Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

מוצג פרוטוקול להמציא מכשיר מבוסס נייר להעשרת האפקטיבית והבידוד של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים.

Abstract

שלפוחיות ואקסוזומים הן קרומי שלפוחיות קטנות שפורסמו לסביבת החילוץ והופץ ברחבי הגוף. מכיוון שהם מכילים שונים תא הורים biomolecules כגון DNA, mRNA, miRNA, חלבונים, ושומנים, שלהם העשרה ובידוד הם צעדים קריטיים לניצול שלהם כמו סמנים פוטנציאליים יישומים קליניים. עם זאת, שיטות בידוד קונבנציונאלי (למשל, הטיות) גורמות לאובדן משמעותי ונזק למיקרושלפוחיות ואקסוזומים. שיטות אלה דורשות גם שלבים חוזרים ונשנים מרובים של העברת החומרים, טעינה, ובזבוז של ריאגנטים. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת לעיצוב התקן המבוסס על נייר אוריגמי (Exo-PAD) המיועדת להעשרה ולבידוד יעילים של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים באופן פשוט. העיצוב הייחודי של ה-Exo-PAD, המורכב משכבות רב-אקורדיון הכוללות שכבות משולבות משולבות עם שטחים לדוגמה מתכנסת, משולבים עם טכניקת הקיטוב של ריכוז היונים, ובכך מאפשרת לעשרת העשרה של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים על שכבות ספציפיות. כמו-כן, המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת מבודדים על-ידי התגלגלות בפשטות של ה-Exo-PAD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שלפוחיות ואקסוזומים הן ממברנות קטנים מדידת מדידה 0.2-1 מיקרומטר ו 30-200 ננומטר, בהתאמה. הם מופרשים לתוך סביבת החילוץ על ידי כמה סוגי תאים שונים1,2,3,4,5. הם מכילים מידע תא הורים בצורה של תת קבוצות של DNA, mrna, mirna, חלבונים, ושומנים, ולזרום ברחבי הגוף באמצעות נוזלי גוף שונים כגון סרום, פלזמה, שתן, נוזל שדרתי, נוזל שפיר, ורוק6,7,8,9. לכן, טכניקות לבידוד יעיל של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים מנוזלים ביולוגיים יכולים לספק הזדמנויות נרחבות בתחומים של אבחון, פרוגנוזה, ניטור בזמן אמת של מחלות, כמו גם בפיתוח של therapeutics חדש.

עם זאת, שיטת הבידוד המקובלת למיקרו-שלפוחית ואקסוזומים המבוססת על הארכה היא זמן רב וגורמת לאובדן וזיהום משמעותיים של המדגם. זה בגלל שהוא כרוך מספר pipetting מסורבלת וטעינה שלבים ומהשליך של ריאגנטים שונים עם חוזר ונשנה5,6,10,11,12. יתר על כן, את המתח להטות גבוה הנגרמת על ידי מעקב (~ 100,000 x g) יכול לגרום לפירוק הפיזי של מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים, מניב שיעורי התאוששות גרועה (5-כ 23%)6,13,14. לכן, יש לפתח טכניקת בידוד יעילה ובעלת משקל למיקרו-שלפוחיות ואקסוזומים כדי להפחית את הנזק וההפסד, ובכך להשיג שיעורי התאוששות גבוהים יותר.

התקן המבוסס על נייר אוריגמי (Exo-PAD) פותח לבידוד פשוט, עדין ויעיל מאוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים6. העיצוב של ה-Exo-PAD הוא נייר רב-מקופל, עם שטחים לדוגמה המחוברים באופן סדרתי היורדים בהדרגה בקוטר. טכניקת ההפולריזציה (הקאמרי), שהיא תופעה ננו-אלקטרוקינטית הטעונה בbiomolecules, משולבת בעיצוב ייחודי זה. השימוש ב-Exo-PAD הביא להעשרת העשרה של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים בשכבות מסוימות ובבידוד שלהם על ידי התפתחות המכשיר. מאמר זה מתאר את ה-Exo-PAD בפירוט, החל מייצור ההתקן ומהפעולה הכוללת לניתוח השימוש בו, כדי להמחיש את השיטה ולהציג את תוצאות הנציגים6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ייצור התקנים

  1. הגדר את האזור שיודפס על נייר באמצעות תוכנת מדפסת (טבלת חומרים).
    הערה: העיצוב כולל 12 שכבות בדוגמת שעווה שבהן הקטרים של האזורים העגולים מעוגלים בהדרגה ממרחק של 5 מ"מ עד 2 מ"מ (איור 1A).
  2. הדפס שעווה הידרופובי על האזורים המיועדים משני צידי הנייר הצלולוזה (טבלת חומרים) באמצעות מדפסת שעווה מסחרית (לוח חומרים) (איור 1b).
  3. מניחים את נייר השעווה מודפס בתנור מעבדה עבור 80 s ב 120 ° c.
    הערה: שלב זה מאפשר לשעווה להגיע לתוך הנייר באמצעות הזרמה תרמית של השעווה המודפסת. בעזרת פרוטוקול דגירה זה, הרזולוציה של התבנית היא ~ 2 מ"מ. לפיכך, להיזהר לא להדפיס דפוסים של פחות מ 2 מ"מ. אחרת הדפוסים ייחסמו על ידי השעווה.
  4. חותכים את נייר שעווה מודפס עם חותך כדי ליצור התקנים בודדים (איור 1C).
  5. טיפה 5 μL ו-2 μL של ממברנה בררנית (g., Nafion; רשימת חומרים) על האזורים לדוגמה בשכבות הימניות והימניות ביותר, בהתאמה (איור 1D).
  6. מניחים את השכבות מצופות עם קרום permselective על צלחת חם ב 70 ° c עבור 30 דקות כדי להתאדות את המסת קרום permselective.
  7. אטום את המשטח החיצוני ביותר של השכבה מצופה מול פתרון מאגר עם נייר רגיש ללחץ, משאיר חור קטן.
  8. מקפלים את המכשיר בודד מודפס (כלומר, Exo-PAD) הלוך ושוב לאורך הקווים הלבנים.
    הערה: על-ידי קיפול ההתקן, כל האזורים לדוגמה הופכים למחוברים בעדינות (איור 1E). עיצוב ממיר זה מתמקד בקווי השדה החשמליים כאשר המתח מוחל על הזרם הקאמרי, ומקבל ריכוז אינטנסיבי יותר של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים.

2. העשרה והתמקדות מרחבית של שלפוחיות ואקזומים באמצעות ריכוז הקיטוב

  1. טעינת 15 μL של המיקרו-שלפוחית ומדגם אקסוזום (~ 3 x 10/11 חלקיקים/mL ב-0.1 x פוספט באגירה מלוחים [PBS] עם 0.05% רצף 20) באזורים לדוגמה המתכנסת על ידי ליטוף והמתן כמה שניות כדי להבטיח הרטבה מלאה של כל האזורים לדוגמה (איור 1f).
  2. מניחים שני חדרי אקריליק בשני הקצוות של Exo-PAD ולהדק את Exo-PAD באופן מאובטח עם קטעי אוגדן קטנים כדי למנוע התפתחות (איור 1G).
  3. ממלאים את התאים עם 110 μL של 0.1 x PBS ולהוסיף שני אלקטרודות Ag/AgCl (איור 1H).
  4. החלת 30 וולט על אלקטרודות עבור 20 דקות באמצעות מערכת מדידה מקור מתח נוכחי (טבלת חומרים).
    הערה: המתח המוחל יוצר את תופעת הקאמרי ולכן מקדם את המיקרו-שלפוחית והאקסוזומים בשכבות 8 ו -9 של ה-Exo-PAD.

3. בידוד מיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשרים

  1. הפרד את Exo-PAD מקופל מתאי אקריליק ולגלות את המכשיר כדי לבודד את המיקרושלפוחיות מועשר ואקסוזומים מן השכבות האחרות (איור 1I).
  2. החוצה את האזורים לדוגמה בשכבות 8 ו -9, כאשר המיקרושלפוחיות והאקסוזומים מועשרים, לניתוח במורד הזרם (איור 1J).

4. סריקת אנליזה של מיקרוסקופ אלקטרוני

  1. תקן את המיקרושלפוחיות המועשרת והאקסוזומים על-ידי התעשרת את האזורים הנוקבים ב-2.5% גלוטאלדהיד בשנת 0.1 m נתרן קא, מאגר של 1 h ו-1% אוסמיום tetroxide בשנת 0.1 M נתרן קאבאיחור 1 h.
    התראה: אוסממיום tetroxide הוא כימיקל רעיל ומסוכן מאוד. בגלל אוסמיום tetroxide יכול לחדור לפלסטיק, זה חייב להיות מאוחסן בזכוכית. כל טיפול של אוסממיום tetroxide חייב להתבצע בתוך מכסה כימי עם כפפות ניטריל.
  2. ביטול המיקרושלפוחיות ואקסוזומים קבועים עם ציונים עולים של 200 הוכחה אתנול (כלומר, 50%, 70%, 90%, ו-100%) עבור 30 דקות כל אחד.
  3. יבש כימי את המדגם על ידי הכשרת הבית בתוך הdesiccator למשך 30 דקות.
    התראה: הג הוא כימיקל דליק ורגיש לחות. זה חייב להיות מאוחסן באזור יבש ומאוורר הרחק ממקורות ההצתה.
  4. מעיל את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מיובשים לחלוטין עם זהב/פלדיום (~ 20 ננומטר) באמצעות התזה ולכידת סריקת אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תמונות.

5. ניתוח מעקב ננו-חלקיק

  1. להכניס את האזורים לדוגמה בשכבות 6, 8, ו 10 באמצעות אגרוף ביופסיה לאחר 20 דקות של פעולת התקן.
  2. הישאב כל אזור מנוקב בתמיסה מאגר (0.1 x PBS עם 0.01% רצף 20).
  3. מערבולת עבור 10 דקות ו צנטריפוגה עבור 30 s ב 6,000 סל ד כדי להשעות מחדש את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשר.
  4. הסירו את האזורים הנוקבים מהפתרון ומדדו את ריכוז המיקרושלפוחית והאקסוזומים באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיק (שולחן החומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זמן הפעולה חייב להיות מיטבי כדי להשיג את התשואה המקסימלית של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת. לא מספיק זמן אינו מאפשר העברה מספקת של המיקרו-שלפוחית והאקסוזומים, אשר מפחית את ההעשרה, בעוד זמן מופרז מתדרדר המיקוד המרחבי ולכן מפזר את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים. לפיכך, באמצעות שלב האופטימיזציה הזמן, הגורם המקסימלי הריכוז המרבי של מיקרולושלפוחית ואקסוזומים והמיקום הסופי בו ניתן לזהות את המיקרושלפוחיות ואקסוזומים. כדי למצוא את המיקום הסופי של המיקרוסקופים והאקסוזומים, הגירה בזמן של שימוש בשיטת המיקרו-שלפוחיות ואקסוזומים המסומנים במיקרוסקופ (איור 2A) ועוצמות הזריחה בכל האזורים לדוגמה התגלו באמצעות תוכנת imagej (איור 2a). לפני תהליך ההעשרה (איור 2 א, 0 דקות), מיקרוטבלטיות ואקסוזומים התפזרו בכל האזורים לדוגמה עם ירידה הדרגתית באינטנסיביות בשל פעולת הסינון הקלה של מטריצת הנייר (איור 2a, 0 דקות). לאחר 10 דקות של עיבוד (איור 2A, 10 דקות), מיקרושלפוחית ואקסוזומים הועברו אלקטרוקיסטי ותקע מיידי ריכוז מיידית הופיע על שכבה 7. עיבוד נוסף השיג ריכוז מקדים יותר של שלפוחיות ואקזומים. כאשר זמן התהליך הגיע ל -20 דקות, המיקרושלפוחיות ואקסוזומים היו ממוקדים מאוד בשכבות 8 ו -9 (איור 2A, 20 דקות) ומועשר ב-5 מטרים, בהתבסס על עוצמות הזריחה (איור 2a, 20 דקות).

