Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتصنيع جهاز ورقي لإثراء وعزل الميكروبات والكوسومات بشكل فعال.

Abstract

microvesicles وicssosomes هي الحويصلات membranous الصغيرة التي تم إصدارها إلى البيئة خارج الخلية وتعميمها في جميع أنحاء الجسم. ولأنها تحتوي على جزيئات بيولوجية مشتقة من خلايا أبوية مختلفة مثل الحمض النووي، والميرنا، والميرنا، والبروتينات، والدهون، فإن إغناءها وعزلها هما خطوتان حاسمتان لاستغلالهما كمعلمات بيولوجية محتملة للتطبيقات السريرية. ومع ذلك، فإن طرق العزل التقليدية (مثل الطرد الشديد) تسبب خسائر كبيرة وأضرار في الميكروسات الدقيقة. تتطلب هذه الطرق أيضًا خطوات متكررة متعددة للطرد الشديد التركيز والتحميل وإهدار الكواشف. توضح هذه المقالة طريقة مفصلة لاختلاق جهاز الورق اوريغامي القائم على (Exo-PAD) مصممة لإثراء فعالة وعزلة من microvesicles و exosomes بطريقة بسيطة. إن التصميم الفريد لـ Exo-PAD، الذي يتكون من طبقات متعددة الطبقات الشبيهة بالأكورديون مع مناطق عينة متقاربة، مدمج مع تقنية استقطاب تركيزات الأيونات، مما يتيح إثراء خمسة أضعاف من الطبقات الدقيقة والأكسوسوم على طبقات محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عزل microvesicles المخصب واكسوسوم ببساطة من خلال تتكشف إكسو-PAD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الدقيقة والويسوس هي غشاء صغير الحويصلات قياس 0.2−1 ميكرومتر و 30-200 نانومتر، على التوالي. ويفرز في بيئة خارج الخلية من قبل عدة أنواع مختلفة من الخلايا1،2،3،4،5. أنها تحتوي على معلومات الخلية الأبوية في شكل مجموعات فرعية من الحمض النووي، مرنا، ميرنا، البروتينات، والدهون، وتدور في جميع أنحاء الجسم عن طريق سوائل الجسم المختلفة مثل المصل، والبلازما، والبول، والسوائل النخاعية، السائل الأمنيوسي، واللعاب,,,9. وهكذا، يمكن أن توفر تقنيات العزل الفعال للميكروسات الدقيقة والإكسوسومات من السوائل البيولوجية فرصًا واسعة في مجالات التشخيص والتكهن والرصد في الوقت الفعلي للمرض، وكذلك في تطوير علاجات جديدة.

ومع ذلك، فإن طريقة العزل التقليدية للميكروسينتوريس و الكوسومات القائمة على الطرد فوق المركز تستغرق وقتاً طويلاً للغاية وتسبب خسارة كبيرة وتلوث العينة. وذلك لأنه ينطوي على عدة خطوات مرهقة pipetting والتحميل والتخلص من الكواشف المختلفة مع تكرار الrifugation5،6،10،11،12. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يسبب الإجهاد القص عالية الناجمة عن الطاردة المفرطة (~ 100،000 س ز) التحلل المادي من microvesicles واكسوزومات، مما يؤدي إلى معدلات انتعاش الفقراء (5-23٪),13،,14. ولذلك، يجب تطوير تقنية عزل عالية الكفاءة وغير مزعجة للميكروفيسيليس واكسوسومات للحد من الأضرار والفقدان، وبالتالي تحقيق معدلات أعلى للتعافي.

تم تطوير جهاز اوريغامي ورقة المستندة (Exo-PAD) لعزل أبسط وألطف، وكفاءة عالية من microvesicles و exosomes6. تصميم EXO-PAD هو ورقة متعددة المستويات مع مناطق عينة متصلة بشكل تسلسلي التي تتناقص تدريجيا في القطر. تم دمج تقنية استقطاب تركيز الأيوني (ICP) ، وهي ظاهرة نانو كهربية مركزية تعمل قبل التركيز على الجزيئات الحيوية المشحونة ، مع هذا التصميم الفريد. أدى استخدام EXO-PAD إلى إثراء خمسة أضعاف من microvesicles وicsos في طبقات محددة وعزلها ببساطة عن طريق الكشف عن الجهاز. توضح هذه المقالة EXO-PAD بالتفصيل، من التصنيع العام للجهاز وتشغيله إلى تحليل استخدامه، لتوضيح الأسلوب وإظهار النتائج التمثيلية6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. تصنيع الأجهزة

  1. تحديد المنطقة التي سيتم طباعتها على الورق باستخدام برنامج الطابعة(جدول المواد).
    ملاحظة: يحتوي التصميم على 12 طبقة منقوشة بالشمع حيث تضيق أقطار مناطق العينة الدائرية تدريجياً من 5 ملم إلى 2 مم(الشكل 1A).
  2. طباعة الشمع الهيدروفوس على المناطق المعينة على جانبي ورقة السليلوز (جدول المواد) باستخدام طابعة شمعية تجارية (جدول المواد) (الشكل 1B).
  3. ضع الورق المطبوع بالشمع في فرن المختبر لمدة 80 درجة مئوية عند 120 درجة مئوية.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة الشمع للوصول إلى داخل ورقة من خلال تحقيق إعادة تدفق الحرارية من الشمع المطبوعة. مع هذا البروتوكول الحضانة، والقرار من نمط هو ~ 2 ملم. وبالتالي، يجب الحرص على عدم طباعة أنماط أقل من 2 ملم. وإلا سيتم حظر أنماط من قبل الشمع.
  4. قطع ورقة الشمع المطبوعة مع القاطع لجعل الأجهزة الفردية (الشكل 1C).
  5. إسقاط 5 ميكرولتر و 2 ميكرولتر من غشاء permselective (على سبيل المثال، نافيون؛ جدول المواد) على مناطق العينة في أقصى اليمين والطبقات أقصى اليمين ، على التوالي (الشكل 1D).
  6. ضع الطبقات المغلفة بالغشاء المتمحدد على صفيحة ساخنة عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتتبخر مذيب الغشاء المتمحدد.
  7. ختم السطح الخارجي للطبقة المطلية التي تواجه الحل العازلة مع الشريط الحساس للضغط، وترك ثقب صغير.
  8. أضعاف الجهاز الفردية المطبوعة (أي، إكسو-PAD) ذهابا وإيابا على طول الخطوط البيضاء.
    ملاحظة: عن طريق طي الجهاز، تصبح جميع مناطق العينة متصلة بشكل متقارب(الشكل 1E). ويركز هذا التصميم المتقارب خطوط الحقل الكهربائية عندما يتم تطبيق الجهد على برنامج المقارنات الدولية، مما يحقق تركيزًا مسبقًا أكثر كثافة للميكروفيسلات واكسوسومس.

2- إثراء التركيز المكاني للميكروسينت واكسوسومات الإكسوسات بواسطة استقطاب تركيزات الأيونات

  1. تحميل 15 ميكرولتر من العينة الدقيقة واكسوسوم (~ 3 ×10 10 جسيمات / مل في 0.1x الفوسفات المخزنة المالحة [PBS] مع 0.05٪ توين 20) في مناطق العينة متقاربة عن طريق الأنابيب والانتظار بضع ثوان لضمان إكمال نحن من جميع مناطق العينة (الشكل 1F).
  2. مكان غرفتين الاكريليك في كلا طرفي EXO-PAD ومشابك EXO-PAD بشكل آمن مع مقاطع الموثق الصغيرة لمنع تتكشف(الشكل 1G).
  3. ملء الغرف مع 110 μL من 0.1x PBS وإدراج اثنين Ag / AgCl الأقطاب الكهربائية (الشكل 1H).
  4. تطبيق 30 V إلى الأقطاب الكهربائية لمدة 20 دقيقة باستخدام نظام قياس مصدر التيار الجهد(جدول المواد).
    ملاحظة: الجهد التطبيقي يولد ظاهرة برنامج المقارنات الدولية وبالتالي preconcentrates microvesicles و exosomes على الطبقات 8 و 9 من EXO-PAD.

3- عزل الميكروفيسات والأكسوسومات الغنية

  1. فصل مطوي Exo-PAD من غرف الاكريليك وتتكشف الجهاز لعزل microvesicles المخصب واكسوسوم من الطبقات الأخرى (الشكل 1I).
  2. لكمة خارج مناطق العينة في الطبقات 8 و 9، حيث يتم إثراء microvesicles و exosomes، لتحليل المصب(الشكل 1J).

4. مسح التحليل المجهري الإلكتروني

  1. إصلاح microvesicles المخصب واكسوسومات عن طريق غمر المناطق لكمات في 2.5٪ glutaraldehyde في 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة لمدة 1 ساعة وفي 1٪ أوسميوم تتراوكسيد في 0.1 M كاوديلات الصوديوم لمدة 1 ساعة.
    تنبيه: أوزميوم تتروكسيد مادة كيميائية شديدة السامة والخطرة. لأن أوزميوم تيتروكسيد يمكن أن تخترق البلاستيك، يجب أن تكون مخزنة في الزجاج. يجب أن يتم إجراء أي معالجة من التيتروكسيد osmium في غطاء الدخان الكيميائية مع قفازات النتريل مزدوجة.
  2. يجفف الدقيق الثابت والاكسوسوم مع درجات تصاعدية من 200 الايثانول دليل (أي 50٪، 70٪، 90٪، و 100٪) لمدة 30 دقيقة لكل من.
  3. قم بتجفيف العينة كيميائيًا عن طريق غمرها في سداسية الميثيليديسيلازان في جهاز تجفيف لمدة 30 دقيقة.
    تنبيه: Hexamethyldisilazane مادة كيميائية قابلة للاشتعال وحساسة للرطوبة. يجب تخزينها في منطقة جافة وجيدة التهوية بعيدا عن مصادر الاشتعال.
  4. معطف microvesicles المجففة تماما وicsosomes مع الذهب / البلاديوم (~ 20 نانومتر) عن طريق sputtering والتقاط المجهر الإلكتروني المسح (SEM) الصور.

5. تحليل تتبع الجسيمات النانوية

  1. لكمة خارج مناطق العينة في طبقات 6 و 8 و 10 باستخدام لكمة خزعة بعد 20 دقيقة من عملية الجهاز.
  2. غمر كل منطقة بالكم في محلول عازل (0.1x PBS مع 0.01٪ Tween 20).
  3. دوامة لمدة 10 دقيقة والطرد المركزي لمدة 30 s في 6000 دورة في الدقيقة لإعادة الاعتماد على microvesicles المخصب وexosomes.
  4. إزالة المناطق لكمات التدريجي من الحل وقياس تركيز microvesicles واكسوسومس من قبل تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) الصك (جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يجب أن يكون الوقت عملية الأمثل لتحقيق أقصى عائد الانتعاش من microvesicles المخصب واكسوسوم. عدم كفاية الوقت لا يسمح هجرة كافية من microvesicles وicsssومات، مما يقلل من الإثراء، في حين أن الوقت المفرط يتدهور التركيز المكاني وبالتالي يثر microvesicles وicsss. وهكذا، من خلال خطوة التحسين الوقت، يمكن تحديد عامل التركيز المسبق الأقصى من microvesicles و exosomes والموقع النهائي حيث يتم تخصيب معظم microvesicles و exosomes. للعثور على الموقع النهائي للميكروسين، لوحظت الهجرة الفاصل الزمني من الفلورسنت المسمى microvesicles وicssosomes مع المجهر(الشكل 2A)وتم تحديد كمي شدة الفلوريسين في جميع مناطق العينة باستخدام برنامج ImageJ(الشكل 2B). قبل عملية التخصيب(الشكل 2A، 0 دقيقة) ، تم تشتيت الدقيقات والأكسوسوم في جميع مناطق العينة مع انخفاض تدريجي في الكثافة بسبب عمل التصفية الطفيف للمصفوفة الورقية(الشكل 2B، 0 دقيقة). بعد 10 دقيقة من المعالجة(الشكل 2A، 10 دقيقة) ، هاجرت microvesicles و exosomes كهربائيًا وظهر قابس تركيز فوري على الطبقة 7. كما حققت المعالجة الأخرى قدرا أكبر من التركيز المسبق للميكروساليس الدقيقة والكوسومات. عندما وصلت إلى وقت العملية 20 دقيقة، microvesicles وicssومات كانت تركز بقوة على الطبقات 8 و 9(الشكل 2A، 20 دقيقة) وإثراء خمسة أضعاف، استنادا إلى كثافة الفلوريسنس(الشكل 2B، 20 دقيقة).

بعد الانتهاء من عملية ما قبل التركيز ، تم عزل الميكروبات المخصبة والإكسوسومات من خلال الكشف عن الجهاز وتم لكم منطقة العينة في الطبقة 8 لمزيد من التحليل. تم الحصول على صور SEM للتحقيق في سلامة الجسيمات الدقيقة المخصب وicesosomes. كما هو مبين في الصور SEM(الشكل 3A)،لوحظت أكثر بكثير من مجهرية غير مُغَسَمَّة واكسوسوم بعد عملية التخصيب. باستخدام الصور التي تم الحصول عليها SEM، تم تحليل توزيع حجم microvesicles المخصب وicsosomes (الشكل 3B)، حيث تم تمييز الاكسوسيات و microvesicles على أساس عتبة قطرها 200 نانومتر. وبعبارة أخرى، تراوح حجم إكسوسومات من 95-195 نانومتر مع قطر متوسط من 134 نانومتر وميكروسفيسليس من 214-377 نانومتر مع قطر متوسط من 315 نانومتر.

وبعد ذلك، تم تحليل التركيز الفعلي للميكروفيسلات الدقيقة المخصبة واكسوسومس على مناطق العينة في الطبقات 6 و8 و10 بواسطة NTA. قبل التخصيب، كان التركيز ~ 2.24 ×10 11 جسيمات/ مل في الطبقة 8(الشكل 3C،الطبقة 8). وبعد التخصيب، كان التركيز 1.25 × 1012 جسيمات/مل في الطبقة 8(الشكل 3C،الطبقة 8)، مما يشير إلى أن الجسيمات الدقيقة والكوسومات كانت مركزة مسبقاً بمعامل قدره 5.58~ لم يلاحظ التركيز المسبق الملحوظ على الطبقات الأخرى(الشكل 3C،الطبقات 6 و 10). وتبين هذه النتائج مجتمعة أن الجهاز الورقي المقترح يمكن أن يثري الجسيمات الدقيقة والأكسوسوم بخمسة أضعاف تقريبا.

تم تقييم كفاءة عزل الجهاز على النحو التالي: حجم العينة التي يمكن استيعابها من قبل الطبقة 8 و 9 هو ~ 2.2 ميكرولتر من إجمالي 15 ميكرولتر من حجم العينة في 10 طبقات بسبب تصميم تضييق من إكسو-PAD. إذا افترضنا حالة مثالية حيث يتم التركيز مسبقاً على الطبقة 8 و 9 كل من microvesicles و exosomes على لا شيء، ثم عامل التركيز المسبق المثالي يجب أن يكون ~ 6.8 (15 ميكرولتر/2.2 ميكرولتر = 6.8). ومع ذلك، كان عامل التركيز التجريبي الذي حصلت عليه NTA (الشكل 3c) 5.58 ~ ، مما يعني أن جزءًا من 1.22 ميكروفيسلات واكسوسومات فقدت بسبب التحلل أو الربط غير محدد للمصفوفة الورقية.
Equation 1
حيث 2.24 × 1012 جسيمات / مل هو التركيز الأولي من microvesicles و exosomes. ومن هذه العملية الحسابية، يبلغ معدل الخسارة المتوقعة لنسبة الـ Exo-PAD حوالي 18 في المائة؛ وبالتالي ، فإن كفاءة العزل حوالي 82٪. وهذا تحسن كبير مقارنةً بالغلة الفقيرة للطرد المفرط (5% –23%).

Figure 1
الشكل 1: إجراءات Exo-PAD الشاملة، من التجميع إلى التشغيل. (A) تصميم البرمجيات لتوجيه طباعة الشمع على ورق السليلوز. (B) ورقة مطبوعة بالشمع بعد الاحتضان في فرن لمدة 80 s عند 120 درجة مئوية. (C) يتم قطع الأجهزة الفردية باستخدام القاطع. (D)يتم إسقاط محلول الغشاء المستمر على مناطق العينة في الطبقات أقصى اليمين والأيسر والمذيبات تبخرت على الساخنة في 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (E)يتم طي Exo-PAD المطبوعة ذهابا وإيابا على طول الخطوط البيضاء؛ وبالتالي فإن جميع مناطق العينة متصلة بشكل متقارب. (F) يتم تحميل عينة ميكروفيسيكوس واكسوسوم في منطقة العينة. (G) يتم وضع غرفتين من الاكريليك في نهايات الجهاز وتأمينها مع مقاطع صغيرة من الموثق. (H) غرف الاكريليك مليئة حل العازلة واثنين Ag / AgCl يتم إدراج الأقطاب لتطبيق الجهد من 30 V. (I) يتم كشف الجهاز لعزل microvesicles و exosomes مركزة مسبقا. (J) يتم لكم مناطق العينة في الطبقات 8 و 9 للتحليل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: ملاحظة وميكروفيسليكات الفلورية المسماة واكسوسوم أثناء تشغيل الجهاز وكثافات الفلورس المقابلة. (أ) رصد الفاصل الزمني من microvesicles وicesosomes. شريط مقياس = 5 ملم. مع 20 دقيقة من المعالجة، كانت تركز بقوة على microvesicles و exosomes على الطبقات 8 و 9، حيث(B)تم إثراؤها بنحو خمسة أضعاف. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (n = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل الميكروفيسات واكسوسوس. (أ) صور SEM تظهر سلامة microvesicles المخصب وicesosomes. بعد التركيز المسبق ، لوحظ العديد من اخصوم مجهرية واكسوسومات6. شريط مقياس = 1 μm. (B) توزيع حجم microvesicles المخصب وicesosomes. وكانت أحجام الاكسوس 95-195 نانومتر (متوسط القطر = 134 نانومتر) وأحجام الميكروبات 214-377 نانومتر (متوسط القطر = 315 نانومتر). (ج)التركيز الفعلي للميكروفيسلات المخصبة وicesosomes تقييم باستخدام NTA. بعد التخصيب، زاد تركيز اضحاي و اضحاوس خمسة أضعاف، وهو ما يتفق مع نتائج الفلورسينس6. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (n = 3). ويعاد إنتاج الألواح ألف وجيم بإذن من كيم وآخرون6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تم فصل ميكروفيسيكوسليس واكسوسوسنتنتوليمركس وركزت على طبقة 8 من الألبومين مصل البقر (BSA)، الذي بقي في طبقات 1-3. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

على الرغم من أن EXO-PAD استخدمت بنجاح لإثراء وعزل microvesicles وicsos، ينبغي النظر بعناية عدة نقاط حرجة: 1) وقت حضانة الفرن ودرجة الحرارة أثناء إعداد الجهاز، 2) وقت المعالجة، 3) تطبيق الجهد مع أرقام طبقة متفاوتة وأقطار منطقة العينة، و 4) إمكانية التطبيق على العينات السريرية.

وقت الحضانة ودرجة الحرارة المعطاة في البروتوكول هي الظروف الأمثل لتصنيع جهاز موثوق به. قد تتسبب أوقات الحضانة الأطول أو ارتفاع درجة الحرارة في تشويه التصميم المتقارب بسبب إعادة التدفق المفرط للشمع المطبوع. وهذا من شأنه أن يمنع تشكيل خطوط الحقول الكهربائية المركزة وبالتالي يزيد من مقاومة الهجرة أثناء عملية الإثراء الكهربائي.

كما أن زمن المعالجة عامل ينبغي مراعاته لأقصى قدر من الإثراء والعزل. ينتج عن وقت المعالجة <20 دقيقة تركيزًا أقل نظرًا لعدم وجود وقت كافٍ للسماح بهجرة الميكروستين وميكسوسوس. من ناحية أخرى، وقت معالجة > 20 دقيقة يتدهور كفاءة التركيز ويسمح تشتت microvesicles المخصب واكسوسوم. وفقا لهذا الاختبار، 20 دقيقة هو أفضل وقت للمعالجة لتحقيق أقصى قدر من الإثراء والعزلة من microvesicles وicسوسوم.

الجهد تطبيق عامل مهم آخر للنظر. في هذا البروتوكول، وبالنظر إلى عدد الطبقات وأقطار مساحة العينة، يتم استخدام 30 V لتحقيق تركيز وعزل مستقرين. عندما يتم إنشاء ظاهرة برنامج المقارنات الدولية في الجهاز، يمكن تقسيم نظام التشغيل إلى ثلاث مناطق متميزة وفقا للجهد المطبق: (1) أومميك، (2) الحد، و (3) المناطق overlimiting,15،,16. وفيما يتعلق بالتكلس والعزل المستقرين، ينبغي تشغيل الجهاز في المنطقة المقيدة، حيث يتم إنشاء منطقة نضوب أيونات ويتم التركيز مسبقاً على الجسيمات الدقيقة والكوسومات. في هذا الإعداد التجريبي، يتوافق نطاق الجهد التشغيلي (5−40 فولت) مع المنطقة المقيدة لـ Exo-PAD. إذا كان الجهد المطبق هو <5 V، يعمل الجهاز في منطقة أوميك، حيث يزيد التيار الكهربائي خطياً، مما يشير إلى أنه لا يتم إنشاء منطقة استنزاف أيونات من أجل التركيز المسبق. ومع ذلك ، إذا كان الجهد هو > 40 V ، يتم تدمير منطقة استنزاف الأيونات بواسطة الكهربائي القوي الذي يحركه الجهد ، مما يزعزع استقرار التركيز المسبق. وبالنظر إلى هذه العوامل، تقرر أن 30 V هو الجهد الأمثل لاستخدام جهاز مع 12 طبقة وقطر مساحة عينة من 2−5 ملم. يمكن زيادة أرقام الطبقة أو أقطار منطقة العينة لتوسيع حجم العينة، ولكن ينبغي تحسين هذه العوامل، وكذلك الجهد التشغيلي، لتحقيق إثراء مستقر للميكروفيسات والإكسوس.

يمكن استخدام Exo-PAD المقترح لعزل الميكروبات واكسوسوس من العينات السريرية المختلفة، بما في ذلك اللعاب والبول والمصل والبلازما. بالنسبة للعينات التي يقل فيها البروتين، مثل اللعاب أو البول، يمكن عزل المكروفيسرات والأكسوسوم بسهولة دون تغييرات كبيرة، لأن كمية صغيرة من البروتين في هذه العينات سيتم تصفيتها من خلال الربط غير محدد للورقة. عند تشغيل الجهاز داخل المنطقة الحد، فقط الجهد تطبيقها يحتاج إلى النظر، لأن قوة الأيونية من العينات يمكن أن تكون مختلفة. وبالنسبة للعينات الغنية بالبروتين، مثل المصل أو البلازما، ينبغي النظر بعناية في كل من التركيز المسبق على الميكروسينيات الدقيقة والإكسوسوم وفصلها عن البروتينات الوفيرة. وتظهر تجربتنا الأخيرة أن فصل الميكروبافيس واكسوسوميس من البروتينات تحسن بشكل كبير عند استخدام العازلة الكربونات، لأن العازلة الكربونية يؤدي إلى ارتفاع الفرق تهمة الكهربائية بين microvesicles و exosomes والبروتين بسبب نقطة الأيزوكهربتريك، مما أدى إلى كفاءة أفضل الفصل. لهذه التجربة، كانت محاكاة مادة ذات بروتينات وفيرة تتعايش مع ميكروفيسيكوس واكسوسومات من خلال خلط جسيمات الدقيق المنقى واكسوسومات المسمى مع FITC (Ex/Em: 490/520 نانومتر) مع BSA المسمى مع فلوروفهور مختلفة (Ex/Em: 590/617 نانومتر) في 50 mM كربونات العازلة(جدول المواد). وكما هو مبين في الشكل التكميلي 1،فإن معظم جسيمات الدقيق والكوسومات كانت مركزة مسبقاً على الطبقة 8، كما هو الحال في الشكل 2A، وتم فصلها عن BSA، التي بقيت في طبقات 1-3. هذه النتيجة تشير إلى أن الإثراء من عينة مصل أو البلازما يتطلب خطوة إضافية إضافة الكربونات العازلة إلى العينة، وتثبت بوضوح أن EXO-PAD يمكن تنقية microvesicles واكسوسوم من البروتينات وفيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا، منحة NRF-2018R1D1A1A090840444. تم دعم J. H. Lee بمنحة بحثية من جامعة كوانجون في عام 2019. 11- وقد تلقى هيرين كيم الدعم من "برنامج تطوير الكفاءة للمتخصصين في الصناعة" التابع لوزارة التجارة والصناعة والطاقة الكورية، الذي يديره المعهد الكوري للنهوض بالتكنولوجيا (KIAT) (رقم 1999). P0002397، HRD برنامج التقارب الصناعي للأجهزة الذكية القابلة للارتداء).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter