Papirbaseret forkoncentration og isolering af mikrovekler og exosoler
Summary
Præsenteret er en protokol til at fremstille en papir-baseret enhed til effektiv berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer.
Abstract
Microvesicles og exosomer er små membranøse vesikler frigivet til det ekstracellulære miljø og cirkulerede i hele kroppen. Fordi de indeholder forskellige forældrecellebaserede biomolekyler såsom DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, er deres berigelse og isolation afgørende skridt for deres udnyttelse som potentielle biomarkører til kliniske anvendelser. Konventionelle isolationsmetoder (f.eks. ultracentrifugation) forårsager imidlertid betydelige tab og skader på mikrovekler og exosomer. Disse metoder kræver også flere gentagne trin i ultracentrifugation, lastning og spilde af reagenser. Denne artikel beskriver en detaljeret metode til at fremstille en origami-papir-baseret enhed (Exo-PAD) designet til effektiv berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer på en enkel måde. Exo-PAD’s unikke design, der består af harmonikalignende flerfoldede lag med konvergerende prøveområder, er integreret med ionkoncentrationspolariseringsteknikken, hvilket muliggør femdoblet berigelse af mikrovekler og exosomer på specifikke lag. Desuden er de berigede mikrovekler og exosomer isoleret ved blot at udfolde Exo-PAD.
Introduction
Mikrovekler og exosomer er små membran vesikler, der måler henholdsvis 0,2−1 μm og 30−200 nm. De udskilles i det ekstracellulære miljø af flere forskellige celletyper1,,2,,3,,4,,5. De indeholder forældrecelle oplysninger i form af undergrupper af DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, og cirkulerer i hele kroppen via forskellige kropsvæsker såsom serum, plasma, urin, cerebrospinalvæske, fostervand, og spyt6,7,8,9. Således kan teknikker til effektiv isolering af mikrovekler og exosomer fra biologiske væsker give omfattende muligheder inden for diagnose, prognose, og real-time overvågning af sygdom, samt i udviklingen af nye terapeutiske.
Den konventionelle isolationsmetode for mikrovesiler og exosomer baseret på ultracentrifugation er imidlertid yderst tidskrævende og medfører betydelige tab og kontaminering af prøven. Dette skyldes , at det indebærer flere besværlige pipetterings- og lastningstrin og udsmid af forskellige reagenser med gentagen ultracentrifugation5,6,10,11,12. Desuden kan den høje forskydningsbelastning forårsaget af ultracentrifugation (~100.000 x g) forårsage fysisk lysis af mikrovende stoffer og exosomer, hvilket giver dårlige restitutionsrater (5−23 %)6,13,14. Derfor skal der udvikles en yderst effektiv, diskret isolationsteknik til mikrovende stoffer og exosomer for at reducere skader og tab og derved opnå højere restitutionsrater.
En origami-papir-baseret enhed (Exo-PAD) blev udviklet til enklere, blidere, og meget effektiv isolering af mikrovekler og exosomer6. Udformningen af Exo-PAD er et flerfoldet papir med serielt forbundne prøveområder, der gradvist falder i diameter. Ionkoncentrationspolariseringsteknikken (ICP), som er et nanoelektrokinetisk fænomen, der prækoncentrerer ladede biomolekyler, blev integreret med dette unikke design. Brug af Exo-PAD resulterede i femdoblet berigelse af mikrovekler og exosomer i specifikke lag og deres isolation ved blot at folde enheden ud. Denne artikel beskriver Exo-PAD i detaljer, fra den samlede enhed fabrikation og drift til analyse af dens anvendelse, for at illustrere metoden og vise repræsentative resultater6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om Exo-PAD blev anvendt med succes til berigelse og isolering af mikrovekler og exosomer, bør flere kritiske punkter nøje overvejes: 1) ovnens inkubationstid og -temperatur under enhedens tilberedning, 2) behandlingstid, 3) påføring af spænding med varierende lagtal og prøveområdediametre og 4) anvendelighed på kliniske prøver.
Inkubationstiden og -temperaturen i protokollen er optimerede betingelser for at fremstille en pålidelig enhed. Længere inkubationstider eller en højer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee blev støttet af et forskningstilskud fra Kwangwoon University i 2019. Hyerin Kim blev støttet af “Kompetenceudviklingsprogram for branchespecialister” fra det koreanske ministerium for handel, industri og energi (MOTIE), der drives af Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program for industriel konvergens af bærbare smart-enheder).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
References
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
- Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
- Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
- Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
- Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
- Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
- Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
- Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).