לאחר שסיימו את תהליך הריכוז הקדם, המיקרוזטיות והאקסוזומים המועשרת היו מבודדים על ידי התפתחות המכשיר והשטח לדוגמה בשכבה 8 הוכה לניתוח נוסף. בתמונות SEM הושגו לחקור את שלמות המיקרוטיבים המועשרת והאקזומים. כפי שמוצג בתמונות ה-SEM (איור 3A), נצפו באופן משמעותי יותר מיקרוטיות ואקזומים שאינם פגומים לאחר תהליך ההעשרה. באמצעות תמונות SEM שהתקבלו, התפלגות הגודל של המיקרולוטיבים המועשרת והאקסוזומים נותחו (איור 3B), כאשר האקסוזומים ומיקרולוטיבים היו נבדלים בהתבסס על קוטר הסף של 200 ננומטר. במילים אחרות, גודל האקסוזומים נע מ-95-195 ננומטר עם קוטר ממוצע של 134 ננומטר ושל המיקרושלפוחיות מ-214-377 ננומטר עם קוטר ממוצע של 315 ננומטר.

לאחר מכן, הריכוז הממשי של המיקרושלפוחיות והאקסוזומים המועשרת באזורים המדגם בשכבות 6, 8 ו -10 נותח על-ידי נ. ב. לפני ההעשרה, הריכוז היה ~ 2.24 x 1011 חלקיקים/mL בשכבה 8 (איור 3c, שכבה 8). לאחר העשרה, הריכוז היה ~ 1.25 x 1012 חלקיקים/mL בשכבה 8 (איור 3c, שכבה 8), המציין כי המיקרושלפוחיות ואקסוזומים היו מרוכזים על ידי גורם של ~ 5.58. ריכוז בולט לא נצפתה על הרבדים האחרים (איור 3 c, שכבות 6 ו -10). ביחד, תוצאות אלה מדגימות כי המכשיר המוצע מבוסס נייר יכול להעשיר מיקרושלפוחיות ואקסוזומים על ידי כ-חמישה כפולה.

יעילות הבידוד של המכשיר הוערך כדלקמן: אמצעי האחסון לדוגמה שניתן לאכלס על ידי שכבה 8 ו -9 הוא ~ 2.2 μL מתוך סך של 15 μL של נפח דגימה ב 10 שכבות בשל העיצוב הצמצם של Exo-PAD. אם אנו מניחים מקרה אידיאלי שבו כל המיקרוזטיבים והאקסוזומים מרוכזים על שכבה 8 ו -9 ואף אחד לא יאבדו, אז מקדם הריכוז האידיאלי צריך להיות ~ 6.8 (15 μL/2.2 μL = ~ 6.8). עם זאת, הגורם הניסיוני מראש הניסוי שהושג על ידי נ. ת. ע (איור 3 ג) היה ~ 5.58, כלומר חלק של 1.22 מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים אבדו על ידי הליזה או מחייב לא ספציפי מטריצת נייר.
Equation 1
כאשר 2.24 x10 חלקיקים /mL היא הריכוז הראשוני של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים. מחישוב זה, שיעור ההפסד הצפוי של ה-Exo-PAD הוא כ-18%; לפיכך, יעילות הבידוד היא כ-82%. זהו שיפור משמעותי בהשוואה לתשואות העניות של ההפוגות (5% – 23%).

Figure 1
איור 1: כולל הליכים EXO-PAD, מהרכבה לפעולה. (א) עיצוב תוכנה להנחות את הדפסת שעוות הידרופובי על נייר צלולוזה. (ב) נייר שעווה מודפס לאחר דגירה בתנור עבור 80 s ב 120 ° c. (ג) המכשירים הבודדים מנותקים באמצעות חותך. (ד) התמיסה ממברנה permselective הוא ירד על האזורים לדוגמה בשכבות הימנית והימנית ביותר ואת הממס מתאדה על פלטה ב 70 ° c עבור 30 דקות. (ה) exo-PAD המודפס מקופל הלוך ושוב לאורך הקווים הלבנים; כל האזורים לדוגמה מחוברים בצורה עדינה. (ו) דגימה מיקרובעית ואקסומין נטענת באזור המדגם. (ז) שני תאי אקריליק ממוקמים בקצות המכשיר ומאובטחים עם קטעי קלסר קטנים. (ח) התאים האקריליים מלאים בתמיסת מאגר ובשני אלקטרודות Ag/agcl מוכנסים להחלת מתח של 30 וולט (I) המכשיר מפרש כדי לבודד את המיקרו שלפוחיות ואקסוזומים מרוכזים. (J) האזורים לדוגמה בשכבות 8 ו -9 מנוקבים לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התבוננות של פלואורוסקופים התווית מיקרולוטיבים ו אקסוזומים במהלך פעולת המכשיר ועוצמות המקביל של הזריחה. (א) זמן התבוננות לשגות במיקרושלפוחיות ואקסוזומים. סרגל בקנה מידה = 5 מ"מ. עם 20 דקות של עיבוד, המיקרושיטיות והאקסוזומים היו ממוקדים מאוד בשכבות 8 ו -9, שם (ב) הם העשירו בערך 5 כפולה. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח המיקרוזומים והאקסוטיות המועשרת . (א) בתמונות SEM המציגות את שלמות המיקרוטיבים המועשרת והאקזומים. לאחר ההתרכזות, הרבה מיקרושלפוחיות ואקסוזומים רבים נצפו6. סרגל קנה מידה = 1 μm. (ב) התפלגות מיקרולוטיבים המועשרת והאקסוזומים. האקסומידות היו 95-195 ננומטר (קוטר ממוצע = 134 ננומטר) וגדלים של מיקרווושלפוחית היו 214-377 ננומטר (קוטר ממוצע = 315 ננומטר). (ג) ריכוז בפועל של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים מועשרים באמצעות נ. ת. ע. לאחר ההעשרה, הריכוז של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים גדל ב-5 מטרים, אשר מתאים לתוצאות הקרינה הפלואורסצנטית6. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). לוחות A ו- C משוחזרים בהיתר מקים et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: שלפוחיות ואקסוזומים מראש וממוקד על שכבה 8 הופרדו האלבומין סרום (bsa), אשר נשאר בשכבות 1 – 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

למרות Exo-PAD שימש בהצלחה עבור העשרה ובידוד של מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים, מספר נקודות קריטיות צריך להיחשב בזהירות: 1) הדגירה של התנור זמן וטמפרטורה במהלך הכנת המכשיר, 2) זמן עיבוד, 3) יישום של מתח עם מספרי שכבות משתנות, שטח לדוגמה קטרים, ו 4) הישימות

זמן הדגירה והטמפרטורה הניתנים בפרוטוקול הם תנאים ממוטבים כדי להמציא מכשיר אמין. זמני דגירה ארוכים יותר או טמפרטורה גבוהה יותר עלול לגרום עיוות של העיצוב מתכנסת עקב הזרמה מוגזמת של שעווה מודפסת. הדבר ימנע את היווצרות קווי השדה החשמליים המתמקדים ובכך יגביר את התנגדות ההגירה במהלך תהליך ההעשרה האלקטרוקינטי.

זמן העיבוד הוא גם גורם לשקול העשרה ובידוד מרביים. זמן עיבוד של < 20 דקות התוצאה פחות מראש כי אין מספיק זמן כדי לאפשר microvesicle לפוחית ו אקסוחלק הגירה. מצד שני, זמן עיבוד של > 20 דקות מתדרדר היעילות התמקדות ומאפשר פיזור של מיקרושלפוחיות מועשר ואקסוזומים. לפי מבחן זה, 20 דקות הוא זמן העיבוד הטוב ביותר כדי להשיג העשרה מקסימלית ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים.

המתח המוחל הוא גורם חשוב אחר לשקול. בפרוטוקול זה, בהתחשב במספר הרבדים ובשטח המדגם, 30 V משמש להשגת ריכוז מקדים ובידוד יציב. כאשר נוצרת תופעה בתוך המכשיר, ניתן לחלק את משטר המבצע לשלושה אזורים נפרדים על פי המתח המוחל: (1) ohmic, (2) הגבלה, ו (3) אזורים הגבלת מיתר6,15,16. לקבלת ריכוז ובידוד יציבים, יש להפעיל את המכשיר באזור המגביל, שבו מופק אזור מחסור ביונים ומיקרוזטיבים ואקסוזומים מרוכזים באופן בלתי נשכח. בהגדרה ניסיונית זו, טווח מתח ההפעלה (5 ל-40 וולט) מקביל לאזור המגביל של ה-Exo-PAD. אם המתח שהוחל הוא < 5 V, המכשיר פועל באזור ohmic, שם הזרם החשמלי מגביר ליניארי, המציין כי אין אזור מחסור יון מופק לקדם ריכוז. עם זאת, אם המתח הוא > 40 V, אזור מחסור היונים נהרס על ידי הסעה חזקה במתח חשמלי, אשר מפרה את הריכוז. בהתחשב בגורמים אלה, נקבע כי 30 וולט היה המתח האופטימלי לשימוש עבור מכשיר עם 12 שכבות וקוטר שטח לדוגמה של 2-5 מ"מ. מספרי שכבות או קטרים באזור מדגם יכולים להיות מוגברים כדי להגדיל את נפח המדגם, אך גורמים אלה, כמו גם את מתח ההפעלה, צריך להיות ממוטב כדי להשיג העשרה

ניתן להשתמש ב-Exo-PAD המוצעת כדי לבודד מיקרווושלפוחיות ואקסוזומים מדגימות קליניות שונות, כולל רוק, שתן, סרום ופלסמה. עבור דגימות עם פחות חלבונים, כגון רוק או שתן, מיקרושלפוחיות ואקסוזומים ניתן לבודד בקלות ללא שינויים גדולים, כי כמות קטנה של חלבון בדגימות אלה סוננו דרך קשירה לא ספציפית לנייר. בעת הפעלת המכשיר בתוך אזור מגביל, רק את המתח המוחל צריך להיחשב, כי חוזק יונית של דגימות יכול להיות שונה. עבור דגימות עשירות בחלבון, כגון נסיוב או פלזמה, הן הריכוז הראשוני של המיקרושלפוחיות ואקסוזומים, והפרדת החלבונים שלהם מחלבוני שופע צריכה להיחשב בזהירות. הניסוי האחרון שלנו מראה כי הפרדת שלפוחיות ואקסוזומים מן החלבונים משופר באופן משמעותי כאשר משמש קרבונטי, כי התוצאות של מאגר פחמתי בהפרש גבוה יותר של הפער החשמלי בין מיקרושולפוחית ואקסוזומים וחלבון עקב נקודת איזואלקטריים, וכתוצאה מכך יעילות הפרדה טובה יותר. עבור ניסוי זה, חומר עם חלבונים שופע הקיים עם מיקרולוטיבים ו אקסוזומים היה מחקה על ידי ערבוב מיקרולוטיבים מטוהרים ו אקסוזומים עם תווית FITC (Ex/Em: 490/520 nm) עם BSA המסומן עם fluorophore שונים (Ex/Em: 590/617 nm) ב 50 mM קרבונט מאגר (טבלת חומרים). כפי שמוצג באיור המשלים 1, רוב המיקרושיטיות והאקסוזומים התרכזו בשכבה 8, כמו באיור 2a והם הופרדו מ-bsa, שנשארו בשכבות 1 – 3. תוצאה זו עולה כי העשרה מתוך סרום או פלזמה מדגם דורש צעד נוסף הוספת מאגר פחמתי למדגם, ובבירור מוכיח כי Exo-PAD יכול לטהר מיקרושלפוחיות ו אקסוזומים מן החלבונים שופע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית למחקר של קוריאה, גרנט NRF-2018R1D1A09084044. י. ה. לי היה נתמך על ידי מלגת מחקר מאוניברסיטת Kwangwoon בשנת 2019. הייארין קים נתמכת על-ידי תוכנית הפיתוח של מומחי התעשייה של המשרד הקוריאני למסחר, תעשייה ואנרגיה (MOTIE), מופעל על ידי מכון קוריאה לקידום טכנולוגיה (KIAT) (לא. P0002397, תוכנית HRD להתכנסות תעשייתית של התקנים חכמים לבישים).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
ריכוז מבוסס נייר ובידוד של מיקרושלפוחיות ואקסוזומים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter