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Biochemistry

마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

제시된 것은 미생물과 외종의 효과적인 농축 및 격리를 위한 종이 기반 장치를 제조하는 프로토콜이다.

Abstract

Microvesicles 및 엑소좀은 세포 외 환경에 풀어 놓이고 바디를 통해 순환하는 작은 membranous 소포입니다. DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질과 같은 다양한 부모 세포 유래 생체 분자를 함유하고 있기 때문에, 그들의 농축 및 격리는 임상 응용을 위한 잠재적인 바이오마커로서 그들의 착취를 위한 중요한 단계입니다. 그러나, 종래의 절연 방법(예를 들어, 초원심분리)은 마이크로베실 및 엑소좀에 상당한 손실과 손상을 일으킨다. 또한 이러한 방법은 시약의 초원심 분리, 적재 및 낭비의 여러 반복 단계가 필요합니다. 이 문서에서는 간단한 방식으로 미세 채소와 외종의 효과적인 농축 및 절연을 위해 설계된 종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)를 제조하는 상세한 방법을 설명합니다. 수렴 시료 영역이 있는 아코디언형 다층으로 구성된 엑소-PAD의 독특한 디자인은 이온 농도 편광 기술과 통합되어 특정 층에서 마이크로베실과 외종의 5배 농축을 가능하게 한다. 또한, 농축된 마이크로베실과 엑소솜은 엑소-PAD를 펼치기만 하면 격리된다.

Introduction

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마이크로베식과 엑소좀은 각각 0.2-1 μm 및 30-200 nm를 측정하는 작은 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 몇몇 다른 세포,모형1,,2,3,,4,5에의해 세포 외 환경으로 분비됩니다., 그들은 DNA, mRNA, miRNA, 단백질 및 지질의 하위 집합의 형태로 부모 세포 정보를 포함하고, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 양수 및 타액6,,7,,8,,9와같은 다양한 체액을 통해 신체 전체를 순환한다. 따라서, 생물학적 유체로부터 미생물과 외종의 효율적인 분리를 위한 기술은 새로운 치료법의 개발뿐만 아니라 질병의 진단, 예후 및 실시간 모니터링 분야에서 광범위한 기회를 제공할 수 있다.

그러나, 초원심분리에 기초한 마이크로베실 및 엑소좀에 대한 종래의 절연 방법은 매우 시간이 많이 소요되고 시료의 상당한 손실 및 오염을 야기한다. 이는 여러 번거로운 파이펫팅 및 적재 단계와 반복된 초원심,분리5,6,,10,11,,12를포함하는 다양한 시약의 폐기를 수반하기 때문이다., 더욱이, 초원심심분리(~100,000 x g)에의해 유도되는 높은 전단 응력은 미생물과 외종의 물리적 용해를 유발하여 회복율(5-23%)6,,13,,14를산출할 수 있다. 따라서, 마이크로베식및 엑소좀을 위한 매우 효율적이고 눈에 거슬리지 않는 격리 기술은 손상과 손실을 줄이기 위해 개발되어야 하므로 더 높은 회수율을 달성해야 합니다.

종이 접기 종이 기반 장치 (엑소-PAD)는 마이크로베실과 엑소좀6의간단하고 온화하며 매우 효율적인 격리를 위해 개발되었습니다. 엑소-PAD의 디자인은 지름이 점차 감소하는 일련 적으로 연결된 샘플 영역이 있는 다중 접힌 종이입니다. 이온 농도 편광(ICP) 기술은 전농축이 전하된 생체분자를 전하하는 나노 전기키네틱 현상이며, 이 독특한 설계와 통합되었다. Exo-PAD를 사용하면 특정 층에서 마이크로베식과 엑소좀이 5배 농축되고 장치를 전개하기만 하면 격리가 발생했습니다. 이 문서에서는 엑소-PAD를 자세히 설명하며, 전체 장치 제조 및 작동에서 사용 분석에 이르기까지 방법을 설명하고 대표적인 결과를 보여주는 6을설명한다.

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Protocol

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1. 장치 제작

  1. 프린터 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 종이에 인쇄할영역을 정의합니다.
    참고: 원형 샘플 영역의 직경이 5mm에서 2mm(그림1A)로점차 좁아진 12개의 왁스 패턴 레이어가 설계되어 있습니다.
  2. 상업용 왁스 프린터(재료 표)를 이용하여 셀룰로오스용지(재료표)의양면에 지정된 부위에 소수성 왁스를인쇄한다(도1B).
  3. 왁스 인쇄 용지를 실험실 오븐에 넣고 80s를 120°C로 놓습니다.
    참고: 이 단계를 통해 왁스는 인쇄된 왁스의 열 리플로우를 달성하여 용지 내부에 도달할 수 있습니다. 이 인큐베이션 프로토콜을 사용하면 패턴의 해상도가 ~2mm입니다. 따라서 2mm 미만의 패턴을 인쇄하지 않도록주의하십시오.
  4. 왁스 프린트 용지를 커터로 잘라 개별장치(그림 1C)를만듭니다.
  5. 5 μL 및 퍼마 선택적 멤브레인의 2 μL을 떨어 뜨립니다 (예 : Nafion; 재료 의 표) 각각(도 1D)을왼쪽 과 오른쪽 레이어의 샘플 영역에.
  6. 파마선택적 멤브레인용을 증발시키기 위해 70°C에서 70°C의 파마선택적 멤브레인으로 코팅된 층을 30분 동안 배치한다.
  7. 버퍼 용액을 향하는 코팅된 층의 가장 바깥쪽 표면을 압력에 민감한 테이프로 밀봉하여 작은 구멍을 남깁니다.
  8. 인쇄된 개별 장치(예: 엑소-PAD)를 흰색 선을 따라 앞뒤로 접습니다.
    참고: 장치를 접음으로써 모든 샘플 영역이 수렴됩니다(그림1E). 이 수렴 설계는 전압이 ICP에 적용될 때 전기장 라인에 초점을 맞추고 미세 베실과 외종의 집중적 사전 농도를 달성합니다.

2. 이온 농도 편광에 의한 미생물과 외종의 농축 및 공간 초점

  1. 마이크로베식 및 외성 시료의 15 μL(~3 x 1011 μl/mL 0.1x 인산완충식염식염수면 [PBS]0.05% Tween 20)을 파이프팅하여 수렴 시료 부위에 적재하고 몇 초 정도 기다린 후 모든 시료영역(그림 1F)의완전한 습윤을 보장한다.
  2. 엑소-패드의 양쪽 끝에 아크릴 챔버 2개를 놓고 작은 바인더 클립으로 엑소-PAD를 단단히 고정하여전개(그림 1G)를방지합니다.
  3. 챔버를 0.1x PBS 110 μL로 채우고 2개의 Ag/AgCl 전극(도1H)을삽입합니다.
  4. 전류 전압 소스 측정 시스템(재료 표)을 사용하여 20분 동안 전극에 30V를적용합니다.
    참고: 적용된 전압은 ICP 현상을 생성하고 따라서 엑소-PAD의 8및 9층에 마이크로베실과 엑소좀을 미리 농축합니다.

3. 농축 된 미생물과 외종의 격리

  1. 접힌 엑소-PAD를 아크릴 챔버로부터 분리하고 장치를 전개하여 농축된 미생물과 엑소좀을 다른 층으로부터분리한다(도 1I).
  2. 마이크로베실과 엑소좀이 농축되는 층 8과 9층의 샘플 영역을 다운스트림분석(그림 1J)에펀치한다.

4. 전자 현미경 분석 스캐닝

  1. 농축 된 미생물과 엑소좀은 0.1 M 나트륨 코코디레이트 버퍼에서 2.5 % 글루타랄데히드에 1 시간 동안 1 % 오스뮴 테트옥사이드를 1 시간 동안 0.1 M 나트륨 코코디레이트에 담그어 농축 된 미생물과 외성부위를 수정합니다.
    주의: 오스뮴 테트옥사이드는 매우 유독하고 유해한 화학 물질입니다. 오스뮴 테트옥사이드는 플라스틱에 침투할 수 있기 때문에 유리에 보관해야 합니다. 오스뮴 테트산화물의 모든 처리는 이중 니트릴 장갑화학 연기 후드에서 수행해야합니다.
  2. 200 증거 에탄올의 상승 등급으로 고정 된 미생물과 외종 (즉, 50%, 70 %, 90 %, 및 100 %)을 탈수하십시오. 각각 30분 동안.
  3. 30분 동안 건조기에 hexamethyldisilazane에 침지하여 화학적으로 샘플을 건조시.
    주의: Hexamethyldisilazane은 인화성 및 수분 에 민감한 화학 물질입니다. 발화원에서 멀리 떨어진 건조하고 통풍이 잘 되는 지역에 보관해야 합니다.
  4. 완전히 말린 미생물과 외종에 금/팔라듐(~20nm)을 스퍼터링을 통해 코팅하고 스캔 전자 현미경(SEM) 이미지를 캡처합니다.

5. 나노 입자 추적 분석

  1. 장치 작동 20분 후 생검 펀치를 사용하여 6층, 8, 10층의 샘플 영역을 펀치한다.
  2. 버퍼 솔루션(0.01% Tween 20)에 각 펀치아웃 영역을 담급니다.
  3. 6,000rpm에서 10분 동안 원심분리기와 30s의 원심분리기를 통해 농축된 미생물과 외식을 재보일시 중단시합니다.
  4. 용액에서 펀치 아웃 영역을 제거하고 나노 입자 추적 분석 (NTA) 기기(재료의 표)에의해 마이크로베시날과 엑소좀의 농도를 측정합니다.

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Representative Results

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농축 된 미생물 및 엑소좀의 최대 회수 율을 달성하기 위해 작동 시간을 최적화해야합니다. 시간이 부족하여 농축을 감소시키는 마이크로베식과 엑소좀의 충분한 이동을 허용하지 않는 반면, 과도한 시간은 공간 초점을 악화시키고 따라서 미세 채소와 외식을 분산시합니다. 따라서 시간 최적화 단계를 통해, 마이크로베식및 엑소좀의 최대 전농도 계수와 마이크로베실과 엑소좀이 가장 농축되는 최종 위치를 확인할 수 있다. 미생물과 외종의 최종 위치를 찾기 위해, 형광으로 표지된 미생물및 엑소좀의 시간 경과 이동은현미경(도 2A)으로관찰되었고 모든 샘플 영역에서형광 강도는 ImageJ 소프트웨어(그림2B)를사용하여 정량화하였다. 농축 공정(도2A,0분) 전에, 마이크로베실과 엑소좀은 종이 매트릭스의 약간의 여과 작용(도2B,0분)으로 인해 강도가 점진적으로 감소하는 모든 샘플 영역에 분산되었다. 10분 처리후(도 2A,10분), 마이크로베스캔및 엑소솜은 전기키네틱으로 이동하여 7층에 즉각적인 프리농도 플러그가 나타났다. 추가 처리는 마이크로베실과 엑소좀의 더 큰 전농도를 달성했습니다. 공정 시간이 20분이면, 마이크로베실과 엑소좀은 형광강도(도 2B,20분)에 기초하여 8층과 9층(도2A,20분)에 강하게 집중되었고, 5배 농축하였다.

사전 농도 과정을 완료한 후, 농축된 마이크로베실과 엑소좀은 장치를 전개하여 분리되었고, 층 8의 샘플 영역은 추가 분석을 위해 밖으로 펀치하였다. SEM 이미지는 농축 된 미생물 및 엑소좀의 무결성을 조사하기 위해 얻어졌습니다. SEM영상(도 3A)에도시된 바와 같이, 농축 과정 이후에 훨씬 더 손상되지 않은 미생물 및 엑소좀이 관찰되었다. 얻어진 SEM 영상을 이용하여, 농축된 미생물및 엑소좀의 크기분포(도 3B)를분석하였으며, 여기서 외종및 미생물은 200nm의 임계 직경에 기초하여 구별되었다. 즉, 외종의 크기는 평균 직경 134nm의 95~195nm, 평균 직경 315nm의 214~377nm의 마이크로베실의 크기입니다.

이어서, 6층, 8, 10층의 샘플 영역에 농축된 미생물 및 엑소좀의 실제 농도는 NTA에 의해 분석되었다. 농축 전에 농도는 ~2.24 x10 11 입자/mL로 8층(도3C,층 8)이었다. 농축 후, 농도는 ~1.25 x 10 12μm/mL로 8층(도3C,층 8)이었으며, 이는 마이크로베실과 엑소좀이 ~5.58의 인자에 의해 미리 집중되었음을 나타낸다.12 눈에 띄는 사전 농도는 다른층(도 3C,층 6 및 10)에서 관찰되지 않았다. 종합하면, 이러한 결과는 제안된 종이 기반 장치가 약 5배씩 마이크로베시클과 엑소좀을 풍부하게 할 수 있음을 보여준다.

장치의 절연 효율은 다음과 같이 평가하였다: 엑소-PAD의 협착 설계로 인해 10층에서 총 15μL의 샘플 부피 중 ~2.2 μL밖으로 8층 과 9층으로 수용될 수 있는 샘플 부피가 ~2.2 μL이다. 모든 미세채소와 엑소좀이 8층과 9층에 미리 집중되어 분실되지 않는 이상적인 경우, 이상적인 전농도 계수는 ~6.8(15 μL/2.2 μL = ~6.8)이어야 한다. 그러나, NTA(도3c)에의해 얻어진 실험전농도인자는 ~5.58로, 이는 1.22 마이크로베실및 엑소좀의 일부가 종이 매트릭스에 대한 용해 또는 비특이적 결합에 의해 손실되었다는 것을 의미한다.
Equation 1
여기서 2.24 x 1012 입자/mL은 마이크로베실과 엑소좀의 초기 농도이다. 이 계산에서 엑소-패드의 예상 손실률은 약 18%입니다. 따라서 격리 효율은 약 82%입니다. 이는 초원심분리(5%-23%)의 저조한 수익률에 비해 크게 개선된 수치입니다.

Figure 1
그림 1: 조립에서 작동까지 전체 엑소-PAD 절차입니다. (A)셀룰로오스 종이에 소수성 왁스의 인쇄를 안내하는 소프트웨어 설계. (B)120°C에서 80s에 대한 오븐에서 인큐베이션 후 왁스 인쇄 용지. (C)개별 장치는 커터를 사용하여 절단된다. (D)퍼미선택적 멤브레인 용액은 왼쪽 및 오른쪽 층의 샘플 영역에 떨어지고 용매가 70°C에서 핫플레이트에서 30분 동안 증발된다.(E)인쇄된 엑소-PAD는 백색 선을 따라 앞뒤로 접혀; 따라서 모든 샘플 영역은 수렴연결됩니다. (F)미세베식 및 외식 샘플이 샘플 영역에 적재된다. (G)두 개의 아크릴 챔버가 장치의 끝에 배치되고 작은 바인더 클립으로 고정됩니다. (H)아크릴 챔버는 완충액으로 채워지고 2개의 Ag/AgCl 전극이 삽입되어 30V.(I)장치는 미리 농축된 마이크로베실과 엑소좀을 분리하기 위해 전개된다. (J)도면 8과 9층의 샘플 영역은 분석을 위해 펀치아웃된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 장치 작동 중 형광으로 표지된 미생물 및 외종의 관찰 및 해당 형광 강도. (A)마이크로베실과 외종의 시간 경과 관찰. 스케일 바 = 5mm. 20분 처리로, 마이크로베식과 엑소좀은 8층과 9층에 강하게 집중되었고, 여기서(B)약 5배씩 농축되었다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 농축된 미생물 및 외종의 분석. (A)농축 된 미생물및 엑소좀의 무결성을 보여주는 SEM 이미지. 사전 농도 후, 더 많은 미생물및 엑소좀이관찰되었다 6. 스케일 바 = 1 μm. (B)농축 된 미생물 및 엑소좀의 크기 분포. 엑소솜 크기는 95-195 nm (평균 직경 = 134 nm)이고 마이크로베시클 크기는 214-377 nm (평균 직경 = 315 nm)이었다. (C)NTA를 사용하여 평가된 농축 된 미생물 및 엑소좀의 실제 농도. 농축 후, 마이크로베실과 엑소좀의 농도는 형광 결과6과일치하는 다섯 배 증가. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n = 3). 패널 A와 C는 김 외6의허락하에 재현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: 마이크로베시클과 엑소좀은 미리 집중되어 8층에 초점을 맞춘 소 세럼 알부민(BSA)과 분리되어 1-3층에 머물렀다. Please click here to download this file.

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Discussion

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엑소-PAD는 마이크로베실과 외종의 농축 및 절연을 위해 성공적으로 사용되었지만, 여러 가지 중요한 점은 신중하게 고려해야 합니다: 1) 장치 제조 중 오븐 잠복기 시간과 온도, 2) 처리 시간, 3) 다양한 층 수와 샘플 영역 직경을 가진 전압의 적용, 그리고 4) 임상 샘플에 대한 적용가능성.

프로토콜에 주어진 인큐베이션 시간과 온도는 신뢰할 수 있는 장치를 조작하는 데 최적화된 조건이다. 더 긴 잠복 시간 또는 더 높은 온도는 인쇄 된 왁스의 과도한 리플로우로 인해 수렴 설계의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 이를 통해 집중된 전기장 라인의 형성을 방지하고 전기키네틱 농축 공정 중 의 이주 저항을 증가시킵니다.

처리 시간은 또한 최대의 농축 및 격리를 고려해야 하는 요소입니다. 마이크로베식및 엑소솜 이동을 허용하는 충분한 시간이 없기 때문에 <20 분의 처리 시간이 더 적은 사전 농도를 초래합니다. 한편, >20분의 처리 시간은 초점 효율을 저하시키고 농축된 미생물및 엑소좀의 분산을 가능하게 한다. 이 시험에 따르면, 20 분은 마이크로 베식및 엑소좀의 최대 농축 및 격리를 달성하기위한 최고의 처리 시간입니다.

적용된 전압은 고려해야 할 또 다른 중요한 요소입니다. 이 프로토콜에서는, 층의 수와 샘플 면적 직경을 고려하여, 30 V는 안정적인 사전 농도 및 격리를 달성하기 위해 사용된다. ICP 현상이 장치에서 생성될 때, 동작 정권은 적용된 전압에 따라 3개의 별개의 영역으로 나눌 수 있다: (1)6오믹, (2) 제한, 및 (3) 과제한 영역6,15,,16. 안정적인 사전 농도 및 격리를 위해 이온 고갈 영역이 생성되고 마이크로베실과 엑소좀이 안정적으로 미리 농축된 제한 영역에서 장치를 작동시켜야 합니다. 이러한 실험 환경에서 작동 전압 범위(5-40 V)는 엑소-PAD의 제한 영역에 해당한다. 적용된 전압이 <5 V인 경우, 장치는 전류가 선형으로 증가하는 ohmic 영역에서 작동하며, 이는 사전 농도에 대해 이온 고갈 영역이 생성되지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나 전압이 >40 V인 경우 이온 고갈 영역은 강한 전압 구동 전기 응고에 의해 파괴되어 사전 농도가 불안정해지습니다. 이러한 요인을 고려하여, 30V는 12층 및 샘플 면적 직경 2-5mm의 장치에 사용하기에 최적의 전압이 결정되었다.

제안된 엑소-PAD는 타액, 소변, 혈청 및 혈장을 포함한 다양한 임상 샘플에서 미생물과 외인성들을 분리하는 데 사용할 수 있다. 타액이나 소변과 같은 단백질이 적은 시료의 경우, 마이크로베실및 엑소좀은 큰 변화 없이 쉽게 분리될 수 있으며, 이는 이들 샘플에서 소량의 단백질이 종이에 대한 비특이적 결합을 통해 여과될 것이기 때문이다. 제한 영역 내에서 장치를 작동할 때는 시료의 이온 강도가 다를 수 있으므로 적용된 전압만 고려해야 합니다. 혈청이나 혈장과 같은 단백질이 풍부한 시료의 경우, 마이크로베실과 엑소좀의 사전 농도와 풍부한 단백질로부터의 분리를 신중하게 고려해야 합니다. 우리의 최근 실험은 탄산완충제가 사용될 때 단백질로부터 마이크로베실과 외종의 분리가 현저히 향상된다는 것을 보여줍니다, 탄산완충이 상류점 때문에 마이크로베식과 외산및 단백질 사이의 더 높은 전기 전하 차이를 초래하기 때문에, 더 나은 분리 효율의 결과로. 이 실험을 위해, 마이크로베실과 엑소좀과 공존하는 풍부한 단백질을 가진 물질은 FITC(Ex/Em: 490/520 nm)로 표시된 정제된 마이크로베스캔및 엑소좀을 BSA와 혼합하여 모방하였다(Ex/Em: 590/617 nm) 5M의카본(50m)의다른 불소포레(Ex/Em: 590/617 nm)로 표로 표로 표기하였다. 보충도 1에도시된 바와 같이, 대부분의 미세채소와 엑소좀은 도 2A에서와 같이 8층에 미리 집중되었고, 1-3층으로 유지된 BSA로부터 분리되었다. 이 결과는 혈청 또는 혈장 샘플로부터 농축이 시료에 탄산염 버퍼를 추가하는 추가 단계가 필요하다는 것을 시사하며, 엑소-PAD가 풍부한 단백질로부터 미생물과 외질을 정화할 수 있음을 명확하게 보여줍니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 한국 국립연구재단인 그랜트 NRF-2018R1D1A09090840444가 지원했다. 이준은 2019년 광운대학교 연구보조금의 지원을 받았다. 김효린 은 한국과학기술원(KIAT)이 운영하는 산업통상자원부(MOTIE)의 '산업전문가를 위한 역량개발 프로그램'의 지원을 받았다. P0002397, 웨어러블 스마트 기기의 산업 융합을 위한 HRD 프로그램).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

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References

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마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리
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Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

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