Summary
Præsenteret her er en protokol til bestemmelse af oligomerisk tilstand af membranproteiner, der bruger et indfødt cellemembran nanopartikelsystem i forbindelse med elektronmikroskopi.
Abstract
Proteinproteininteraktioner i cellemembransystemer spiller afgørende roller i en lang række biologiske processer - fra celle-til-celle-interaktioner til signaltransduktion; fra at fornemme miljøsignaler til biologisk respons fra metabolisk regulering til udviklingskontrol. Nøjagtige strukturelle oplysninger om proteinproteininteraktioner er afgørende for at forstå de molekylære mekanismer i membranproteinkomplekser og for udformningen af meget specifikke molekyler til at modulere disse proteiner. Der er udviklet mange in vivo- og in vitro-metoder til påvisning og analyse af proteinproteininteraktioner. Blandt dem er den strukturelle biologitilgang unik, fordi den kan give direkte strukturel information om proteinproteininteraktioner på atomniveau. Den nuværende strukturelle membranproteinbiologi er dog stadig i vid udstrækning begrænset til vaskemiddelbaserede metoder. Den største ulempe ved vaskemiddelbaserede metoder er, at de ofte dissocierer eller denaturerer membranproteinkomplekser, når deres oprindelige lipid bilayer-miljø fjernes af vaskemiddelmolekyler. Vi har udviklet en indfødt cellemembran nanopartikel system til membran protein strukturelle biologi. Her demonstrerer vi brugen af dette system i analysen af proteinproteininteraktioner på cellemembranen med et casestudie af AcrB's oligomeriske tilstand.
Introduction
Proteinproteininteraktioner (PPI) spiller centrale roller i hele biologien, fra vedligeholdelse af proteiners struktur og funktion til regulering af hele systemer. PPI findes i mange forskellige former og kan kategoriseres ud fra, hvilke typer interaktioner de danner. En sådan kategorisering er homooligomerisk eller heterooligomerisk, baseret på, om interaktionerne er mellem identiske underenheder eller forskellige proteiner, der fungerer som underenheder. En anden kategorisering er baseret på styrken af interaktionen, hvis interaktionerne fører til dannelsen af stabile komplekser eller forbigående komplekse tilstande. Strukturelle oplysninger om PPI mellem proteiner er afgørende for at forstå den mekanisme, hvormed proteiner udfører deres funktion. Det er blevet anslået , at over 80% af proteinerne er afhængige af kompleks dannelse for at udføre deres funktionelle roller1. I betragtning af den procentdel af proteiner, der observeres at være afhængige af PPI for korrekt medfødt funktion, er deres betydning i biologi let tydelig, men det er let at kunne undersøge de proteiner, der deltager i disse interaktioner, korrekt på grund af begrænsninger i de teknikker, der er tilgængelige for eksperimentelt at observere, når proteiner danner PPI.
Der er en høj grad af uenighed mellem resultaterne for mange eksperimentelt bestemte PPI'er på grund af den høje mængde støj, falske positiver og falske negativer, der stammer fra mange af de aktuelt tilgængelige PPI-bestemmelsesteknikker. Dette gælder især gær to-hybrid (Y2H) system, tandem affinitet rensning-masse spektrometri (TAP-MS), og fluorescens resonans energioverførsel (FRET), som repræsenterer tre af de mest anvendte metoder til PPI bestemmelse2,3,4,5,6,7. Til sammenligning kan proteinstrukturelle biologiteknikker, såsom nuklear magnetisk resonans (NMR), røntgenkrystallografi og elektronmikroskopi (EM), bruges til at få strukturelle oplysninger i høj opløsning om proteinproteininteraktioner ned til atomniveau og give mulighed for direkte visuel bekræftelse af de interaktioner, der opstår for et målprotein af interesse. Alle de aktuelt tilgængelige ikke-strukturbaserede PPI-afgørende forskningsteknikker (f.eks. Y2H, TAP-MS og FRET) mangler denne evne og lider desuden af at have svært ved at identificere svage og forbigående interaktioner mellem proteiner5. Disse mangler forstærkes yderligere, når man studerer membranproteiner på grund af den ekstra kompleksitet, der er forårsaget af den ekstra variabel i lipidmiljøet, der påvirker dannelsen af korrekt kvartær struktur og heteromerisk kompleks samling.
Membranproteiner udgør en stor del af proteomet og er kendt for at spille mange afgørende roller i korrekt cellefunktion inden for alle levende organismer. På trods af at membranproteiner anslås at udgøre 27% af det menneskelige genom og udgør ~ 60% af alle nuværende lægemiddelmål, er der en stor anomali i antallet af løste modeller for membranproteiner, der kun udgør ~ 2,2% af alle offentliggjorte proteinstrukturer8,9,10. Den primære årsag til uoverensstemmelsen i tilgængeligheden af strukturelle oplysninger ligger i membranproteinernes iboende egenskaber selv. På grund af deres dårlige opløselighed, afhængighed af interaktioner med et lipidmiljø til opretholdelse af indfødt struktur og funktion og forskellige fysiskkemiske egenskaber af lipidmembranen selv, udgør membranproteiner fortsat et betydeligt problem, når de implementerer strukturelle biologiteknikker til at studere dem. Af disse iboende egenskaber er det vigtigste for at opnå nøjagtige strukturelle oplysninger kravet om at have interaktioner med deres naturlige lipidmiljø for dem at opretholde deres oprindelige struktur og funktion. Lipidmiljøet er en så integreret del af membranproteinernes struktur og funktion, at begrebet memtein (en kombination af ordene membran og protein) er blevet foreslået som den grundlæggende enhed af membranproteinstruktur og funktion11. På trods af vigtigheden af lipidproteininteraktioner kræver de nuværende strukturbaserede PPI-bestemmelsesteknikker ofte, at de proteiner, der undersøges, opløses eller opløses med vaskemidler. Eksponering for barske vaskemidler kan denaturere proteinerne eller forårsage falske positiver og negativer på grund af delipidation, som kan fremkalde sammenlægning, denaturering af protein, dissociation af ikke-kovalente interaktioner og dannelse af kunstige oligomeriske tilstande. På grund af nødvendigheden af at opretholde et naturligt lipidmiljø til nøjagtig bestemmelse af den oprindelige oligomeriske tilstand af membranproteiner har vi udviklet et native cellmembran nanopartikler system (NCMNs)12 baseret på den tidligere rapporterede Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 metode.
SMALP bruger styren malesyre copolymer som en membranaktiv polymer til at udvinde og opløse membranproteiner. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) er en unik amphifil polymer på grund af dens hydrofobe styren moiety og diametralt modsatte hydrofile maleinsyre moiety. Det danner nanopartikler ved adsorbing til, destabiliserende, og forstyrre cellemembranen i en pH-afhængig mekanisme14. Denne funktionelle aktivitet af SMA er det, der gør det muligt at bruge det som et vaskemiddelfrit system til membranproteinudvinding og opløselighed. NCMN-systemet adskiller sig fra SMALP-systemet i flere henseender. Det mest unikke træk ved NCMN-systemet er, at det har et membranaktivt polymerbibliotek med et væld af polymerer, der har unikke egenskaber, der gør dem egnede til isolering af mange forskellige membranproteiner, der kræver forskellige betingelser for stabilitet og indfødt funktion. NCMN-systemet har også forskellige protokoller sammenlignet med SMALP-metoden, når det kommer til forberedelse af nanopartiklerne. Et sådant eksempel er, at NCMN'er bruger en enkelt-trins nikkel affinitet kolonne rensning for høj opløsning struktur bestemmelse; effekten af disse forskellige protokoller kan observeres ved sammenligning af NCMN-protokollen, som genererede 3.2 og 3.0 Å cryo-EM AcrB-strukturer, med en lignende undersøgelse ved hjælp af SMALP-metoden, som resulterede i en kryo-EM AcrB-struktur ved en 8,8 Å opløsning12,15. Disse unikke træk ved NCMN-systemet er de forbedringer, der er foretaget på den tidligere etablerede SMALP-metode, og gør det til en ideel kandidat til studiet af PPI.
Multidrug efflux transportøren AcrB findes som funktionel homotrimer i E. coli12. En mutagen analyse antydede, at en enkelt P223G-punktmutation, der er placeret på en løkke, der er ansvarlig for stabiliteten af AcrB-trimeren, destabiliserer trimertilstanden og giver en AcrB monomer, når den fremstilles med vaskemidlet DDM, som kunne påvises med indfødt blå gel elektrophoresis16. Fret-analysen af AcrB-P223G-mutanten antydede imidlertid, at når man var i det oprindelige cellemembran lipid bilayermiljø, eksisterede størstedelen af mutant AcrB-P223G stadig som trimer, og at udtryksniveauerne for både vildtype AcrB og AcrB-P223G er ens. Men på trods af FRET-analyseresultaterne viste en aktivitetsanalyse for den mutante transportør, at aktiviteten faldt dramatisk sammenlignet med den vilde type16. Selvom FRET-teknologi er blevet populært brugt til analyse af proteinproteininteraktioner, har forskning vist, at den ofte kan give falske positiver17,18,19,20.
For nylig blev høj opløsning kryo-EM strukturer AcrB trimer bestemmes, som viste samspillet mellem AcrB med dens tilknyttede indfødte cellemembran lipid bilayer ved hjælp af NCMN'er12. I princippet kan NCMN'erne let anvendes til analyse af proteinproteininteraktioner, der findes på den indfødte cellemembran. I en test af dette system blev der udført eksperimenter for direkte at observere den oligomeriske tilstand af AcrB-P223G ved brug af indfødte cellemembran nanopartikler og negativ farvning af elektronmikroskopi. For at sammenligne med den vilde type AcrB nanopartikler brugte vi den samme membranaktive polymer (SMA2000 lavet i vores laboratorium, som er indekseret som NCMNP1-1 i NCMN-biblioteket), der bruges til kryo-EM-strukturbestemmelse i høj opløsning af AcrB og alternative polymerer, der findes i NCMNs-biblioteket12. Baseret på de tidligere rapporterede resultater forventedes det, at størstedelen af AcrB-P223G-mutanten ville eksistere i form af trimeriske indfødte cellemembran nanopartikler21. Der blev imidlertid ikke fundet AcrB-trimere i stikprøven, som dem, der blev observeret med den vilde type AcrB. Dette tyder på, at størstedelen af AcrB-P223G ikke danner trimers på den indfødte cellemembran som tidligere foreslået.
Her rapporterer vi en detaljeret analyse af mutanten E. coli AcrB-P223G i en sammenligning med den vilde type E. coli AcrB ved hjælp af NCMN'erne. Dette casestudie af AcrB antyder, at NCMN'er er et godt system til protein-proteininteraktionsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinudtryk
- Pod 15 mL Af Terrific Bouillon (TB) medier med antibiotika specifikke for plasmider med BL21 (DE3) pLysS celler, der indeholder AcrB udtrykke plasmider i 50 mL rør natten over ved 37 °C med rysten ved 250 omdrejninger i minuttet.
- Kontroller den optiske tæthed af natten kultur på 600 nm (OD600) og sikre, at det er over 2,0.
- 5 mL cellekultur fortyndes til 1 L TB-medier, der indeholder antibiotika, der er specifikke for plasmider, og inkuberes ved 37 °C ved omrystning indtil OD600=0,8, og induceres derefter med IPTG, der har en endelig koncentration på 1 mM.
- Induktion ved 20 °C med omrystning i 20 timer.
- Pellet cellerne ned ved hjælp af centrifugering i 15 min ved 4 °C og 4.000 x g.
2. Celle lysis og membran isolation
- Genbrug cellepillen i buffer A (Tabel 1, brug DDM Buffer A eller NCMNs Buffer A afhængigt af rensningsskemaet, der skal følges) ved hjælp af 80 mL for hver 20 g af cellepillen.
- De genanvendelige cellepiller homogeniseres ved hjælp af en Dounce homogenisator af glas ved 4 °C, eller hvis de ved stuetemperatur skal sørge for at lægge is på umiddelbart efter.
- Prøven overføres til et metalbæger på is og cellerne ved at indlæse dem i en højtryks homogenisator ved 4 °C og 1.500 bar.
- Gentag processen med at indlæse cellerne i homogenisatoren og give dem mulighed for at passere gennem homogenisatoren i 3-4 cyklusser, eller indtil lysatet begynder at afklare.
- Lysatet centrifuges ved 15.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten opsamles og læsses i ultracentrifugerør og centrifuge ved 215.000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Kassér supernatanten og saml membranpillerne fra ultracentrifugerørene. Overskydende membranpellet opbevares ved -80 °C.
3. Forberedelse af indfødte cellemembran nanopartikler
- Resuspend 1 g membranpel pellet i 10 mL NCMNs Buffer A (Tabel 1).
- Den genbrugte cellemembranprøve homogeniseres med en Dounce homogenisator af glas ved 20 °C.
- Den suspenderede membranprøve overføres til et 50 mL polypropylenrør, og der tilsættes membranaktiv polymer stamopløsning og yderligere NCMNs Buffer A for at bringe prøven op på en endelig koncentration på 2,5% (w/v) membranaktiv polymer (NCMNP1-1 eller NCMNP5-2).
BEMÆRK: Stamopløsninger af membranaktive polymerer skal fremstilles i dobbeltdestilleret vand og kan opbevares i forskellige koncentrationer, men typisk 10% (w/v). - Prøven rystes i 2 timer ved 20 °C.
- Prøven hældes i en ultracentrifuge, og der drejes ved 150.000 x g i 1 time ved 20 °C.
- Mens prøven er ved at blive ultra-centrifuged begynde at ekvilibrere en 5 mL Ni-NTA kolonne med 25 mL NCMNs Buffer A.
- Opsamle supernatanten efter ultracentrifugering er færdig og læg den på 5 mL Ni-NTA kolonne ved stuetemperatur med en strømningshastighed på 0,5 mL/min ved hjælp af en sprøjtepumpe.
- Vask hurtige proteinvæskekromatografilinjer (FPLC) med nok NCMNs Buffer B (Tabel 1) til helt at skylle systemet og derefter forbinde kolonnen til FPLC-maskinen.
- Kolonnen vaskes med 30 mL NCMNs Buffer B med en strømningshastighed på 1 mL/min. og gennemsamles gennemstrømningen.
- Kolonnen vaskes med 30 mL NCMNs Buffer C (Tabel 1) med en strømningshastighed på 1 mL/min.
- Proteinet elueres med 20 mL NCMN-buffer D (tabel 1) med en strømningshastighed på 0,5 mL/min, og prøven opsamles ved hjælp af en fraktioneringsopsamler, og fraktionerne indstilles hver til 1,0 mL.
- Proteinprøverne opbevares ved 4 °C.
- Kør en SDS-PAGE gel elektroforeseanalyse for at kontrollere de prøver, der svarer til toppe observeret på FPLC elution grafen.
4. SDS-PAGE gel elektroforese
- Forbered støbekammeret ved at spænde glasset fast til støbeapparatet.
- Forbered 12% separation gel i henhold til opskriften er anført i tabel 1.
BEMÆRK: Når TEMED er tilsat gelen vil polymerisere hurtigt, så kun tilføje dette, når klar til at hælde gelen. - Hæld gelen, så den efterlader 2 cm under bunden af kammen til stablingsgelen.
- Fjern eventuelle bobler ved at lægge toppen af gelen i lag med 100% isopropanol og vent på, at separationsgelen polymeriseres.
- Isopropanolen fjernes, og eventuelle spor af isopropanolen vaskes med destilleret vand.
- Forbered stabling gel i henhold til opskriften er anført i tabel 1.
BEMÆRK: Når TEMED er tilsat gelen vil polymerisere hurtigt, så kun tilføje dette, når klar til at hælde gelen. - Hæld stabling gel på toppen af adskillelse gel.
- Tilsæt en kam til kammeret for at danne brøndene og vent på, at stablingsgelen polymeriseres fuldstændigt.
- 1 μL 1 M DTT anbringes i et mikrocentrifugerør for hver fraktionsprøve, der skal køres på gelen.
- Der tilsættes også 7 μL 4x læssebuffer til hvert rør.
- Der tilsættes 20 μL prøve fra de fraktioner, der skal køres på gelen, til hvert mikrocentrifugerør.
- Vortex rørene indeholder prøverne.
- Prøverørene drejes ned ved hjælp af en mikrocentrifuge på bordpladen i 3 s, og sørg for, at hele prøven er vendt tilbage til bunden af rørene.
- Gelelektroforesecellen fremstilles ved at fastgøre en 12% polyacrylamidgelkassette på plads og fylde cellens indre og ydre kamre med Tris-acetat-EDTA (TAE) Buffer (tabel 1).
- Læg molekylvægtmarkøren i gelens første bane med det passende volumen, der kræves i dens instruktioner.
- 28 μL af prøven indlæses fra hvert rør blandet med DTT og læssebuffer.
- Læg låget på elektroforesecellen oven på kassen, og sæt låget i strømforsyningen.
- Tænd for strømforsyningen og sæt den til 100 V og lad den køre i 20 minutter.
- Efter 20 min, øge strømforsyningen strøm til 140 V og fortsætte med at køre det i yderligere 30-40 min eller indtil bandet af lastning buffer farvestof når bunden af gel kassetten.
- Efter at have afsluttet elektroforese pletten og de-plette gel til at visualisere protein bands indeholdt i gelen.
5. Proteinrensning ved hjælp af DDM
BEMÆRK: Formålet med denne rensningsproces er at tjene som kontrol for de forsøg, der anvender de membranaktive polymerer.
- 6-10 g membranpel pellet, fra trin 2.6, i DDM Buffer A (Tabel 1) ved hjælp af 5 mL/g membranpellet.
- Den genbrugte prøve homogeniseres med en Dounce homogenisator af glas ved 4 °C, eller hvis den ved stuetemperatur skal sørge for at lægges på is umiddelbart efter.
- Prøven overføres til en 50 mL polypropylenrør, og DDM og yderligere DDM Buffer A tilsættes for at bringe prøven op på en endelig koncentration på 2 % DDM.
- Prøven rystes i 2 timer ved 4 °C.
- Prøven indlæses i ultracentrifugerør og centrifuge i 1 time ved 4 °C og 150.000 x g.
- Mens prøven er ved at blive ultra-centrifuged begynde at forberede 5 mL Af Ni-NTA kolonne ved vask med 25 mL DDM Buffer A (Tabel 1).
- Når ultracentrifugeringen er færdig, opsamles supernatanten, og den lægges på 5 mL Ni-NTA-kolonnen ved 4 °C med en strømningshastighed på 0,5 mL/min ved hjælp af en sprøjtepumpe.
- Vask FPLC-linjer med nok DDM Buffer B + 0,05% DDM (Tabel 1) til helt at skylle systemet og derefter vedhæfte kolonnen til FPLC-maskinen.
- Vask kolonnen med 30 mL DDM Buffer B + 0,05% DDM med en strømningshastighed på 1 mL/min og saml flowet igennem.
- Kolonnen vaskes med 30 mL DDM Buffer C + 0,05% DDM (Tabel 1) med en strømningshastighed på 1 mL/min, og strømmen indsamles.
- Elute proteinet med 20 mL DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tabel 1) med en strømningshastighed på 0,5 mL/min og opsaml strømmen ved hjælp af en fraktionsopsamler, og fraktionerne indstilles hver til 1,0 mL.
- De fraktioner, der indeholder elueringstoppen til samling og koncentration, vælges ved hjælp af en centrifugalkoncentrator og centrifugering ved 4.000 x g og 4 °C, indtil de når op på 500 μL.
- Ved hjælp af en 500 μL-løkke indlæses prøven i FPLC-maskinen og derefter på 25 mL-størrelsesudelukkelseskolonnen ved 4 °C. Elute bruger 30 mL DDM Buffer E + 0,05% DDM (Tabel 1) med en strømningshastighed på 0,5 mL/min og opsamles som brøker med brøkstørrelserne indstillet til 0,5 mL pr. fraktion.
- Tag fraktionerne og mål proteinkoncentrationen ved hjælp af 280 nm absorbans for at bekræfte UV-Vis-kurven fra FPLC-elueringsgrafen.
- Der indsamles 20 μL fra hver prøvefraktion, der svarer til toppe observeret på FPLC-elueringsgrafen, og som blev bekræftet at være nøjagtige med absorbanstesten.
- Resten af disse prøvefraktioner fryses ved hjælp af flydende nitrogen eller tøris i de ønskede aliquots, og proteinprøver opbevares ved -80 °C.
- Kør en SDS-PAGE gel elektroforeseanalyse som tidligere beskrevet for at kontrollere de prøver, der svarer til toppe observeret på FPLC elution grafen.
6. Negativ forberedelse af pletgitter
- Placer de gitre, der skal bruges til prøveforberedelsen, på et glasrutsjebane indpakket i filterpapir med kulsiden vendt mod.
- Placer glasrutsjebanen med elektronmikroskopgitterene ind i kammeret på en glødeudladning mellem de to elektroder, og udskift glaslåget og sørg for, at det er centreret og godt forseglet.
- Kør glødeladningsmaskinen, og sørg for, at det lilla lys, der genereres af plasmaet, er synligt.
- Når maskinen er færdig med at køre, skal du vente, indtil kammeret har nået atmosfærisk tryk for at fjerne glaslåget og derefter returnere rutsjebanen med gitrene til bænken, hvor prøverne vil blive lagt på dem.
- Koncentrationen af de rensede proteinprøver justeres til ca. 0,1 mg/mL ved enten at fortynde prøven med den relevante buffer eller koncentrere sig ved hjælp af en centrifugalkoncentrator.
- 3,5 μL proteinprøven læsses på det 10 nm tykke kulstofgitter, og vent i 1 min.
- Fjern væsken fra overfladen af EM-gitteret med et filterpapir.
- Nettets overflade vaskes 3x ved at samle 3 μL dråber vand op med gitteret og fjerne vandet fra gitteret med filterpapir imellem, der opfanger hver dråbe.
- Nettets overflade vaskes 2x ved at samle 3 μL dråber frisk, filtreret 2% uranacetat op og fjerne vaskeopløsningerne på gitteret med filterpapir imellem, der opfanger hver dråbe.
- Plette nettet med en 3 μL dråbe frisk, filtreret 2% uranacetat i 1 min.
- Uranacetatopløsningen fjernes på overfladen af EM-nettet med filterpapir, og nettet tørres i mindst 1 min.
- Gem gitteret i en gitterboks til senere brug.
7. EM-billeddannelse
- Læg det forberedte gitter i netholderen på en sikker arbejdsbænk.
- Forbered mikroskopet ved at placere mikroskoperne dewar i en polystyren boks og fylde dewar 3/4th fuld af flydende nitrogen.
- Bekræft, at mikroskopvinduets gummidæksel dækker det, og læg derefter dewaren på mikroskopet ved at placere kobberledningerne i dewaren, indtil den passer på platformen.
- Fyld resten af dewar med flydende nitrogen og læg en hætte på toppen af dewar at dække det.
- Tænd for den høje spænding, tilstand mikroskopet, og vente på mikroskopet til at varme op og etablere et sikkert vakuum niveau til brug.
- Når mikroskopet er klar, skal du åbne søjleventilen og bekræfte, at strålen er til stede ved at fjerne gummidækslet på mikroskopvinduet.
- Kontroller strålestigitionen ved at sprede ind og ud ved at justere strålens intensitet. Hvis der er anstiftelse til stede, vil strålen have en elliptisk form, når man bevæger sig væk fra cross-over, og strålen skal være den samme ovale form på begge sider.
- Juster mikroskop kikkerten til at være den rigtige højde og afstand som pr øjnene af observatøren.
- Kontroller strålepositioneringen for tilstandene Søg, Fokusog Eksponering ved at cykle gennem alle tre tilstande, indtil strålen er centreret i hver.
- Luk søjleventilen, og fortsæt med at indlæse gitterholderen i elektronmikroskopet.
- Mikroskopet justeres til eucentrisk højde ved hjælp af mikroskopernes wobbler-funktion og justerer trinnets bevægelse ved hjælp af Z-aksen, indtil prøven ikke er side-til-side-bevægelse i midten.
- Ved hjælp af lavdosis søgetilstand på mikroskopet søge gitteret for et ønskeligt område af rimelig kontrast med prøve molekyler til stede for at fokusere på prøven.
- Fokuser på eksemplet i fokustilstand ved at bruge en høj trinstørrelse, indtil eksemplet er set, og reducer derefter trinene for at finde det korrekte fokusniveau.
- Nul og blank strålen og sørg derefter for, at gummipuden dækker mikroskopvinduet.
- Brug af eksponeringstilstand tage billedet af det ønskede gitter område for en 1 s eksponering ved 62.000x forstørrelse og kontrollere det opnåede billede.
- Når du er færdig med at billed et gitter, skal du lukke kolonneventilerne og fjerne gitterholderen fra kolonnen.
- Når du er færdig billedbehandling alle net af interesse lukning mikroskopet ved at slukke for glødetråden magt og fjerne den flydende kvælstof dewar fra mikroskopet.
- Placer noget til at absorbere fugt på stativet, hvor dewar sad for at fange kondens fra kobber spoler af mikroskopet.
- Aktiver Cryo Cycle-tilstand, og sørg for, at turbopumpen er slukket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af de her beskrevne procedurer blev prøver af vild type E. coli AcrB og E. coli mutant AcrB-P223G renset. Prøverne blev derefter adsorberet til kulstof negative plet elektron mikroskopi gitre og farves ved hjælp af uranylacetat med side blotting metode22. Negative pletbilleder blev indsamlet ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi. Det negative pletbillede for AcrB-prøven af vild type, der er renset med DDM, afslører en homogen opløsning af monoopløselige partikler, hvor proteinet udviser en veldefineret trimerisk kvartsform (Figur 1A). Disse trimeriske strukturer svarer til det observerede størrelsesudelukkelseskromatogram ved rensning(supplerende figur 1). Til sammenligning, når man ser på den negative plet billede for AcrB-P223G mutant, også renset med DDM, kan man observere en heterogen opløsning af polydispersed nanopartikler med en tilbøjelighed til sammenlægning, men ingen observerbare indfødte trimers (Figur 1B). Disse resultater understøttes også af den observerede elueringsprofil ved udførelse af størrelsesudelukkelseskromatografi(supplerende figur 1). For at afgøre, om manglen på trimeriske tilstandsproteiner til mutanten skyldtes behandling med vaskemiddel eller udelukkende forårsaget af den destabiliserende mutation af P223G, blev proteinerne også renset ved hjælp af NCMNP1-1, en af de membranaktive polymerer i NCMNs-biblioteket. Det negative pletbillede for AcrB-prøven af vild type, der er renset med NCMNP1-1, afslører igen en homogen opløsning af monodisperserede partikler, hvor proteinet udviser en veldefineret trimerisk kvartsform (Figur 1C). Og ligesom med DDM rensning, når AcrB-P223G mutant er renset med NCMNP1-1 den negative plet billede viser en heterogen opløsning af polydispersed nanopartikler med en tilbøjelighed til sammenlægning, men ingen observerbare indfødte trimers (Figur 1D). For yderligere at bekræfte, at P223G mutation forstyrrer AcrB trimer på cellemembranen en anden polymer (NCMNP5-2) blev udvalgt fra den proprietære NCMNs membran aktive polymer bibliotek. NCMNP5-2 kan danne indfødte cellemembran nanopartikler i meget større størrelser, hvilket gør det muligt at afbilde flere AcrB-trimere i en enkelt indfødt cellemembranpartikel. Som følge heraf blev det observeret, at flere vilde AcrB-trimere var indeholdt i enkelte partikler (figur 1E); der blev dog ikke observeret nogen AcrB-P223G trimerpartikler som dem, der dannes af vilde type AcrB, selv når man ser på de store indfødte cellemembran bilayer patches (Figur 1F). Dette tyder på AcrB-P223G ikke eksisterer som en trimer på cellemembranen som tidligere foreslået21 og giver en logisk forklaring på, hvorfor AcrB-P223G viser et dramatisk fald i aktiviteten, når analyseret16. For at bekræfte renheden af prøverne og tilstedeværelsen af det korrekte protein blev elektroforesegeler kørt for alle de rensede proteinprøver. De resulterende pletter bekræftede tilstedeværelsen af AcrB i alle prøver med >95% renhed, og plettens placering svarede til AcrB's forventede molekylvægt (figur 1G). Resultaterne fra vores undersøgelse er uforenelige med den tidligere beskrevne FRET-analyse med hensyn til bestemmelse af den oligomeriske tilstand af membranproteinet AcrB-P223G16. Ved at udnytte membranaktive polymerer og elektronmikroskopi som beskrevet i protokollen var proteinets oprindelige oligomeriske tilstand direkte observerbar. En mere præcis bestemmelse af, hvordan proteinets monomerer interagerer med hinanden, vil kræve bestemmelse af kryo-EM-strukturer i høj opløsning.
Figur 1: Negative plet- og elektroforesegelbilleder af rensede AcrB-konstruktioner. (A)Negativ plet billede taget for vilde type AcrB renset med DDM. (B) Negativ plet billede taget for AcrB-P223G protein konstruere renset med DDM. (C) Negativ plet billede taget for vilde type AcrB renset med NCMNP1-1. (D) Negativ plet billede taget for AcrB-P223G konstruere renset med NCMNP1-1. (E) Negativ plet billede taget for vilde type AcrB renset med NCMNP5-2 (den røde boks fremhæver nogle af trimer nanopartikler observeret i billedet). (F) Negativ plet billede taget for AcrB-P223G renset med NCMNP5-2 (den grønne boks fremhæver en del af lipid patches fanget af NCMNP5-2 observeret i billedet). g) SDS-PAGE gel, der drives ved hjælp af slutprodukterne fra rensningerne af AcrB-P223G med DDM (Lane 1), NCMNP1-1 (lane2), (H) SDS-PAGE gel, der køres ved hjælp af slutprodukterne fra rensningen af AcrB-P223G med NCMNP5-2. (I) Zoom ind på de fremhævede funktioner fra Figur 1E. (J) Zoom ind på de fremhævede funktioner fra F. Alle de negative pletbilleder i figur 1 har samme skalalinje på 50 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| DDM-renselsesbuffere | Polymerrensningsbuffere | Gel elektroforese buffere | |||
| Buffer A | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer A | 50 mM HEPES, pH 8,4 | TAE-buffer | 40 mM Tris Base |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 1 mM EDTA | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 20 mM eddikesyre | |||
| 20 mM Imidazol | 20 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer B | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer B | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Destaining-buffer | 40% Methanol |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 10% eddikesyre | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | ||||
| 40 mM Imidazol | 40 mM Imidazol | ||||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | ||||
| 0,1 mM TCEP | |||||
| Buffer C | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer C | 25 mM HEPES, pH 7,8 | Stabling af gel | 1,5 M Tris pH 8,8 (0,63 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrylamid/Bis (0,43 ml) | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 10% SDS (0,025 ml) | |||
| 75 mM Imidazol | 75 mM Imidazol | 10% APS (0,025 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (4 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,39 ml) | ||||
| Buffer D | 50 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer D | 25 mM HEPES, pH 7,8 | 12% adskillelse gel | 1,5 M Tris pH 8,8 (1,3 ml) |
| 300 mM NaCl | 500 mM NaCl | 30% Acrylamid/Bis (2 ml) | |||
| 5% Glycerol | 5% Glycerol | 10% SDS (0,05 ml) | |||
| 300 mM Imidazol | 300 mM Imidazol | 10% APS (0,05 ml) | |||
| 1 mM MgCl2-6 H2O | 0,1 mM TCEP | TEMED (5 μl) | |||
| 0,1 mM TCEP | H2O (1,6 ml) | ||||
| Buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | NCMN-buffer E | 40 mM HEPES, pH 7,8 | ||
| 200 mM NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| 0,1 mM TCEP | 0,1 mM TCEP | ||||
Tabel 1: Liste over rensningsbuffer, der anvendes til kolonnekromatografi og gelelektroforese.
Supplerende figur 1: Profiler af størrelsesudelukkelse af kromatografi. (A) Overlejringsgraf for de to elueringsprofiler, der er observeret for de chromatomografiforsøg med størrelsesudelukkelse, der udføres ved rensning med DDM og vild type AcrB (orange) og med DDM og den mutante AcrB-P223G (blå). (B) Kolonnekalibreringsprofil for størrelsesudelukkelseskolonne, der anvendes til DDM-eksperimenter.
1: Thyroglobulin (Hr. 669 000), 2: Ferritin (hr. 440.000), 3: Aldolase (hr. 158.000), 4: Conalbumin (Hr. Aldolase) 75 000), 5: Ovalbumin (44 000), 6: Kulsyre anhydrase (29 000), 7: Ribonuklease A (Hr. 13 700). Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinproteininteraktioner er vigtige for integriteten af membranproteinernes struktur og funktion. Mange tilgange er blevet udviklet til at undersøge protein-protein interaktioner. Sammenlignet med opløselige proteiner er membranproteiner og deres PPI vanskeligere at studere på grund af membraneproteinernes unikke iboende egenskaber. Denne vanskelighed hovedsageligt kommer fra kravet om membran proteiner, der skal indlejres i en indfødt lipid bilayer miljø for strukturel stabilitet og funktionalitet. Dette bliver problematisk, fordi de for at bestemme højopløsningsstrukturer af proteinerne skal udvindes fra cellemembranen. FRET har været en populær teknologi til at undersøge protein-protein interaktioner på cellemembranen, men opløsningen er lav og ofte producerer falske positiver17,18,19,20. Her påvises det for første gang, at NCMN'er kan bruges til at studere membranproteinproteininteraktioner ved strukturelt at analysere den vilde type AcrB trimer og AcrB-P223G monomer på den indfødte cellemembran og sammenligne resultater med den tidligere analyse ved hjælp af FRET. Ved at sammenligne elektronmikroskopien enkeltpartikelbilleder af vildtype AcrB og AcrB-P223G foreslås det, at størstedelen af AcrB-P223G ikke danner trimere på E.coli-cellemembranen som det vilde type AcrB-protein, når det renses ved hjælp af membranaktive polymerer, som NCMNP1-1 og NCMNP5-2. Vi foreslår her, at resultaterne fra FRET-analysen kan være et falsk positivt resultat af afviklingsbegrænsningen i FRET-tilgangen. Den kunstige disulfid obligation, der stabiliserede AcrB-P223G trimer kunne også være en artefakt, der fandt sted i løsning21. De negative pletbilleder tyder på, at P223G-mutationen forhindrede dannelsen af AcrB-trimeren, og at AcrB's monomere form ikke kunne forblive i samme kropsbygning, som blev observeret, når den var i trimerisk form. Løkken, der indeholder denne mutation, viste sig tidligere at være absolut kritisk for dannelsen af trimeren gennem mutagen og strukturel analyse, som viste dens strukturelle betydning at skyldes samspillet hver løkkeformer ved at begrave i den nærliggende AcrB monomer23.
Ved at anvende det oprindelige cellemembran nanopartikelsystem til detektion og analyse af proteinproteininteraktion kan man direkte detektere et proteins oligomeriske tilstand ved at holde membranproteinerne i et virkeligt indfødt cellemembranmiljø, som kan bruges til at opnå strukturelle oplysninger i høj opløsning på atomniveau gennem enkelt partikel cryo-EM-analyse af prøven. NCMN-systemet hjælper med at undgå de hyppige falske positiver og falske negativer, der observeres i PPI-detektion forårsaget af behandling af prøver med vaskemidler24. Disse falske resultater opstår typisk på grund af aggregering, denaturering af proteinprøven, dissociation af ikke-kovalente interaktioner og dannelse af kunstige oligomeriske tilstande forårsaget af delipidationseffekterne af vaske- og rengøringsmidler. Derudover giver brugen af strukturelle analyser sammen med NCMN'erne yderligere strukturelle oplysninger og giver mulighed for direkte observation af molekylære interaktioner, som både er afgørende for at forstå PPI'er og typisk går tabt, når man bruger tidligere etablerede metoder til PPI-detektion. Denne metode er med succes blevet anvendt til strukturelle undersøgelser af vilde type AcrB og kunne have bred anvendelighed til andre former for strukturel analyse, såsom røntgenkrystallografi og faststof NMR, og mange forskellige proteiner, der anvendes i anden forskning, der søger at bestemme de interaktioner, der vises af nye proteinmål.
For at opnå reproducerbare resultater med rimelige proteinudbytter af høj renhed er der flere kritiske trin i rensningsprocessen med membranaktive polymerer, der skal følges. Det første kritiske skridt er processen med membranisolation, og derfor er det afgørende at centrifugere cellelysatet ved 15.000 x g og følge dette trin med ultracentrifugering ved 215.000 x g for virkelig at isolere cellemembranen fra resten af cellelysatet. Det næste kritiske skridt er at opløse membranfraktionen med membranaktive polymerer i en koncentration på 2,5% ved stuetemperatur i to timer. Optimeringseksperimenter af rensningen blev udført, og ved hjælp af disse parametre på dette trin blev det vist sig at sikre, at den optimale mængde AcrB udvindes fra membranen, og korrekt dannelse af de indfødte cellemembrannanpartikler opstår. Det sidste kritiske trin i rensningsprocessen er at lægge prøven på Ni-NTA-kolonnen ved stuetemperatur. Dette er nødvendigt, fordi membranaktive polymerer er mere opløselige ved stuetemperatur end ved 4 °C, således at belastning ved stuetemperatur vil øge mængden af proteinbinding på affinitetskolonnen og undgå højt tryk forårsaget af uopløselig polymeropbygning, der potentielt kan skade kolonnen. Næsten lige så vigtigt for at opnå nøjagtige strukturelle oplysninger er de trin, der er indeholdt i den negative farvningsprocedure, der er nævnt ovenfor. De mest kritiske aspekter af denne procedure omfatter brugen af 10 nm tykke holey carbon grids, mængder af vand og uranylacetat, og længden af tid til prøve adsorption og farvning. Anvendelsen af disse nøgleparametre under prøveforberedelsen vil sikre strukturelle kvalitetsdata, der kan anvendes til nøjagtig vurdering af de oligomeriske tilstande i den prøve, der afbildes. Ændringer af rensningsprotokollen kan være nødvendige, når du bruger forskellige proteiner til at fejlfinde de problemer, der kan opstå på grund af de unikke egenskaber ved forskellige polypeptider. De primære faktorer, der skal overvejes at ændre, når der er problemer med at få en tilstrækkelig mængde proteinprøve, bør være de parametre, der anvendes under induktionstrinnet, mængden af membranfraktion, der anvendes i opløselighedstrinnet, og længden af tid og temperatur for opløselsesprocessen. Hvis der er et problem med renhed kan det være nødvendigt at bruge alternative affinitet kolonner, såsom en biotin affinitet kolonne, i stedet for at bruge Ni-NTA kolonne til rensning. Hvis det er nødvendigt at opretholde svage/forbigående proteinproteininteraktioner, er det ligeledes gavnligt at udskifte Ni-NTA-kolonnen med en TAP-tag-affinitetskolonne for at opnå optimale resultater. Endelig bør pattedyrsudtrykssystemer, når man studerer pattedyrproteiner, anvendes til at opretholde ægte hjemmehørende cellemembran lipidsammensætninger, der er nødvendige for præcis bestemmelse af proteinets naturlige oligomeriske tilstand. Dette vil kræve en fuldstændig revision af proteinudtrykket og cellelystrinnene i denne protokol. I sådanne tilfælde bør tidligere etablerede protokoller for proteinudtryk og celle lysis, der svarer til det ekspressionssystem, der er nødvendigt for målproteinet af interesse, følges.
Brug af NCMN'er med elektronmikroskopi viser store fordele sammenlignet med FRET til brug ved påvisning af PPI. Som resultaterne af denne undersøgelse viser, var de tidligere udførte FRET-eksperimenter uforenelige med den strukturelle analyse af den oligomeriske struktur af AcrB-mutantproteinet21. Dette blev tydeligt vist og direkte bekræftet af billederne taget med negativ pletelektronmikroskopi, som er i overensstemmelse med det tidligere beskrevne aktivitetstab for den mutante AcrB-P223G16. Hvis AcrB-P223G gjorde form trimers in vivo NCMNP5-2 polymer ville have fanget dem i de store indfødte cellemembran patches det ekstrakter. Det er muligt, at FRET analyse af mutant AcrB resulterede i en falsk positiv på grund af nogen af de mange begrænsninger, der er uløseligt forbundet med de fysiske processer teknikken er afhængig af, og den teknologi, der anvendes til at måle fluorescerende resonans energioverførsler. En væsentlig begrænsning af FRET er opløsningsgrænserne for konfokal mikroskopi, og dette fører til alvorlige begrænsninger i de intermolekylære afstande, der kan løses med FRET-analyse19. Til sammenligning er anvendelse af NCMN'er i forbindelse med elektronmikroskopi ikke underlagt ovennævnte begrænsning af FRET, med betydeligt højere opløsningsgrænser sammenlignet med confocal mikroskopi. Baseret på disse begrænsninger, der har potentielle virkninger på de tidligere beskrevne FRET-assays, antager vi, at den forkerte påvisning af en AcrB-P223G trimer in vivo skyldtes den lave opløsningsbegrænsning på FRET21. Bortset fra fordelene i forhold til bare FRET påpeget direkte af dette papir, ved hjælp af NCMN'er i forbindelse med elektronmikroskopi har den fordel i forhold til alle nuværende protein-protein interaktion teknikker, såsom Y2H-systemet og TAP-MS, idet det kan bruges til at observere protein-protein interaktioner i indfødte cellemembran miljøer direkte i høj opløsning og har potentiale til at blive brugt til at bestemme protein strukturer på atomare niveau.
Membran aktive polymerer og elektronmikroskopi er ikke uden begrænsninger så godt. I øjeblikket er hovedspørgsmålet om NCMN-rensning den lavere ekstraktionseffektivitet sammenlignet med vaskemiddelbaserede metoder (polymererne i NCMN-biblioteket viser udvindingseffektiviteten af DDM på ~70 %). Det har også kompatibilitetsproblemer med nogle affinitetskolonner, f.eks. Desuden er NCMN-rensningen stadig ikke særlig vellykket med meget dynamiske membranproteiner eller komplekser (data ikke offentliggjort). Anvendelse af membranaktive polymerer og elektronmikroskopi til oligomeriske tilstandsbestemmelseseksperimenter kræver fjernelse af proteinerne fra det oprindelige cellemiljø, mens FRET udføres in vivo. Nanopartiklerne dannet af membranaktive polymerer giver imidlertid mulighed for det mest indfødte miljø, der er muligt, når proteinerne udvindes fra celler, for at reducere de potentielle eksperimentelt afledte unøjagtigheder, der vides at være forårsaget af proteinudvinding og rensning. Mens spørgsmålet om opløsning og partikelstørrelse som en begrænsning af transmissionselektronmikroskopi er faldet betydeligt i løbet af det seneste årti, vil de mikroskoper, der stadig bruges til negativ pletanalyse, stadig være relativt begrænset til større molekyler eller molekylære komplekser (>200 kDa), da de generelt har en informationsgrænse på omkring 0,1-0,3 nm25. SMALP har også vist sig at være meget fleksibel med hensyn til applikationer, men udviser endnu større begrænsninger end NCMN'er. Nanodiscerne dannet af SMA har en maksimal diameter på ca. 15 nm og er derfor almindeligt ineffektive til udvinding af proteiner og proteinkomplekser, der er over 400 kDa26. Ud over denne begrænsning er SMA heller ikke i stand til at arbejde med proteiner, der findes i lave pH-miljøer eller udnytte divalentioner til strukturelle og funktionelle formål. På grund af, at SMALP'ers virkningsmekanisme er pH-afhængig, kan den ikke anvendes med lave pH-forhold og chelater divalentioner. Mens SMILP og DIBMA metoder har tilbudt lovende med hensyn til at overvinde disse begrænsninger, deres anvendelighed til forskellige sæt proteiner er forblevet uset27,28. NCMNs søger at overvinde disse begrænsninger ved hjælp af struktur-aktivitet forhold (SAR) analyse for at skabe alternative polymerer, der kan danne større nanopartikler, der fungerer i lave pH-forhold, og undgå chelaterende divalent ioner. Et sådant eksempel på de polymerer, der er udviklet til NCMN Er er NCMNP5-2 polymer, som viser evnen til at skabe større nanopartikler som påvist i figur 1E, F.
Ud over de tidligere beskrevne fremskridt inden for nanopartikelteknologi er NCMN'ernes fremtidige retning at udvikle endnu mere membranaktive polymerer, der vil give NCMNs polymerbibliotek øget ekstraktionseffektivitet og evnen til at arbejde med proteiner i alle forskellige transmembranregionstørrelser, der fungerer på meget bredere pH-niveauer eller stole på enhver form for ion til vedligeholdelse af deres struktur og funktion. Dette vil give alle membranproteinforskere mulighed for at udnytte denne teknologi i deres eksperimenter og have adgang til mere nøjagtige og biologisk relevante resultater. Ved at bringe fordelene ved polymer nanopartikler til en bredere vifte af proteiner er håbet, at dette vil føre til at løse strukturer i høj opløsning af indfødte membranproteinkomplekser på atomniveau og dermed bestemme de intramolekylære atomare interaktioner, der går ind i vedligeholdelsen af disse komplekser. Sådanne fremskridt vil også give mange nye muligheder med hensyn til opdagelse og udvikling af membranproteinmedicin gennem strukturbaserede lægemiddeldesignindsatser. Udnyttelse af strukturbaserede lægemiddeldesignteknikker til membranproteiner ville være en massiv fordel for medicinalindustrien, da dette ville øge lægemiddelbindingsspecifikitet og effektivitet for at reducere uønskede bivirkninger og mængden af forbindelser, der er nødvendige for at fremkalde ønskede terapeutiske virkninger, hvilket gør lægemidler, der er målrettet mod membranproteiner, betydeligt sikrere og mere effektive. Den indfødte cellemembran nanopartikler system er stadig i sin udviklingsstadier, men har allerede vist sig at være utrolig kraftfuld ved at tillade for første gang studiet af membran proteiner i deres virkelig indfødte stater og belyse de indfødte protein-protein interaktioner, der opstår på cellemembranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.G er opført som opfinder af membranen aktive polymer NCMNP5-2 og NCMN system.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af VCU start fond (til YG) og National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award Number R01GM132329 (til Y.G.) Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter. Vi takker Montserrat Samso og Kevin McRoberts for deres generøse støtte til videooptagelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al.
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E.
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
