Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Pappersbaserad förkoncentration och isolering av mikrovesiklar och exosomer

doi: 10.3791/61292 Published: April 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras är ett protokoll för att tillverka en pappersbaserad enhet för effektiv anrikning och isolering av mikrovesicles och exosomer.

Abstract

Microvesicles och exosomer är små membranösa blåsor släpps till den extracellulära miljön och cirkulerade i hela kroppen. Eftersom de innehåller olika föräldracell-härledda biomolekyler såsom DNA, mRNA, miRNA, proteiner och lipider, deras anrikning och isolering är avgörande steg för deras utnyttjande som potentiella biomarkörer för kliniska tillämpningar. Konventionella isoleringsmetoder (t.ex. ultracentrifugering) orsakar dock betydande förlust och skador på mikrovesicles och exosomer. Dessa metoder kräver också flera repetitiva steg av ultracentrifugering, lastning och slöseri med reagenser. I den här artikeln beskrivs en detaljerad metod för att tillverka en origami-pappersbaserad enhet (Exo-PAD) avsedd för effektiv anrikning och isolering av mikrovesiklar och exosomer på ett enkelt sätt. Exo-PAD:s unika design, som består av dragspelsliknande multifolded-lager med konvergenta provområden, är integrerad med jonkoncentrationspolariseringstekniken, vilket möjliggör femdubbling av mikrovesiklarna och exosomer på specifika lager. Dessutom är de berikade mikrovesicles och exosomer isolerade genom att helt enkelt veckla ut Exo-PAD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrovesiklar och exosomer är små membranblåsor som mäter 0,2−1 μm respektive 30−200 nm. De utsöndras i den extracellulära miljön med flera olika celltyper1,,2,,3,,4,5. De innehåller föräldrarnas cellinformation i form av delmängder av DNA, mRNA, miRNA, proteiner och lipider, och cirkulerar i hela kroppen via olika kroppsvätskor såsom serum, plasma, urin, ryggmärgsvätska, fostervatten och saliv6,,7,,8,9. Således kan tekniker för effektiv isolering av mikrovessicles och exosomer från biologiska vätskor ge omfattande möjligheter inom områdena diagnos, prognos och realtidsövervakning av sjukdomar, samt i utvecklingen av nya terapier.

Den konventionella isoleringsmetoden för mikrovessicles och exosomer baserade på ultracentrifugering är dock extremt tidskrävande och orsakar betydande förlust och kontaminering av provet. Detta beror på att det innebär flera besvärliga pipettering och lastning steg och kasta olika reagenser med upprepade ultracentrifugering5,6,10,11,12. Dessutom kan den höga skjuvspänning som orsakas av ultracentrifugering (~100 000 x g) orsaka fysisk lys av mikrovessicles och exosomer, vilket ger dålig återhämtning (5−23%)6,13,14. Därför måste en mycket effektiv, diskret isoleringsteknik för mikrovesicles och exosomer utvecklas för att minska skador och förluster, vilket uppnår högre återvinningsgrad.

En origami-papper-baserad enhet (Exo-PAD) har utvecklats för enklare, mildare och mycket effektiv isolering av mikrovesiklar och exosomer6. Exo-PAD är ett flerfaldigt papper med seriekopplade provområden som gradvis minskar i diameter. Jonkoncentrationspolariseringstekniken (ICP), som är ett nanoelektroniskt fenomen som prekoncentrerar laddade biomolekyler, integrerades med denna unika design. Med hjälp av Exo-PAD resulterade i femfaldig anrikning av mikrovesiklar och exosomer i specifika lager och deras isolering genom att helt enkelt fälla ut enheten. I den här artikeln beskrivs Exo-PAD i detalj, från den övergripande enheten tillverkning och drift till analys av dess användning, för att illustrera metoden och visa representativa resultat6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tillverkning av anordningar

  1. Definiera den region som ska skrivas ut på papper med hjälp av skrivarprogramvara (Tabell över material).
    OBS: Konstruktionen har 12 vaxmönstrerade skikt där diametern på de cirkulära provområdena gradvis smalnar från 5 mm till 2 mm (figur 1A).
  2. Skriv ut hydrofoba vax på de angivna områdena på båda sidor av cellulosapapperet(Tabell över material)med hjälp av ett tryckerier för handelsvax (Tabell över material) ( figur1B).
  3. Placera det vaxtryckta papperet i en laboratorieugn i 80 s vid 120 °C.
    OBS: Detta steg gör det möjligt för vaxet att nå insidan av papperet genom att uppnå ett termiskt reflöde av det tryckta vaxet. Med detta inkubationsprotokoll är mönstrets upplösning ~2 mm. Var därför noga med att inte skriva ut mönster på mindre än 2 mm. Annars kommer mönstren att blockeras av vaxet.
  4. Kapa det vaxtryckta papperet med en fräs för att tillverka enskilda enheter (bild 1C).
  5. Fall 5 μL och 2 μL permselektiva membran (t.ex. Tabell över material) på provområdena i de vänstra respektive högra skikten (figur 1D).
  6. Placera lagren belagda med permselektiva membranet på en värmeplatta vid 70 °C i 30 min för att avdunsta det permselektiva membranlösningsmedlet.
  7. Täta den yttersta ytan av det belagda skiktet mot buffertlösningen med tryckkänslig tejp och lämna ett litet hål.
  8. Vik den utskrivna enskilda enheten (dvs Exo-PAD) fram och tillbaka längs de vita linjerna.
    OBS: Genom att vika enheten blir alla provområden konvergerande anslutna (bild 1E). Denna konvergent design fokuserar de elektriska fältledningarna när spänningen appliceras för ICP, vilket uppnår en mer intensiv förkoncentration av mikrovesiklar och exosomer.

2. Berikande och rumslig fokusering av mikrovesicles och exosomer genom jonkoncentration polarisering

  1. Belastning 15 μL av mikrovessicle och exosomprov (~3 x 1011 partiklar/ml i 0,1 x fosfatbuffertad koksaltlösning [PBS] med 0,05 % Tween 20) i de konvergerande provområdena genom pipettering och vänta några sekunder för att säkerställa fullständig vätning av alla provområden(figur 1F).
  2. Placera två akrylkammare i båda ändar av Exo-PAD och kläm fast Exo-PAD säkert med små bindemedelsklämmor för att förhindra utfällning (bild 1G).
  3. Fyll kamrarna med 110 μL 0,1 x PBS och sätt in två Ag/AgCl-elektroder (figur 1H).
  4. Applicera 30 V på elektroderna i 20 min med hjälp av ett mätsystem för strömspänningskälla (Tabell över material).
    OBS: Den applicerade spänningen genererar ICP-fenomenet och förkoncentrerar därmed mikrovesiklarna och exosomer på skikten 8 och 9 i Exo-PAD.

3. Isolering av berikade mikrovesicles och exosomer

  1. Separera den vikta Exo-PAD från akrylkamrarna och fäll ut enheten för att isolera de berikade mikrovesierna och exosomer från de andra skikten (figur 1I).
  2. Stansa ut provområdena i lager 8 och 9, där mikrovessiler och exosomer berikas, för nedströmsanalys (figur 1J).

4. Analys av elektronmikroskopi

  1. Fixa de berikade mikrovesierna och exosomer genom att doppa stansade områden i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate buffert för 1 h och i 1% osmium tetroxid i 0,1 M natriumkakedi i 1 h.
    VARNING: Osmium tetroxid är mycket giftig och farlig kemikalie. Eftersom osmiumtetroxid kan tränga in i plast, måste den förvaras i glas. All hantering av osmiumtetroxid måste utföras i en kemisk rökhuva med dubbla nitrilhandskar.
  2. Torka de fasta mikrovesiklarna och exosomer med stigande kvaliteter på 200 bevis etanol (dvs. 50%, 70%, 90% och 100%) i 30 min vardera.
  3. Torka provet kemiskt genom att doppa det i hexametyldisilazane i en exsickator i 30 minuter.
    VARNING: Hexametyldisilazan är en brandfarlig och fuktkänslig kemikalie. Den måste förvaras i ett torrt och välventilerat område på avstånd från antändningskällor.
  4. Täck de helt torkade mikrovesiklarna och exosomer med guld/palladium (~20 nm) via sputtering- och capture scanning electron-mikroskopi (SEM) bilder.

5. Analys av spårning av nanopartiklar

  1. Stämpla ut provområdena i lager 6, 8 och 10 med hjälp av en biopsistan efter 20 minuters enhetsdrift.
  2. Sänk ned varje stansat område i buffertlösning (0,1 x PBS med 0,01 % Tween 20).
  3. Vortex för 10 min och centrifug för 30 s vid 6000 rpm för att återanvända de berikade mikrovesierna och exosomer.
  4. Ta bort stansade områden från lösningen och mäta koncentrationen av mikrovesnor och exosomer genom en nanopartikel spårning analys (NTA) instrument (Tabell över material).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Drifttiden måste optimeras för att uppnå maximal återhämtningsutbyte för de berikade mikrovesierna och exosomer. Otillräcklig tid tillåter inte tillräcklig migration av mikrovesiklar och exosomer, vilket minskar anrikningen, medan överdriven tid försämrar den rumsliga fokuseringen och därmed sprider mikrovesiklar och exosomer. Således, genom tid optimering steg, den maximala preconcentration faktor av mikrovesicles och exosomer och den slutliga platsen där mikrovesicles och exosomer är mest berikade kan identifieras. För att hitta den slutliga platsen för mikrovesiklar och exosomer, time-lapse migration av fluorescerande märkta mikrovesiklar och exosomer observerades med ett mikroskop (figur 2A) och fluorescensintensiteter i alla provområden kvantifierades med ImageJ programvara (figur 2B). Före anrikningsprocessen (figur 2A, 0 min) skingrades mikrovesicles och exosomer i alla provområden med en gradvis minskning av intensiteten på grund av pappersmatrisens ringa filtreringsverkan (figur 2B, 0 min). Efter 10 min bearbetning (Figur 2A, 10 min), mikrovesicles och exosomer migrerade elektrokinetiskt och en omedelbar förkoncentrationsplugg dök upp på lager 7. Ytterligare bearbetning uppnått större preconcentration av microvesicles och exosomer. När processtiden nådde 20 minuter var mikrovesicles och exosomer starkt inriktade på skikten 8 och 9 (figur 2A,20 min) och berikade femfaldigt, baserat på fluorescensintensiteterna (figur 2B, 20 min).

Efter avslutad preconcentration processen, de berikade microvesicles och exosomer isolerades genom att fälla ut enheten och provet området i lager 8 stansades ut för vidare analys. SEM bilder erhölls för att undersöka integriteten hos berikade microvesicles och exosomer. Som visas i SEM-bilderna (figur 3A) observerades signifikant mer icke-beskadade mikrovesicles och exosomer efter anrikningsprocessen. Med hjälp av de erhållna SEM-bilderna analyserades storleksfördelningen av de berikade mikrovesierna och exosomer (figur 3B), där exosomer och mikrovesicles var framstående baserat på en tröskeldiameter på 200 nm. Med andra ord varierade storleken på exosomer från 95–195 nm med en medeldiameter på 134 nm och mikrovesiklarnas storlek från 214–377 nm med en medeldiameter på 315 nm.

Därefter analyserades den faktiska koncentrationen av de berikade mikrovesiclesna och exosomer på provområdena i lagrar 6, 8 och 10 av NTA. Före anrikning var koncentrationen ~2,24 x 1011 partiklar/ml i skikt 8 (Figur 3C, skikt 8). Efter anrikning var koncentrationen ~1,25 x 1012 partiklar/ml i skikt 8 (Figur 3C, skikt 8), vilket indikerar att mikrovesiklar och exosomer var preconcentrated med en faktor ~5.58. Märkbar prekoncentration observerades inte på de andra skikten (figur 3C,skikt 6 och 10). Sammantaget visar dessa resultat att den föreslagna pappersbaserade enheten kan berika mikrovesicles och exosomer med ungefär femfaldigt.

Enhetens isoleringseffektivitet utvärderades på följande sätt: Provvolymen som kan rymmas av lager 8 och 9 är ~2,2 μL av totalt 15 μL provvolym i 10 lager på grund av Exo-PAD:s förträngningsdesign. Om vi antar ett idealiskt fall där alla mikrovesiklar och exosomer är förkoncentrerade på skikt 8 och 9 och ingen går förlorade, bör den idealiska förkoncentrationsfaktorn vara ~6,8 (15 μL/2,2 μL = ~6,8). Den experimentella preconcentrationsfaktorn som erhållits av NTA (figur 3c) var dock ~5,58, vilket innebär att en del av 1,22 mikrovesiklar och exosomer förlorades genom lys eller ospecificerad bindning till pappersmatrisen.
Equation 1
där 2,24 x 1012 partiklar/ml är den initiala koncentrationen av mikrovesicles och exosomer. Från denna beräkning är den förväntade förlusthastigheten för Exo-PAD ca 18%; isoleringseffektiviteten är därför cirka 82 %. Detta är en betydande förbättring jämfört med den dåliga avkastningen av ultracentrifugering (5%-23%).

Figure 1
Figur 1: Övergripande Exo-PAD-procedurer, från montering till drift. (A)Programvarudesign för att styra tryckningen av hydrofoba vax på cellulosapapper. (B)Det vaxtryckta papperet efter inkubation i en ugn i 80 s vid 120 °C. (C)De enskilda enheterna skärs ut med en fräs. D)Permselektiva membranlösningen tappas på provområdena i de vänstra och högra skikten och lösningsmedlet avdunstar på en kokplatta vid 70 °C i 30 min.(E)Den tryckta Exo-PADen viks fram och tillbaka längs de vita linjerna. alla urvalsområden är därmed konvergerande anslutna. F)Ett mikrovestikel- och exosomprov lastas i provområdet. (G)Två akrylkammare placeras i ändarna av enheten och säkras med små bindemedelsklämmor. H)Akrylkamrarna är fyllda med buffertlösning och två Ag/AgCl-elektroder sätts in för att applicera en spänning på 30 V.(I)Enheten är uppfälld för att isolera de förkoncentrerade mikrovesierna och exosomer. j)Provområdena i skikten 8 och 9 stansas ut för analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Observation av fluorescerande märkta mikrovessiklar och exosomer under anordningens drift och motsvarande fluorescensintensiteter. (A)Time-lapse observation av mikrovesicles och exosomer. Skalans stång = 5 mm. Med 20 min bearbetning var mikrovesicles och exosomer starkt inriktade på lager 8 och 9, där (B) de berikades av ungefär femfaldigt. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Analys av de berikade mikrovesierna och exosomer. (A)SEM-bilder som visar integriteten hos de berikade mikrovesierna och exosomer. Efter prekoncentrering observerades många fler mikrovesicles och exosomer6. Skalbar = 1 μm. ( B)Storleksfördelning av de berikade mikrovesicles och exosomer. Exosomen storleksanpassar var 95−195 nm (genomsnittlig diameter = 134 nm) och microvesicle storleksanpassar var 214−377 nm (genomsnittlig diameter = 315 nm). CCDen faktiska koncentrationen av de berikade mikrovesierna och exosomer som utvärderats med hjälp av NTA. Efter berikning ökade koncentrationen av mikrovesslar och exosomer femfaldigt, vilket är förenligt med fluorescensresultat6. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3). Panelerna A och C reproduceras med tillstånd från Kim et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tilläggsbild 1: Mikrovesiklar och exosomer förkoncentrerade och fokuserade på lager 8 separerades från bovin serum albumin (BSA), som stannade i lager 1-3. Klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Även om Exo-PAD användes framgångsrikt för anrikning och isolering av mikrovessicles och exosomer, bör flera kritiska punkter noga övervägas: 1) ugnen inkubationstid och temperatur under enheten beredning, 2) bearbetningstid, 3) tillämpning av spänning med varierande skikt nummer och prov områdesdiametrar, och 4) tillämplighet på kliniska prover.

Inkubationstiden och temperaturen som anges i protokollet är optimerade förhållanden för att tillverka en tillförlitlig enhet. Längre inkubationstider eller högre temperatur kan orsaka förvrängning av den konvergenta konstruktionen på grund av det tryckta vaxets överdrivna reflöde. Detta kommer att förhindra bildandet av fokuserade elektriska fältlinjer och därmed öka migrationsmotståndet under den elektromagnetiska anrikningsprocessen.

Bearbetningstid är också en faktor att tänka på för maximal anrikning och isolering. En bearbetningstid på <20 min resulterar i mindre förkoncentration eftersom det inte finns tillräckligt med tid för att tillåta mikrovesicle och exosommigrering. Å andra sidan försämrar en bearbetningstid på >20 min fokuseringens effektivitet och möjliggör spridning av de berikade mikrovesikerna och exosomer. Enligt detta test är 20 min den bästa bearbetningstiden för att uppnå maximal anrikning och isolering av mikrovesicles och exosomer.

Den applicerade spänningen är en annan viktig faktor att tänka på. Med tanke på antalet lager och provområdesdiametrarna används i detta protokoll 30 V för att uppnå en stabil förkoncentration och isolering. När ett ICP-fenomen genereras i enheten kan driftssystemet delas in i tre olika regioner enligt den tillämpade spänningen: (1) ohmic, (2) begränsande och (3) överbegränsande regioner6,,15,16. För stabil prekoncentration och isolering bör anordningen användas i det begränsande området, där en jonutarmningszon genereras och mikrovesmier och exosomer är stabilt förkoncentrerade. I denna experimentella inställning motsvarar driftspänningsområdet (5−40 V) den begränsande regionen för Exo-PAD. Om den applicerade spänningen är <5 V, arbetar enheten i ohmic regionen, där den elektriska strömmen ökar linjärt, vilket indikerar att ingen jonutarmning region genereras för preconcentration. Men om spänningen är >40 V, förstörs jonutarmningsområdet av stark spänningsdriven elektrokonvektion, som destabiliserar förkoncentrationen. Med tanke på dessa faktorer fastställdes det att 30 V var den optimala spänningen att använda för en enhet med 12 lager och en provområdesdiameter på 2−5 mm. Lagernummer eller provområdesdiametrar kan ökas för att förstora provvolymen, men dessa faktorer, liksom driftspänningen, bör optimeras för att uppnå stabil anrikning av mikrovesnor och exosomer.

Den föreslagna Exo-PAD kan användas för att isolera mikrovesicles och exosomer från olika kliniska prover, inklusive saliv, urin, serum och plasma. För prover med mindre protein, såsom saliv eller urin, kan mikrovesmier och exosomer lätt isoleras utan större förändringar, eftersom en liten mängd protein i dessa prover kommer att filtreras ut genom ospecificerad bindning till papperet. Vid användning av enheten inom det begränsande området behöver endast den applicerade spänningen beaktas, eftersom provernas joniska styrka kan vara annorlunda. För proteinrika prover, såsom serum eller plasma, bör både förkoncentration av mikrovesiklar och exosomer och deras separation från rikliga proteiner noga övervägas. Vårt senaste experiment visar att separation av mikrovesmier och exosomer från proteiner förbättras avsevärt när karbonatbuffert används, eftersom karbonatbuffert resulterar i en högre elektrisk laddningsskillnad mellan mikrovesmier och exosomer och protein på grund av den isoelektriska punkten, vilket resulterar i bättre separationseffektivitet. För detta experiment, ett ämne med rikliga proteiner samexistera med mikrovesicles och exosomer härmades genom att blanda renade mikrovesicles och exosomer märkta med FITC (Ex / Em: 490/520 nm) med BSA märkt med en annan fluorofore (Ex / Em: 590/617 nm) i 50 mM karbonat buffert (Tabell of Materials). Som framgår av tilläggsbild 1var de flesta mikrovesslar och exosomer förkoncentrerade på skikt 8, som i figur 2A och de separerades från BSA, som stannade i lager 1–3. Detta resultat tyder på att anrikning från ett serum eller plasmaprov kräver ytterligare ett steg tillsätta karbonat buffert till provet, och tydligt visar att Exo-PAD kan rena mikrovesiklar och exosomer från rikliga proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee fick stöd av ett forskningsanslag från Kwangwoon University 2019. Hyerin Kim stöddes av "Kompetensutvecklingsprogrammet för industrispecialister" vid det koreanska ministeriet för handel, industri och energi (MOTIE), som drivs av Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program för industriell konvergens av bärbara smarta enheter).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14, (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17, (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes - vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21, (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34, (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19, (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200, (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11, (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39, (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18, (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91, (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16, (5), 925-931 (2016).
Pappersbaserad förkoncentration och isolering av mikrovesiklar och exosomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).More

Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter