Summary
Presentert her er en protokoll for bestemmelse av oligomerisk tilstand av membranproteiner som benytter et innfødt cellemembran nanopartikkelsystem i forbindelse med elektronmikroskopi.
Abstract
Protein-protein interaksjoner i cellemembransystemer spiller avgjørende roller i et bredt spekter av biologiske prosesser- fra celle-til-celle interaksjoner for å signalisere transduksjon; fra sensing miljøsignaler til biologisk respons; fra metabolsk regulering til utviklingskontroll. Nøyaktig strukturell informasjon om protein-protein interaksjoner er avgjørende for å forstå molekylære mekanismer av membran protein komplekser og for utformingen av svært spesifikke molekyler for å modulere disse proteinene. Mange in vivo- og in vitro-tilnærminger er utviklet for påvisning og analyse av protein-proteininteraksjoner. Blant dem er den strukturelle biologitilnærmingen unik ved at den kan gi direkte strukturell informasjon om protein-proteininteraksjoner på atomnivå. Imidlertid er dagens membranproteinstrukturell biologi fortsatt i stor grad begrenset til vaskemiddelbaserte metoder. Den store ulempen med vaskemiddelbaserte metoder er at de ofte dissosierer eller denatur membranproteinkomplekser når deres innfødte lipid bilayer miljø er fjernet av vaskemiddelmolekyler. Vi har utviklet et innfødt cellemembran nanopartikkelsystem for membranproteinstrukturell biologi. Her demonstrerer vi bruken av dette systemet i analysen av protein-proteininteraksjoner på cellemembranen med en case-studie av den oligomeriske tilstanden acrb.
Introduction
Protein-protein interaksjoner (PPI) spille avgjørende roller i hele biologi, fra vedlikehold av strukturen og funksjonen av proteiner til regulering av hele systemer. PPIer kommer i mange forskjellige former og kan kategoriseres basert på hvilke typer samhandlinger de danner. En slik kategorisering er homooligomerisk eller heterooligomerisk, basert på om interaksjonene er mellom identiske underenheter eller forskjellige proteiner som fungerer som underenheter. En annen kategorisering er basert på styrken av samspillet hvis interaksjonene fører til dannelse av stabile komplekser eller forbigående komplekse tilstander. Strukturell informasjon om PPIer mellom proteiner er avgjørende for å forstå mekanismen som proteiner utfører sin funksjon. Det har blitt anslått at over 80% av proteinene er avhengige av kompleks dannelse for å utføre sine funksjonelle roller1. Gitt prosentandelen av proteiner observert å være avhengig av PPI for riktig medfødt funksjon deres betydning i biologi er lett tydelig, men å kunne undersøke proteinene som engasjerer seg i disse interaksjonene har vært utfordrende på grunn av begrensninger i teknikkene som er tilgjengelige for å eksperimentelt observere når proteiner danner PPIer.
Det er en høy grad av uenighet mellom resultatene for mange eksperimentelt bestemte PPIer på grunn av den høye mengden støy, falske positiver og falske negativer som er avledet fra mange av de tilgjengelige PPI-bestemmeteknikkene. Dette er spesielt så for gjær to-hybrid (Y2H) system, tandem affinitet rensing-masse spektrometri (TAP-MS), og fluorescens resonans energioverføring (FRET), som representerer tre av de mest brukte metodene for PPI bestemmelse2,3,4,5,6,7. Til sammenligning kan proteinstrukturelle biologiteknikker, som kjernemagnetisk resonans (NMR), røntgenkrystallografi og elektronmikroskopi (EM), brukes til å få høyoppløsnings strukturell informasjon om proteinproteininteraksjoner ned til atomnivået og tillate direkte visuell bekreftelse av interaksjonene som oppstår for et målprotein av interesse. Alle tilgjengelige ikke-strukturbaserte PPI-bestemmende forskningsteknikker (f.eks. Y2H, TAP-MS og FRET) mangler denne evnen og lider i tillegg av problemer med å identifisere svake og forbigående interaksjoner mellom proteiner5. Disse manglene forsterkes ytterligere når man studerer membranproteiner på grunn av den ekstra kompleksiteten forårsaket av den ekstra variabelen av lipidmiljøet som påvirker dannelsen av riktig kvartær struktur og heteromerisk kompleks montering.
Membranproteiner utgjør en stor del av proteomet og er kjent for å spille mange avgjørende roller i riktig cellefunksjon i alle levende organismer. Til tross for at membranproteiner anslås å utgjøre 27% av det menneskelige genomet og utgjør ~ 60% av alle nåværende legemiddelmål, er det en stor anomali i antall løste modeller for membranproteiner som bare utgjør ~ 2,2% av alle publiserte proteinstrukturer8,9,10. Den primære årsaken til avviket i tilgjengeligheten av strukturell informasjon ligger i de indre egenskapene til membranproteiner selv. På grunn av deres dårlige løselighet, avhengighet av interaksjoner med et lipidmiljø for å opprettholde innfødt struktur og funksjon, og ulike fysikalske egenskaper av lipidmembranen selv, fortsetter membranproteiner å representere et betydelig problem når de implementerer strukturelle biologiteknikker for å studere dem. Av disse iboende egenskapene er det viktigste for å oppnå nøyaktig strukturell informasjon kravet om å ha interaksjoner med deres naturlige lipidmiljø for dem å opprettholde sin opprinnelige struktur og funksjon. Lipidmiljøet er en så integrert del av strukturen og funksjonen til membranproteiner at begrepet memtein (en kombinasjon av ordene membran og protein) har blitt foreslått som den grunnleggende enheten av membran-proteinstruktur ogfunksjon 11. Til tross for viktigheten av lipid-protein interaksjoner den tilgjengelige strukturbaserte PPI bestemmelse teknikker krever ofte at proteiner som studeres være løselig eller løses med vaskemidler. Eksponering for harde vaskemidler kan fornedre proteinene eller forårsake falske positiver og negativer på grunn av delipidering, noe som kan indusere aggregering, denning av protein, dissosiasjon av ikke-kovalente interaksjoner og dannelse av kunstige oligomeriske tilstander. På grunn av nødvendigheten av å opprettholde et naturlig lipidmiljø for nøyaktig bestemmelse av den opprinnelige oligomeriske tilstanden til membranproteiner har vi utviklet et native cell membran nanopartikler system (NCMNs)12 basert på tidligere rapporterte Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 metode.
SMALP bruker styrenmalsyrekopolymer som en membranaktiv polymer for å trekke ut og løse membranproteiner. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) er en unik amfifil polymer på grunn av sin hydrofobe styrenmoety og diametralt motstridende hydrofile malesyremoaety. Det danner nanopartikler ved å adsorbere til, destabilisere og forstyrre cellemembranen i en pH-avhengigmekanisme 14. Denne funksjonelle aktiviteten til SMA er det som gjør at den kan brukes som et vaskemiddelfritt system for membranproteinutvinning og solubilisering. NCMN-systemet skiller seg fra SMALP-systemet i flere aspekter. Det mest unike ved NCMN-systemet er at det har et membran aktivt polymerbibliotek med en rekke polymerer som har unike egenskaper som gjør dem egnet for isolering av mange forskjellige membranproteiner som krever forskjellige forhold for stabilitet og innfødt funksjon. NCMN-systemet har også forskjellige protokoller sammenlignet med SMALP-metoden når det gjelder å forberede nanopartiklene. Et slikt eksempel er at NCMNer bruker en etttrinns nikkel affinitet kolonne rensing for høyoppløselig struktur bestemmelse; effekten av disse forskjellige protokollene kan observeres når man sammenligner NCMNs-protokollen, som genererte 3.2 og 3.0 Å cryo-EM AcrB strukturer, med en lignende studie ved hjelp av SMALP-metoden, som resulterte i en cryo-EM AcrB struktur på en 8,8 Å oppløsning12,15. Disse unike egenskapene til NCMN-systemet er forbedringene som er gjort på den tidligere etablerte SMALP-metoden og gjør den til en ideell kandidat for studiet av PPIer.
Multidrug efflux transporter AcrB eksisterer som funksjonell homotrimer i E. coli12. En mutagent analyse antydet at en enkelt P223G-punktmutasjon, som ligger på en løkke som er ansvarlig for stabiliteten til AcrB-trimeren, destabiliserer trimertilstanden og gir en AcrB-monomer når den er tilberedt med vaskemiddelet DDM, som kan oppdages med innfødt blå gelelektroforese16. Imidlertid foreslo FRET-analysen av AcrB-P223G mutert at når de var i det innfødte cellemembranen lipid bilayer-miljøet, eksisterte flertallet av mutert AcrB-P223G fortsatt som en trimer, og at uttrykksnivåene for både villtype AcrB og AcrB-P223G er like. Men til tross for FRET-analyseresultatene viste en aktivitetsanalyse for mutanttransportøren at aktiviteten gikk dramatisk ned sammenlignet med villtype16. Selv om FRET-teknologi har blitt populært brukt til analyse av protein-protein interaksjoner, forskning har vist at det ofte kan gi falskepositiver 17,18,19,20.
Nylig ble høyoppløselige cryo-EM strukturer av AcrB trimer bestemt som viste samspillet mellom AcrB med sin tilknyttede innfødte cellemembran lipid bilayer gjennom bruk av NCMNs12. I prinsippet kan NCMNer lett benyttes til analyse av protein-protein interaksjoner som finnes på den innfødte cellemembranen. I en test av dette systemet ble eksperimenter utført for å observere den oligomeriske tilstanden acrB-P223G ved bruk av innfødte cellemembrannanopartikler og negativ farging elektronmikroskopi. For å sammenligne med den ville typen AcrB nanopartikler, brukte vi den samme membranaktiv polymer (SMA2000 laget i vårt laboratorium, som er indeksert som NCMNP1-1 i NCMN-biblioteket) som brukes til høyoppløselig kryo-EM strukturbestemmelse av AcrB og alternative polymerer som finnes i NCMNs bibliotek12. Basert på tidligere rapporterte resultater, var det forventet at flertallet av AcrB-P223G mutant ville eksistere i form av trimeric innfødte celle membran nanopartikler21. Imidlertid ble ingen AcrB trimere funnet til stede i prøven, for eksempel de som ble observert med den ville typen AcrB. Dette tyder på at flertallet av AcrB-P223G ikke danner trimere på den innfødte cellemembranen som tidligere antydet.
Her rapporterer vi en detaljert analyse av mutant E. coli AcrB-P223G i en sammenligning med villtypen E. coli AcrB ved hjelp av NCMNs. Denne case-studien av AcrB antyder at NCMNer er et godt system for protein-proteininteraksjonsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinuttrykk
- Inokuler 15 ml Terrific Broth (TB) medier med antibiotika som er spesifikke for plasmider med BL21 (DE3) pLysS-celler som inneholder AcrB som uttrykker plasmider i 50 ml rør over natten ved 37 °C med risting ved 250 o/min.
- Kontroller den optiske tettheten til overnattingskulturen ved 600 nm (OD600) og kontroller at den er over 2,0.
- Fortynn 5 ml cellekultur i 1 L TB-medier som inneholder antibiotika som er spesifikke for plasmider og inkuber ved 37 °C med risting til OD600=0,8 og deretter indusere med IPTG som har en endelig konsentrasjon på 1 mM.
- Utfør induksjon ved 20 °C med risting i 20 timer.
- Pellet ned cellene ved hjelp av sentrifugering i 15 min ved 4 °C og 4000 x g.
2. Cellelysis og membranisolering
- Bruk DDM Buffer A eller NCMNs Buffer A på nyttavhengig av renseordningen som skal følges) ved hjelp av 80 ml for hver 20 g cellepellet.
- Homogenisere de resuspended celle pellets ved hjelp av et glass Dounce homogenisator ved 4 ° C eller hvis ved romtemperatur sørg for å sette på is umiddelbart etter.
- Overfør prøven til et metallbeger på is og lyse cellene ved å laste dem inn i en høytrykks homogenisator ved 4 ° C og 1500 bar.
- Gjenta prosessen med å laste cellene inn i homogenisatoren og la dem passere gjennom homogenisatoren i 3-4 sykluser eller til lysatet begynner å avklare.
- Sentrifuger lysatet ved 15 000 x g i 30 min ved 4 °C.
- Samle supernatant og last inn i ultracentrifuge rør og sentrifuge på 215.000 x g for 1 t ved 4 °C.
- Kast det overnaturlige og samle membranen pellets fra ultracentrifuge rørene. Oppbevar overflødig membranpellet ved -80 °C.
3. Utarbeidelse av innfødte cellemembran nanopartikler
- Resuspend 1 g membranpellet i 10 ml NCMNs Buffer A (tabell 1).
- Homogenisere den resuspended cellemembran prøven med et glass Dounce homogenisator ved 20 °C.
- Overfør den suspenderte membranprøven til et 50 ml polypropylenrør og tilsett membranaktiv polymerlagerløsning og ekstra NCMNs Buffer A for å bringe prøven til en endelig konsentrasjon på 2,5 % (w/v) membranaktiv polymer (NCMNP1-1 eller NCMNP5-2).
MERK: Lagerløsninger av membranaktive polymerer bør gjøres i dobbelt destillert vann og kan oppbevares ved varierende konsentrasjoner, men vanligvis 10% (m / v). - Rist prøven i 2 timer ved 20 °C.
- Legg prøven i en ultracentrifuge og spinn på 150.000 x g for 1 t ved 20 °C.
- Mens prøven blir ultra-sentrifugert begynner å likevekte en 5 ml Ni-NTA kolonne med 25 ml NCMNs Buffer A.
- Samle supernatant etter ultracentrifugation er fullført og laste den på 5 ml Ni-NTA kolonne ved romtemperatur med en strømningshastighet på 0,5 ml / min ved hjelp av en sprøytepumpe.
- Vask raske proteinvæskekromatografilinjer (FPLC) med nok NCMNs Buffer B (tabell 1) til å tømme systemet helt og deretter koble kolonnen til FPLC-maskinen.
- Vask kolonnen med 30 ml NCMNs Buffer B med en strømningshastighet på 1 ml/min og samle gjennom strømmen.
- Vask kolonnen med 30 ml NCMNs buffer C (tabell 1) med en strømningshastighet på 1 ml/min og samle gjennom strømmen.
- Elute proteinet med 20 ml NCMNs Buffer D (Tabell 1) med en strømningshastighet på 0,5 ml / min og samle prøven ved hjelp av en brøk samler og brøkene hver blir satt til 1,0 ml.
- Oppbevar proteinprøvene ved 4 °C.
- Kjør en SDS-PAGE gelelektroforeseanalyse for å kontrollere prøvene som tilsvarer topper observert på FPLC-elutiongrafen.
4. SDS-SIDE gel elektroforese
- Forbered støpekammeret ved å klemme glasset til støpeapparatet.
- Forbered 12% separasjongel i henhold til oppskriften som er oppført i tabell 1.
MERK: Når TEMED er lagt til, vil gelen polymerisere raskt, så bare legg til denne en gang klar til å helle gelen. - Hell gelen, og la 2 cm under bunnen av kammen for stablingsgelen.
- Fjern eventuelle bobler ved å legge toppen av gelen på lag med 100% isopropanol og vent på at separasjonsgelen skal polymerisere.
- Fjern isopropanol og vask ut eventuelle spor av isopropanol med destillert vann.
- Forbered stablinggelen i henhold til oppskriften som er oppført i tabell 1.
MERK: Når TEMED er lagt til, vil gelen polymerisere raskt, så bare legg til denne en gang klar til å helle gelen. - Hell stablinggelen på toppen av separasjonsgelen.
- Legg til en kam i kammeret for å danne brønnene og vent på at stablingsgelen skal polymeriseres helt.
- Plasser 1 μL på 1 M DTT i et mikrocentrifugerør for hver brøkprøve som må kjøres på gelen.
- Tilsett 7 μL 4x lastbuffer til hvert rør også.
- Tilsett 20 μL prøve fra brøkene som må kjøres på gelen til hvert mikrocentrifugerør.
- Vortex rørene som inneholder prøvene.
- Spinn ned prøverørene ved hjelp av en bordplate mikrocentrifuge for 3 s og sørg for at alle prøven har returnert til bunnen av rørene.
- Forbered gelelektroforesecellen ved å feste en 12% polyakrylamidgelkassett på plass og fylle de indre og ytre kamrene i cellen med Tris-acetat-EDTA (TAE) Buffer (tabell 1).
- Legg den molekylære vektmarkøren inn i den første banen på gelen med riktig volum som kreves av instruksjonene.
- Legg 28 μL av prøven fra hvert rør blandet med DTT og lastbuffer.
- Plasser lokket på elektroforesecellen oppå esken og koble lokket til strømforsyningen.
- Slå på strømforsyningen og sett den til 100 V og la den kjøre i 20 min.
- Etter 20 min, øk strømforsyningsstrømmen til 140 V og fortsett å kjøre den i ytterligere 30-40 min eller til lastebufferfargestoffet når bunnen av gelkassetten.
- Etter å ha fullført elektroforeseflekken og de-flekk gelen for å visualisere proteinbåndene i gelen.
5. Proteinrensing ved hjelp av DDM
MERK: Formålet med å utføre denne renseprosessen er å tjene som en kontroll for eksperimentene som bruker membranaktive polymerer.
- Resuspend 6-10 g membranpellet, fra trinn 2.6, i DDM Buffer A (tabell 1) ved hjelp av 5 ml/g membranpellet.
- Homogenisere den gjenbrukte prøven med et glass Dounce homogenisator ved 4 °C, eller hvis ved romtemperatur må du sørge for å sette på is umiddelbart etterpå.
- Overfør prøven til en 50 ml polypropylenrør og tilsett DDM og ekstra DDM Buffer A for å bringe prøven til en endelig konsentrasjon på 2% DDM.
- Rist prøven i 2 timer ved 4 °C.
- Last prøven i ultracentrifuge rør og sentrifuge i 1 t ved 4 °C og 150 000 x g.
- Mens prøven blir ultra-sentrifugert begynner å forberede 5 ml Ni-NTA kolonne ved å vaske med 25 ml DDM Buffer A (Tabell 1).
- Etter at ultracentrifugation er fullført, samle supernatant og laste den på 5 ml Ni-NTA kolonne ved 4 ° C med en strømningshastighet på 0,5 ml / min ved hjelp av en sprøytepumpe.
- Vask FPLC-linjer med nok DDM Buffer B + 0,05% DDM (tabell 1) til å tømme systemet helt og deretter feste kolonnen til FPLC-maskinen.
- Vask kolonnen med 30 ml DDM Buffer B + 0,05% DDM med en strømningshastighet på 1 ml / min og samle strømmen gjennom.
- Vask kolonnen med 30 ml DDM Buffer C + 0,05% DDM (tabell 1) med en strømningshastighet på 1 ml / min og samle strømmen gjennom.
- Elute proteinet med 20 ml DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tabell 1) med en strømningshastighet på 0,5 ml / min og samle strømmen gjennom ved hjelp av en brøkdel samler og brøkene hver blir satt til 1,0 ml.
- Velg brøkene som inneholder elutiontoppen for pooling og konsentrasjon ved hjelp av en sentrifugalkonsentrator og sentrifuging ved 4000 x g og 4 °C til den når 500 μL.
- Bruk en 500 μL sløyfe last prøven inn i FPLC-maskinen og deretter på 25 ml størrelse ekskluderingskolonnen ved 4 °C. Elute ved hjelp av 30 ml DDM Buffer E + 0,05% DDM (tabell 1) med en strømningshastighet på 0,5 ml/min og samle som brøker med brøkstørrelsene satt til å være 0,5 ml per en brøkdel.
- Ta fraksjonene og mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av 280 nm absorbans for å bekrefte UV-Vis-kurven fra FPLC-elutiongrafen.
- Samle 20 μL fra hver prøvefraksjon som tilsvarer topper observert på FPLC elution grafen og ble bekreftet å være nøyaktig med absorbanstesten.
- Frys resten av disse prøvefraksjonene ved hjelp av flytende nitrogen eller tørris i ønskede aliquots og lagre proteinprøver ved -80 °C.
- Kjør en SDS-PAGE gelelektroforeseanalyse som tidligere beskrevet for å kontrollere prøvene som tilsvarer topper observert på FPLC elution grafen.
6. Negativ flekk rutenett forberedelse
- Plasser gitter som skal brukes til prøveforberedelsen på et glasssklie innpakket i filterpapir med karbonsiden vendt opp.
- Plasser glasssklie med elektronmikroskopgitteret i kammeret til en glødeutladningsbryter mellom de to elektrodene og sett på glasslokket og sett på at det er sentrert og godt forseglet.
- Kjør den glødende utladningsmaskinen og kontroller at det lilla lyset som genereres av plasmaet er synlig.
- Når maskinen er ferdig i gang, vent til kammeret har nådd atmosfærisk trykk for å fjerne glasslokket og deretter returnere lysbildet med gitteret til benken hvor prøvene skal lastes på dem.
- Juster konsentrasjonen av de rensede proteinprøvene til ca. 0,1 mg/ml ved enten å fortynne prøven med riktig buffer eller konsentrere seg ved hjelp av en sentrifugalkonsentrator.
- Legg 3,5 μL proteinprøve på det 10 nm tykke karbongitteret og vent i 1 min.
- Fjern væsken fra overflaten av EM-gitteret med et filterpapir.
- Vask gitteroverflaten 3x ved å plukke opp 3 μL dråper vann med gitteret og fjerne vannet fra gitteret med filterpapir mellom å plukke opp hver dråpe.
- Vask gitteroverflaten 2x ved å plukke opp 3 μL dråper fersk, filtrert 2% uranacetat og fjern vaskeløsningene på gitteret med filterpapir mellom å plukke opp hver dråpe.
- Beis gitteret med en 3 μL dråpe fersk, filtrert 2% uranacetat i 1 min.
- Fjern uranacetatoppløsningen på overflaten av EM-gitteret med filterpapir og lufttørking av gitteret i minst 1 min.
- Lagre rutenettet i en rutenettboks for senere bruk.
7. EM-avbildning
- Legg det preparerte gitteret inn i gitterholderen på en sikker arbeidsbenk.
- Forbered mikroskopet ved å plassere mikroskopene dewar i en polystyren boks og fylle krigen 3/4th full av flytende nitrogen.
- Bekreft at gummidekselet på mikroskopvinduet dekker det, og legg deretter krigen på mikroskopet ved å plassere kobberledningene i krigen til det passer på plattformen.
- Fyll resten av krigen med flytende nitrogen og legg en hette på toppen av krigen for å dekke den.
- Slå på den høye spenningen, tilstand mikroskopet, og vent på mikroskopet å varme opp og etablere et trygt vakuumnivå for bruk.
- Når mikroskopet er klart, åpne kolonneventilen og bekreft at strålen er til stede ved å fjerne gummidekselet på mikroskopvinduet.
- Kontroller strålestigmasjonen ved å spre seg inn og ut ved å justere intensiteten på strålen. Hvis astigmatisme er til stede, vil strålen ha en elliptisk form når man beveger seg bort fra cross-over og strålen skal være den samme ovale formen på begge sider.
- Juster mikroskopet kikkerten for å være riktig høyde og avstand i henhold til observatørens øyne.
- Kontroller stråleposisjoneringen for søke-, fokus- og eksponeringsmoduser ved å sykle gjennom alle tre modusene til strålen er midt i hver.
- Lukk kolonneventilen og fortsett å laste gitterholderen inn i elektronmikroskopet.
- Juster mikroskopet til eusentrisk høyde ved hjelp av mikroskop wobbler-funksjonen og justere bevegelsen av scenen ved hjelp av Z-aksen til det ikke er noen side-til-side bevegelse av prøven i midten.
- Ved hjelp av lav dose Søkemodus på mikroskopet søke rutenettet for et ønskelig område av rimelig kontrast med prøvemolekyler til stede for å fokusere på prøven.
- Fokuser på prøven i fokusmodus ved hjelp av en høytrinnsstørrelse til prøven vises, og reduser deretter trinnene for å finne riktig fokusnivå.
- Null og blank strålen og sørg for at gummiputen dekker mikroskopvinduet.
- Bruk eksponeringsmodus ta bildet av ønsket rutenettområde for en 1 s eksponering ved 62 000x forstørrelse og sjekk det oppnådde bildet.
- Når du er ferdig med å forestille seg et rutenett, lukker du kolonneventilene og fjerner gitterholderen fra kolonnen.
- Når du er ferdig med å forestille seg alle rutenett av interesse, slår mikroskopet av ved å slå av filamentkraften og fjerne den flytende nitrogenavkrigingen fra mikroskopet.
- Plasser noe for å absorbere fuktighet på stativet der krigen satt for å fange kondens fra kobberspolene i mikroskopet.
- Aktiver Cryo Cycle-modus og kontroller at turbopumpen er slått av.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyrene som presenteres her, ble prøver av E. coli AcrB villtype og E. coli mutert AcrB-P223G renset. Prøvene ble deretter adsorrisert til karbonnegative flekkeelektronmikroskopigitter og farget ved hjelp av uranylacetat med sideblottingmetoden22. Negative flekkbilder ble samlet inn ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Det negative flekkbildet for AcrB wild type prøve renset med DDM avslører en homogen løsning av monodispede partikler med proteinet som viser en veldefinert trimerisk kvartenær struktur (figur 1A). Disse trimeriske strukturene samsvarer med det observerte størrelsesekskluderingskromatrammet når det renses (Tilleggsfigur 1). Til sammenligning, når man ser på det negative flekkbildet for AcrB-P223G mutant, også renset med DDM, kan man observere en heterogen løsning av polydispede nanopartikler med en tilbøyelighet til aggregering, men ingen observerbare innfødte trimere (figur 1B). Disse resultatene støttes også av den observerte elutionprofilen når du utfører størrelse ekskludering kromatografi (Supplerende figur 1). For å finne ut om mangelen på trimeriske tilstandsproteiner for muteratoren skyldtes behandling med vaskemiddel eller utelukkende forårsaket av den destabiliserende mutasjonen av P223G, ble proteinene også renset ved hjelp av NCMNP1-1, en av membranaktive polymerer i NCMNs-biblioteket. Det negative flekkbildet for AcrB wild type prøve renset med NCMNP1-1, igjen, avslører en homogen løsning av monodispede partikler med proteinet som viser en veldefinert trimerisk kvartenær struktur (figur 1C). Og akkurat som med DDM rensing, når AcrB-P223G mutant er renset med NCMNP1-1 den negative flekken bildet viser en heterogen løsning av polydispersed nanopartikler med en tilbøyelighet til aggregering, men ingen observerbare innfødte trimere (Figur 1D). For ytterligere å bekrefte at P223G mutasjonen forstyrrer AcrB trimer på cellemembranen en annen polymer (NCMNP5-2) ble valgt fra proprietære NCMNs membran aktiv polymer bibliotek. NCMNP5-2 kan danne innfødte cellemembran nanopartikler i mye større størrelser, slik at flere AcrB trimers å bli avbildet i en enkelt innfødt celle membran partikkel. Som et resultat ble det observert at flere ville type AcrB trimere ble inneholdt i enkeltpartikler (Figur 1E); Imidlertid ble ingen AcrB-P223G trimer partikler som de dannet av vill type AcrB observert, selv når du ser på de store innfødte cellemembran bilayer patcher (Figur 1F). Dette tyder acrB-P223G ikke eksisterer som en trimer på cellemembranen som tidligere foreslått21 og gir en logisk forklaring på hvorfor AcrB-P223G viser en dramatisk nedgang i aktiviteten når analysert16. For å bekrefte renheten av prøvene og tilstedeværelsen av riktig protein, ble elektroforesegeler kjørt for alle rensede proteinprøver. De resulterende flekkene bekreftet tilstedeværelsen av AcrB i alle prøvene med > 95% renhet og plasseringen av flekken tilsvarte den forventede molekylvekten til AcrB (figur 1G). Resultatene fra vår studie er uforenlige med den tidligere beskrevne FRET-analysen med hensyn til å bestemme den oligomeriske tilstanden til membranproteinet AcrB-P223G16. Ved å bruke membran aktive polymerer og elektronmikroskopi som beskrevet i protokollen, var proteinets opprinnelige oligomeriske tilstand direkte observerbar. En mer nøyaktig bestemmelse av hvordan monomerene i proteinet samhandler med hverandre vil kreve bestemmelse av høyoppløselige cryo-EM-strukturer.
Figur 1: Negative flekk- og elektroforesegelbilder av rensede AcrB-konstruksjoner. (A)Negativ flekk bilde tatt for vill type AcrB renset med DDM. (B) Negativ flekk bilde tatt for AcrB-P223G protein konstruere renset med DDM. (C) Negativ flekk bilde tatt for vill type AcrB renset med NCMNP1-1. (D) Negativ flekk bilde tatt for AcrB-P223G konstruere renset med NCMNP1-1. (E) Negativ flekk bilde tatt for vill type AcrB renset med NCMNP5-2 (den røde boksen fremhever noen av trimer nanopartikler observert i bildet). (F) Negativt flekkbilde tatt for AcrB-P223G renset med NCMNP5-2 (den grønne boksen fremhever en del av lipidpatchene tatt av NCMNP5-2 observert på bildet). (G) SDS-PAGE gel kjøre ved hjelp av de endelige produktene fra rensinger av AcrB-P223G med DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE gel kjøre ved hjelp av de endelige produktene fra rensinger av AcrB-P223G med NCMNP5-2. (I) Zoom inn på de uthevede funksjonene fra Figur 1E. (J) Zoom inn på de uthevede funksjonene fra F. Alle de negative flekkbildene i figur 1 har samme skalalinje på 50 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| DDM rensebuffere | Polymer rensing buffere | Gel elektroforese buffere | |||
| Buffer A | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer A | 50 mM HEPES, pH 8,4 | TAE-buffer | 40 mM Tris-base |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% Glyserol | 5% Glyserol | 20 mM eddiksyre | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer B | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN Buffer B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Å finne buffer | 40% Metanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% eddiksyre | |||
| 5% Glyserol | 5% Glyserol | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer C | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Stabling Gel | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30 % akrylamid/bis (0,43 ml) | |||
| 5% Glyserol | 5% Glyserol | 10 % SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | 10 % APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Buffer D | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | 12% Separering Gel | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30 % akrylamid/bis (2 ml) | |||
| 5% Glyserol | 5% Glyserol | 10 % SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | 10 % APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabell 1: Liste over rensebuffere som brukes til kolonnekromatografi og gelelektroforese.
Tilleggsfigur 1: Størrelse ekskludering kromatografi elution profiler. (A)Overlegg graf av de to elution profiler observert for størrelse utelukkelse kromatografi eksperimenter utført ved rensing med DDM og vill type AcrB (oransje) og med DDM og mutant AcrB-P223G (blå). (B) Kolonnekalibreringsprofil for kolonne for størrelsesekskludering som brukes for DDM-eksperimenter.
1: Thyroglobulin (Mr 669 000), 2: Ferritin (Mr 440 000), 3: Aldolase (Mr 158 000), 4: Conalbumin (Mr 7 5 000), 5: Ovalbumin (Mr 44 000), 6: Carbonic anhydrase (Mr 29 000), 7: Ribonuclease A (Mr 13 700). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-protein interaksjoner er viktig for integriteten til strukturen og funksjonen av membranproteiner. Mange tilnærminger er utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner. Sammenlignet med løselige proteiner er membranproteiner og deres PPI vanskeligere å studere på grunn av de unike indre egenskapene til membranproteiner. Denne vanskeligheten kommer hovedsakelig fra kravet om membranproteiner som skal bygges inn i et innfødt lipid bilayer miljø for strukturell stabilitet og funksjonalitet. Dette blir problematisk fordi for å bestemme høyoppløselige strukturer av proteinene må de ekstraheres fra cellemembranen. FRET har vært en populær teknologi for å undersøke protein-protein interaksjoner på cellemembranen, men oppløsningen er lav og produserer ofte falskepositiver 17,18,19,20. Her er det demonstrert, for første gang, at NCMNer kan brukes til å studere membran protein-protein interaksjoner ved strukturelt analysere vill type AcrB trimer og AcrB-P223G monomer på den innfødte cellemembranen og sammenligne resultater med den forrige analysen ved hjelp av FRET. Ved å sammenligne elektronmikroskopi enkeltpartikkelbilder av vill type AcrB og AcrB-P223G, foreslås det at flertallet av AcrB-P223G ikke danner trimere på E.coli-cellemembranen som det ville acrb-proteinet ved renset ved hjelp av membranaktive polymerer, som NCMNP1-1 og NCMNP5-2. Vi foreslår her at resultatene fra FRET-analysen kan være en falsk positiv som følge av oppløsningsbegrensningen av FRET-tilnærmingen. Den kunstige disulfidbindingen som stabiliserte AcrB-P223G trimer kan også være en artefakt som skjedde i løsning21. De negative flekkbildene tyder på at P223G-mutasjonen forhindret dannelsen av AcrB-trimeren, og at den monomeriske formen for AcrB ikke kunne forbli i samme konformasjon observert når den var i trimerisk form. Sløyfen som inneholder denne mutasjonen ble tidligere vist å være helt avgjørende for dannelsen av trimeren gjennom mutagent og strukturell analyse, som viste sin strukturelle betydning å skyldes interaksjonene hver sløyfe dannes ved å begrave inn i den nærliggende AcrB monomer23.
Ved å bruke det innfødte cellemembrannanopartikkelsystemet for protein-proteininteraksjonsdeteksjon og analyse kan man direkte oppdage den oligomeriske tilstanden til et protein ved å holde membranproteinet(e) i et virkelig innfødt cellemembranmiljø, som kan brukes til å få høy oppløsning strukturell informasjon på atomnivå gjennom enkeltpartikkelkryo-EM-analyse av prøven. NCMN-systemet bidrar til å unngå hyppige falske positiver og falske negativer observert i PPI-deteksjon forårsaket av behandling av prøver med vaskemidler24. Disse falske resultatene oppstår vanligvis, på grunn av aggregering, denning av proteinprøve, dissosiasjon av ikke-kovalente interaksjoner og dannelse av kunstige oligomeriske tilstander forårsaket av delipideringseffektene av vaskemidler. I tillegg gir bruk av strukturell analyse i forbindelse med NCMN ytterligere strukturell informasjon og muliggjør direkte observasjon av molekylære interaksjoner, som både er avgjørende for å forstå PPIer og vanligvis tapt ved bruk av tidligere etablerte metoder for PPI-deteksjon. Denne metoden har med hell blitt brukt til strukturelle studier av vill type AcrB og kan ha bred anvendelighet til andre former for strukturell analyse, som røntgenkrystallografi og solid state NMR, og mange forskjellige proteiner som brukes i annen forskning som søker å bestemme interaksjonene som vises av nye proteinmål.
For å oppnå reproduserbare resultater med rimelige proteinutbytter av høy renhet er det flere kritiske skritt i renseprosessen med membranaktive polymerer som må følges. Det første kritiske trinnet er prosessen med membranisolering, og dermed er det avgjørende å sentrifuge cellen lysate på 15.000 x g og følge dette trinnet med ultracentrifugation på 215.000 x g for å virkelig isolere cellemembranen fra resten av cellelylat. Det neste kritiske trinnet er å løse membranfraksjonen med membranaktive polymerer med en konsentrasjon på 2,5% ved romtemperatur i to timer. Optimaliseringseksperimenter av rensingen ble utført, og bruk av disse parametrene på dette trinnet ble vist å sikre at den optimale mengden AcrB ekstraheres fra membranen og riktig dannelse av de innfødte cellemembrannanopartikler oppstår. Det siste kritiske trinnet i renseprosessen laster prøven på Ni-NTA-kolonnen ved romtemperatur. Dette er nødvendig, fordi membran aktive polymerer er mer oppløselige ved romtemperatur enn ved 4 ° C, og dermed lasting ved romtemperatur vil øke mengden proteinbinding på affinitetskolonnen og unngå høyt trykk forårsaket av uoppløselig polymeroppbygging som potensielt kan skade kolonnen. Nesten like viktig for å oppnå nøyaktig strukturell informasjon er trinnene i den negative fargingsprosedyren nevnt ovenfor. De mest kritiske aspektene ved denne prosedyren inkluderer bruk av 10 nm tykke holey karbonnett, volumer av vann og uranylacetat, og lengden på tiden for prøve adsorpsjon og farging. Utnyttelse av disse nøkkelparametrene under prøveforberedelse vil sikre kvalitet strukturelle data som kan brukes til nøyaktig vurdering av oligomeriske tilstander av prøven som blir avbildet. Endringer i renseprotokollen kan være nødvendig ved bruk av forskjellige proteiner for å feilsøke problemene som kan oppstå på grunn av de unike egenskapene til ulike polypeptider. De primære faktorene å vurdere å endre når du har problemer med å få en tilstrekkelig mengde proteinprøve, bør være parametrene som brukes under induksjonstrinnet, mengden membranfraksjon som brukes i solubiliseringstrinnet, og lengden på tid og temperatur for solubiliseringsprosessen. Hvis det er et problem med renhet, kan det være nødvendig å bruke alternative affinitetskolonner, for eksempel en biotin affinitetskolonne, i stedet for å bruke Ni-NTA-kolonnen for rensing. På samme måte, hvis vedlikehold av svake / forbigående protein-proteininteraksjoner er nødvendig, er det gunstig å bytte Ni-NTA-kolonnen for en TAP-tag affinitetskolonne for optimale resultater. Til slutt, når du studerer pattedyrproteiner, bør pattedyruttrykkssystemer brukes til å opprettholde ekte innfødte cellemembranlipidsammensetninger som er nødvendige for nøyaktig bestemmelse av proteinets naturlige oligomeriske tilstand. Dette vil kreve fullstendig revidere proteinuttrykk og cellelyse trinn i denne protokollen. I slike tilfeller bør tidligere etablerte protokoller for proteinuttrykk og cellelyse som tilsvarer uttrykkssystemet som er nødvendig for målproteinet av interesse, følges.
Bruk av NCMN-ene med elektronmikroskopi viser store fordeler sammenlignet med FRET for bruk ved påvisning av PPIer. Som resultatene fra denne studien viser, var de tidligere utførte FRET-eksperimentene uforenlige med den strukturelle analysen av den oligomeriske strukturen til AcrB mutert protein21. Dette ble tydelig vist og direkte bekreftet av bildene tatt med negativ flekkeelektronmikroskopi, som er i samsvar med det tidligere beskrevne tap av aktivitet for mutert AcrB-P223G16. Hvis AcrB-P223G dannet trimere in vivo, ville NCMNP5-2 polymer ha fanget dem i de store innfødte cellemembranpatcher det ekstrakter. Det er mulig at FRET-analysen av mutert AcrB resulterte i en falsk positiv på grunn av noen av de flere begrensningene som er iboende til de fysiske prosessene teknikken er avhengig av og teknologien som brukes til å måle fluorescerende resonansenergioverføringer. En stor begrensning av FRET er oppløsningsgrensene for konfokal mikroskopi, og dette fører til alvorlige begrensninger i intermolekylære avstander som er i stand til å bli løst med FRET-analyser19. Til sammenligning er bruk av NCMNer sammen med elektronmikroskopi ikke underlagt den nevnte begrensningen av FRET, med betydelig høyere oppløsningsgrenser sammenlignet med de av konfokal mikroskopi. Basert på disse begrensningene som har potensielle effekter på de tidligere beskrevne FRET-analysene, hevder vi at feil påvisning av en AcrB-P223G trimer in vivo skyldes begrensningen for lav oppløsning på FRET21. Bortsett fra fordelene over bare FRET påpekt direkte av dette papiret, ved hjelp av NCMNs i forbindelse med elektronmikroskopi har fordelen over alle nåværende protein-protein interaksjonsteknikker, for eksempel Y2H-systemet og TAP-MS, ved at det kan brukes til å observere protein-protein interaksjoner i innfødte cellemembranmiljøer direkte i høy oppløsning og har potensial til å brukes til å bestemme proteinstrukturer på atomnivå.
Membran aktive polymerer og elektronmikroskopi er heller ikke uten begrensninger. For tiden er hovedproblemet med NCMN-rensing dens lavere ekstraksjonseffektivitet sammenlignet med vaskemiddelbaserte metoder (polymerene i NCMN-bibliotekskjermen ~ 70% utvinningseffektiviteten til DDM). Den har også kompatibilitetsproblemer med noen affinitetskolonner, for eksempel maltosebindingskolonner. Videre er NCMN-rensingen fortsatt ikke veldig vellykket med svært dynamiske membranproteiner eller komplekser (data upublisert). Bruk av membran aktive polymerer og elektronmikroskopi for oligomeriske tilstandsbestemmelseseksperimenter krever fjerning av proteinene fra det innfødte cellemiljøet, mens FRET utføres in vivo. Nanopartiklene dannet av membranaktive polymerer tillater imidlertid det mest innfødte miljøet som er mulig når de trekker ut proteinene fra celler, for å redusere de potensielle eksperimentelt avledede unøyaktighetene som er kjent for å være forårsaket av proteinekstraksjon og rensing. I tillegg, mens spørsmålet om oppløsning og partikkelstørrelse som en begrensning av overføring elektronmikroskopi har betydelig redusert i løpet av det siste tiåret, vil mikroskopene som fortsatt brukes til negativ flekkanalyse fortsatt være relativt begrenset til større molekyler eller molekylære komplekser (> 200 kDa) da de vanligvis har en informasjonsgrense på rundt 0,1-0,3 nm25. SMALP har også vist seg å være svært fleksibel når det gjelder applikasjoner, men viser enda større begrensninger enn NCMNer. Nanodiscs dannet av SMA har en maksimal diameter på omtrent 15 nm og dermed er vanligvis ineffektive for å trekke ut proteiner og proteinkomplekser som er over 400 kDa26. I tillegg til denne begrensningen kan SMA heller ikke arbeide med proteiner som finnes i lave pH-miljøer eller bruke divalentioner til strukturelle og funksjonelle formål. På grunn av at SMALPs virkningsmekanisme er pH-avhengig, kan den ikke brukes med lave pH-forhold og chelates divalentioner. Mens SMILP- og DIBMA-metodene har tilbudt løfte i forhold til å overvinne disse begrensningene, har deres anvendelighet til ulike sett proteiner forblittusynlig 27,28. NCMNer søker å overvinne disse begrensningene ved å bruke sar-analyse (Structure-activity Relationship) til å lage alternative polymerer som kan danne større nanopartikler, fungere under lave pH-forhold og unngå å chelating divalentioner. Et slikt eksempel på polymerer som er utviklet for NCMN er NCMNP5-2 polymer som viser evnen til å lage større nanopartikler som vist i figur 1E, F.
I tillegg til de tidligere beskrevne fremskrittene innen nanopartikkelteknologi, er den fremtidige retningen til NCMNer i å utvikle enda mer membranaktive polymerer som vil gi NCMNs polymerbibliotek økt ekstraksjonseffektivitet og evnen til å arbeide med proteiner av alle forskjellige transmembraneregionstørrelser, som fungerer på mye bredere pH-nivåer, eller stole på enhver type ion for vedlikehold av deres struktur og funksjon. Dette vil gjøre det mulig for alle membranproteinforskere å bruke denne teknologien i sine eksperimenter og ha tilgang til mer nøyaktige og biologisk relevante resultater. Ved å bringe fordelene med polymer nanopartikler til et bredere utvalg av proteiner håpet er at dette vil føre til å løse høyoppløselige strukturer av innfødte membranproteinkomplekser på atomnivå og dermed bestemme intramolekylære atominteraksjoner som går inn i å opprettholde disse kompleksene. Slike fremskritt vil også muliggjøre mange nye muligheter når det gjelder membranprotein narkotika oppdagelse og utvikling gjennom strukturbaserte narkotika design innsats. Utnyttelse av strukturbaserte legemiddeldesignteknikker for membranproteiner ville være en massiv fordel for medisinsk industri, da dette ville øke legemiddelbindende spesifisitet og effekt for å redusere uønskede bivirkninger og mengden sammensatt som er nødvendig for å fremkalle ønskede terapeutiske effekter, og dermed gjøre legemidler som retter seg mot membranproteiner betydelig sikrere og mer effektive. Det innfødte cellemembrannanopartikler systemet er fortsatt i utviklingsstadier, men har allerede vist seg å være utrolig kraftig ved å tillate for første gang studiet av membranproteiner i sine virkelig innfødte tilstander og belyse de innfødte protein-protein interaksjoner som oppstår på cellemembranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.G er oppført som oppfinner av membranaktiv polymer NCMNP5-2 og NCMN-systemet.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av VCU oppstartsfond (til Y.G.) og National Institute Of General Medical Sciences ved National Institutes of Health under Award Number R01GM132329 (til Y.G.) Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Vi takker Montserrat Samso og Kevin McRoberts for deres sjenerøse støtte til videoopptak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
