflurankammer einschläfern.
- Transkardperfusion mit 10 mM PBS (~10 mL), gefolgt von 4% phosphatgepufferten Paraformaldehyd (PB-PFA, ~10 mL).
- Entfernen Sie das gesamte Gehirn intakt und fixieren Sie es in 4% PB-PFA für 48 h.
- Übertragen Sie das fixierte Gehirn in 4% PB-PFA mit 30% Saccharose zur Kryokonservierung bei 4 °C. Nach 72 h das Gehirn in einen Kryostaten schneiden und Scheiben auf einem gelatinebeschichteten Objektträger montieren.
HINWEIS: Im aktuellen Protokoll wurden Abschnitte ausgewählt, die den geschlossenen Teil des Hippocampus (Rostral) enthalten, um AAV-markierte Terminals in DG, CA3 und CA1 zu demonstrieren.
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Representative Results
Anterograde Rückverfolgung
Die AAV-Expression wurde durch Immunfluoreszenz-Bildgebung des Reporterproteins (eYFP) im VTA von C57BL/6-Mäusen 21 Tage nach der Injektion verifiziert(Abbildung 2). Die erfolgreiche anterograde Markierung von präsynaptischen VTA-Glutamatprojektionen im Hippocampus wurde auch durch eYFP-Nachweis in den Schichten von DG, CA3 und CA1 nachgewiesen(Abbildung 6a–d; Film 2 und 3).
VTA-Glutamatprojektionen auf den Hippocampus modulieren die CA1-Aktivität
Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die Aktivität von mutmaßlichen pyramidalen CA1-Neuronen. Dies zeigt sich als Zunahme der Spiking-Ereignisse während der Licht-ON-Phase (Film 1) im Vergleich zur Licht-OFF-Phase (Abbildung 5a–b). Um dieses Ergebnis zu unterstützen, ergab der statistische Vergleich der Feuerraten des CA1-Netzwerks vor (Licht AUS; Ausgangslinie) und nach (Licht EIN) Photostimulation einen signifikanten Anstieg für die Zeit nach der Stimulation(Abbildung 7a;p = 0,0002). Die anschließende Analyse des Rasterzuges zur Erkennung von Bursts (2–4 Spikes in <16 ms) zeigt auch eine erhöhte Burst-Rate für die CA1-mutmaßlichen Pyramidenneuronen nach VTA-Glutamat-Photostimulation(Abbildung 7b;p = 0,0025). Die statistische Analyse (Student's t-test) wurde mit Standardsoftware durchgeführt. Hier wurde die Ausgangswert-Feuer- oder Burst-Rate (Light OFF) mit Light ON (Photostimulation) Werten verglichen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-Injektion in den VTA der C57BL/6-Maus.
Anterograde Markierung von VTA-Neuronen und axonale Projektionen zum Hippocampus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluoreszenzbilder, die die AAV-CaMKII-ChR2-eYFP-Expression in der VTA- und Glasfaserspur zeigen.
Dk: Kern von Darkschewitsch, scp: oberer Kleinhirnstiel, VTA: ventraler tegmentaler Bereich und RM: retromamillärer Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Demonstration der Kraniotomie, Elektrodenplatzierung und Optikfaserplatzierung.
(A) Mittellinienschnitt, der den Schädel freilegt (b: Bregma, oc: Hinterhauptknochen). (B) Platzierung der Erdungsschraube (gs) im Hinterhauptknochen und des angeschlossenen Erdungsdrahts aus edelstahl (gw). (C) Stereotaktische Positionierung der optischen Faserkanüle (foc: Glasfaserkabel). (D) Stereotaktische Positionierung von Optische-Faserkanüle und neuronalem Sondenschaft (foc: Glasfaserkabel, adp: Adapter, ms: Steckhülse, prs: Sondenschaft, hs: Kopfstufe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: BNC-Split-Anschluss für kombinierte Lichtpuls- und Verstärker-(Trigger-)Zeitstempel.
(A) Nachweis der LED-Lichtemission von der Spitze einer Glasfaserkanüle. (B)TTL-Impuls durch einen BNC-Split-Adapter zur Steuerung von LED- und Zeitstempelverstärker -aufnahmen (ampl). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Kontinuierlich aufgezeichneter Spike-Zug (Rohdaten) mit Einzeleinheitserkennung.
(A) Screengrab der Rohaufnahme aus dem Hippocampus einer betäubten Maus. (B) TTL-gesteuerte Fotobeleuchtung des VTA in der Rohaufnahme. Hellblaue Linien zeigen die Zeitstempel für Light ON (λ = 470nm) Perioden und die Häufigkeit der Stimulation. (C–D) Kontinuierlich aufgezeichnete Spike-Train- und Neuronen-Einheiten, die durch Spike-Sortierung abgeleitet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Fluoreszenzbilder, die die Expression von AAV-CaMKII-ChR2-eYFP im Hippocampus zeigen.
(A) DG (GCL: körnige Zellschicht, hil: hilus). (B) Teil des CA3 in der Nähe der DG (SL: Stratum lacunosum, Pyr: Pyramidenzellschicht). (C) CA3 selbst. (D) CA1 (so: stratum oriens, pyr: pyramidale Zellschicht, rad: stratum radiculata). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Statistischer Vergleich der Feuerrate vor und nach der Photostimulation.
(A) Balkendiagramm, das eine erhöhte mittlere Feuerrate (Hz) für mutmaßliche pyramidale Neuroneneinheiten im CA1 (***p = 0,0002) nach Fotobeleuchtung zeigt. (B) Balkendiagramm, das eine erhöhte Burst-Rate für mutmaßliche CA1-Neuronen nach Fotobeleuchtung zeigt (**p = 0,0025). Fehlerleiste: Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: Screengrab-Aufnahme des Verstärker-Controllers und der Pulser-Software. Der Film zeigt die Basislinienaufzeichnung (Licht AUS), gefolgt von einer Photostimulation (Licht EIN, λ = 470 nm), die mit blauen Zeitstempeln gekennzeichnet ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Film 2 und Film 3: 3D-Illustration von VTA-Glutamat-Terminals im DG einer Maus. DAPI-blau: Kernmarkmark in der granularen Zellschicht (GCL); eYFP-Green: AAV-labeled-VTA-Terminals in der DG hilus. Bitte klicken Sie hier, um diese Videos herunterzuladen.
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Discussion
In den letzten zehn Jahren hat sich das Design von AAV-Konstrukten erheblich weiterentwickelt. Daher wurden mehr neuronenspezifische Promotoren in eine Reihe von AAV-Serotypen integriert, um die Transfektionsspezifität zu verbessern14. Durch die Kombination von Genen für Fluoreszenzproteine, Transporter, Rezeptoren und Ionenkanäle existieren nun Bibliotheken von AAV für bildgebung, neuromodulation und synaptische Aktivitätserkennung. In kommerziell erhältlichen AAV-Konstrukten ermöglicht eine Kombination aus einem genetisch kodierten Fluorophor und Ionenkanälen (Opsin) eine kombinierte neuroanatomische und elektrophysiologische Rückverfolgung neuronaler Schaltkreise14,18,19. Ebenso kann die Auswahl eines Promotors (oder einer Cre-Lox-Rekombinationsmethode) die Verfolgung eines Neuronentyp-spezifischen Projektionen innerhalb eines Schaltkreises ermöglichen. In der aktuellen Studie wurde dieses Protokoll zur anatomischen und elektrophysiologischen Beurteilung von neuronalen VTA-Glutamatprojektionen auf den Hippocampus (CA1-Region) eingesetzt.
VTA-Hippocampus neuronaler Schaltkreis
Der VTA ist ein Teil des mesocorticolimbischen Weges im Mittelhirn. VTA-Projektionen auf Gehirnbereiche, die am Belohnungs- und Abneigungslernen beteiligtsind,wurden ausführlich gezeigt20,21,22,23,24,25. Während die VTA Dopamin-, Glutamat- und GABA-Neuronen enthält, ist die Dopamin-Neuronenpopulation anatomisch dominant. Eine Hauptfunktion des VTA beim Aversions- und Belohnungslernen wird einer robusten VTA-Dopaminprojektion auf den Nucleus accumbens und den dorsalen Raphe-Kernzugeschrieben 22,24,25,26,27,28. Obwohl VTA-Dopamin- und Glutamat-Neuronen auf den Hippocampus projizieren, ist die Funktion der anatomisch dominanten VTA-Glutamat-Terminals im Vergleich zu VTA-Dopamin-Terminals im Hippocampus weniger untersucht29,30.
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung eines AAV5-Konstrukts mit Fluorophor (eYFP) und lichtgesteuertem Opsin (hChR2) für die Kartierung von CaMKIIα-exprimierenden VTA-Terminals (Glutamat) im Hippocampus. Frühere Studien haben ergeben, dass VTA-Glutamat-Terminals im Hippocampus im Vergleich zu VTA-Dopamin-Terminals anatomisch dominant sind29. Um die präsynaptischen VTA-Glutamat-Terminals im Hippocampus zu demonstrieren, wurde AAV(5)-CaMKIIα-hChR2-eYFP in VTA-neuronale Zellkörper transfiziert. Dies markierte die Zellkörper VTA-Glutamat-Neuronen (innerhalb der VTA) und skizzierte VTA-Glutamat-Terminals innerhalb der Schichten des Hippocampus.
Obwohl VTA-Glutamat-Präsynaptik-Terminals DG, CA3 und CA1 innervieren, zeigen die Ergebnisse schichtabhängige Variationen für diese drei Regionen (Abbildung 6a-d). In der DG sind AAV-markierte VTA-Glutamat-Terminals im Vergleich zur granularen Zellschicht anatomisch dominant im Hilus. Im CA3 sind die VTA-Glutamatterminals im Stratum lacunosum im Vergleich zur pyramidalen Zellschicht und dem Stratum oriens relativ reichlich vorhanden. Während im CA1 VTA-Glutamatterminals die dendritischen Schichten (Stratum oriens und Radiatum) im Vergleich zur pyramidalen Zellschicht signifikant innervieren. Das Ergebnis dieser Studie zeigt auch, dass die Photostimulation der neuronalen Zellkörper von VTA-Glutamat die Aktivität des neuronalen Netzwerks CA1 in vivo moduliert. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen führte zu einem signifikanten Anstieg der CA1-Feuerrate und der Burst-Rate während der Photostimulationsepoche (Abbildung 7a-b). Dies stimmt mit der anatomischen Verteilung von VTA-Glutamatterminals in den dendritischen Schichten des CA1 überein (Abbildung 6d), wo es Auswirkungen auf die Hippocampus-Informationskodierung ausüben kann. Zur Unterstützung dieser Beobachtung haben andere Studien gezeigt, dass die VTA eine primäre Determinante der Hippocampus-Arbeitsgedächtniskodierung ist und die Auswahl der im Langzeitgedächtnis zu speichernden Informationen durch die VTA-Hippocampus-Schleife22,23,24,25,26,27,28,29,31,32, 33,34.
Technische Überlegungen
Um dieses Protokoll erfolgreich zu implementieren, sollte die Auswahl der AAV-Konstrukte basierend auf dem zu zielenden Neuronentyp bestimmt werden. Der Forscher muss einen geeigneten Promotor (ein Genprodukt) identifizieren, der für den zu erreichenden Neuronentyp einzigartig ist. In der aktuellen Studie wurde ein CaMKIIα-Promotor verwendet, um die Expression von eYFP und hChR2 in CaMKIIα-exprimierenden Neuronen voranzutreiben. Es kann jedoch auch eine Cre-Lox-Rekombinationsmethode verwendet werden. In diesem Fall kann ein doppelt gefloxtes AAV5 im VTA von CaMKIIα-Cre-Mäusen exprimiert werden. Die promotor- und cre-lox-basierten Expressionsmethoden sind auch auf andere Neuronentypen35,36,37anwendbar.
Das System sollte auf elektrisches Rauschen überprüft werden. Dies kann durch Auswerten des RMS im Spike-Bereich während einer Testaufzeichnungssitzung erfolgen. Bei Bedarf sollten das System und die stereotaktische Vorrichtung in einem Faradayschem Käfig untergebracht werden, während die Verstärkererde mit dem Käfig verbunden ist. Elektrodenkontaktstellen können linear oder als Tetrode angeordnet werden. Die Wahl des Sondendesigns sollte auf der Grundlage des Ziels des Experiments bestimmt werden. Ein lineares Array erkennt Neuronen über mehrere Schichten hinweg. Sonden mit verschiedenen Abstandsspezifikationen (in Mikrometern) sind ebenfalls im Handel erhältlich. Die Schaftlänge und der Abstand zwischen den Sondenkontaktstellen sollten während des Aufzeichnungsverfahrens und bei der Analyse berücksichtigt werden. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, muss der Lichtimpuls während einer Testaufnahme überprüft werden, um photoelektrische Artefakte zu eliminieren. Dies kann auch optimiert werden, indem die Position der Elektrode relativ zur Glasfasertiefe und -position angepasst wird.
Begrenzungen
Obwohl CaMKIIα hauptsächlich in Glutamat-freisetzenden Neuronen exprimiert wird, ist das Protein auch in einigen Populationen von Dopamin-Neuronen vorhanden, die Glutamat kofreisetzen. Daher wird die Verwendung von AAV5-CaMKIIα hauptsächlich Glutamatneuronen und einige Dopaminneuronen kennzeichnen, die CaMKIIα exprimieren. LED-gesteuerte Photostimulationsprotokolle sind erschwinglich und können einfach montiert werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass ein lasergesteuertes Photostimulationsprotokoll effektiver ist38,39,40. AAV-Lösung, die in dieselbe Gehirnregion für verschiedene Tiere injiziert wird, ergibt unterschiedliche Expressionsschwellen. Das Warten auf 3 Wochen oder länger nach der Injektion kann diese Variation jedoch reduzieren, indem eine optimale Transfektion ermöglicht wird. AAV-Lösung, die in eine Gehirnregion injiziert wird, kann auch in die umliegenden Gehirnbereiche diffundieren. Die Beobachtung der Wartezeit nach dem Absenken der Nadel und zwischen den Bolusinjektionen kann die Diffusion der AAV-Lösung von der Injektionsstelle reduzieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode verwendet werden kann, um neuronale Schaltkreise im Gehirn von Nagetieren zu verfolgen. Obwohl das aktuelle Protokoll die In-vivo-Verfolgung neuronaler Schaltkreise bei betäubten Mäusen beschreibt, kann das Verfahren auch für die chronische Aufzeichnung bei wachen, sich verhaltenden Mäusen eingesetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch den CBS Bridging Grant finanziert, der ooM verliehen wird. OOM, PAA und AS entwarfen die Studie und führten die Experimente durch. AS und PAA analysierten die Ergebnisse. OOM und PAA bereiteten das Manuskript vor. Wir danken Dr. Karl Disseroth (Stanford University) für die Bereitstellung des AAV für unsere Nutzung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC cable | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Drill | Dremel | LR 39098 | |
| Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
| TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition: | |||
| oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |
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