Karakterisering av Intra-Brosk Transport Egenskaper av Cationic Peptid Bärare

Summary

Detta protokoll bestämmer jämvikt upptag, djup av penetration och icke-jämvikt diffusion hastighet för katjoniska peptid bärare i brosk. Karakterisering av transportegenskaper är avgörande för att säkerställa en effektiv biologisk respons. Dessa metoder kan tillämpas för att utforma en optimalt laddade läkemedelsbärare för inriktning negativt laddade vävnader.

Abstract

Flera negativt laddade vävnader i kroppen, som brosk, utgör ett hinder för den riktade läkemedelsleveransen på grund av deras höga densitet av negativt laddade aggrecans och kräver därför förbättrade inriktningsmetoder för att öka deras terapeutiska svar. Eftersom brosk har en hög negativ fast laddningstäthet, läkemedel kan modifieras med positivt laddade läkemedelsbärare att dra nytta av elektrostatiska interaktioner, vilket möjliggör förbättrad intra-brosk läkemedelstransport. Att studera transport av läkemedelsbärare är därför avgörande för att förutsäga effekten av läkemedel för att inducera ett biologiskt svar. Vi visar utformningen av tre experiment som kan kvantifiera jämvikt upptag, djup penetration och icke-jämvikt diffusion hastighet av katjonska peptid bärare i brosk explants. Jämviktsupptag experiment ger ett mått på den solute koncentrationen inom brosket jämfört med dess omgivande bad, vilket är användbart för att förutsäga potentialen hos en läkemedelsbärare för att förbättra terapeutisk koncentration av läkemedel i brosk. Djup av penetrationsstudier med hjälp av konfokalmikroskopi möjliggör visuell representation av 1D-solute diffusion från den ytliga till djupa zonen av brosk, vilket är viktigt för att bedöma om solutes når sin matris och cellulära mål platser. Icke-jämviktsdiffusionshastighetsstudier med användning av en specialdesignad transportkammare möjliggör mätning av styrkan i bindningsinteraktioner med vävnadsmatrisen genom att karakterisera diffusionshastigheterna för fluorescerande märkta solutes över vävnaden; detta är fördelaktigt för att utforma bärare av optimal bindningsstyrka med brosk. Tillsammans ger de resultat som erhållits från de tre transportexperimenten en riktlinje för att utforma optimalt laddade läkemedelsbärare som utnyttjar svaga och reversibla laddningsinteraktioner för läkemedelsleveransapplikationer. Dessa experimentella metoder kan också tillämpas för att utvärdera transport av narkotika och drug-drug carrier konjugater. Vidare kan dessa metoder anpassas för användning i inriktning andra negativt laddade vävnader såsom menisk, hornhinnan och glasaktig humor.

Introduction

Drug-leverans till negativt laddade vävnader i kroppen är fortfarande en utmaning på grund av oförmåga läkemedel att tränga djupt in i vävnaden för att nå cell och matris mål platser¹. Flera av dessa vävnader består av tätt packade, negativt laddade aggrecans som skapar en hög negativ fast laddningstäthet (FCD)² inom vävnaden och fungerar som en barriär för leverans av de flesta makromolekyler^3,4. Men med hjälp av positivt laddade läkemedelsbärare kan denna negativt laddade vävnadsbarriär faktiskt omvandlas till en läkemedelsdepå via elektrostatiska laddningsinteraktioner för ihållande^{läkemedelsleverans 1,5,6,7}( Figur1).

Bild 1: Avgiftsbaserad intrabroskleverans av CPC. Intra-artikulära injektion av CPCs i knäleden utrymme. Elektrostatiska interaktioner mellan positivt laddade CPCs och negativt laddade aggrecan grupper möjliggör snabb och full djup penetration genom brosk. Denna siffra har modifierats från Vedadghavami et al⁴. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Nyligen, kort längd katjoniska peptid bärare (CPCs) utformades med målet att skapa små katjonska domäner som kan bära större storlek therapeutics för leverans till negativt laddade brosk⁴. För effektiv läkemedelstillförsel till brosket för behandling av förhärskande^8,9 och degenerativa sjukdomar som artros (OA)¹⁰, är det kritiskt att terapeutiska koncentrationer av läkemedel tränger djupt inne i vävnaden, där en majoritet av broskcellerna (chondrocytes) ligger¹¹. Även om det finns flera potentiella sjukdom modifiera läkemedel tillgängliga, ingen har fått FDA godkännande eftersom dessa inte kan effektivt rikta brosk^12,13. Därför är utvärdering av läkemedelsbärares transportegenskaper nödvändig för att förutsäga effektiviteten av läkemedel för att inducera ett terapeutiskt svar. Här har vi utformat tre separata experiment som kan utnyttjas för bedömning av jämviktsupptag, djup av penetration och icke-jämvikt diffusion hastigheten av CPCs⁴.

För att säkerställa att det finns en tillräcklig läkemedelskoncentration inom brosket som kan ge ett optimalt terapeutiskt svar, var upptagsexperiment utformade för att kvantifiera jämvikt CPC-koncentration i brosk⁴. I denna utformning, efter en jämvikt mellan brosket och dess omgivande bad, kan den totala mängden solute inuti brosket (antingen bunden till matrisen eller gratis) bestämmas med hjälp av ett upptagsförhållande. Detta förhållande beräknas genom att normalisera koncentrationen av solutes inuti brosket till det i jämviktsbadet. I princip skulle neutrala solutes, vars diffusion genom brosket inte bistås av laddningsinteraktioner, ha ett upptagsförhållande på mindre än 1. Omvänt visar katjoniska solutes, vars transport förstärks via elektrostatiska interaktioner, ett upptagsförhållande som är större än 1. Som visas med CPCs kan dock användning av en optimal positiv laddning resultera i mycket högre upptagskvoter (större än 300)⁴.

Även om hög läkemedelskoncentration inom brosket är viktigt för att uppnå terapeutisk nytta, är det också kritiskt att läkemedel diffusa genom full tjocklek av brosket. Därför krävs studier som visar inträngningsdjupet för att säkerställa att läkemedel når djupt inom brosket så att matrisen och cellulära målställen kan nås, och därigenom ge en mer effektiv terapi. Detta experiment var utformad för att bedöma enkelriktad diffusion av solutes genom brosk, simulera diffusion av läkemedel i brosk efter intra-artikulära injektion in vivo. Fluorescens imaging med hjälp av confocal mikroskopi möjliggör utvärdering av djup av penetration i brosk. Nettopartikelladdning spelar en nyckelroll i moderering hur djupa droger kan sprida sig genom matrisen. En optimal nettoladdning baserad på en vävnad FCD krävs för att möjliggöra svag-reversibla bindande interaktioner mellan katjonpartiklar och den anjoniska vävnadsmatrisen. Detta innebär att all interaktion är tillräckligt svag så att partiklar kan ta avstånd från matrisen men reversibla i naturen så att den kan binda till en annan matrisbindningsplats djupare inom^{vävnaden 4}. Omvänt kan överdriven positiv nettoladdning av en partikel vara skadlig mot diffusion, eftersom för stark matrisbindning förhindrar avlossning av partiklar från det initiala bindningsstället i broskens ytliga zon. Detta skulle resultera i en otillräcklig biologisk reaktion eftersom en majoritet av målplatserna ligger djupt inne i vävnaden¹¹.

För att ytterligare kvantifiera styrkan i de bindande interaktionerna är analys av läkemedelsdiffusionshastigheter genom brosk fördelaktig. Icke-jämviktsdiffusionsstudier möjliggör jämförelse av spridningshastigheter i realtid mellan olika solutes. Som läkemedel diffusa genom de ytliga, mellersta och djupa zoner av brosk, kan förekomsten av bindande interaktioner kraftigt förändra diffusion priser. När bindningsinteraktioner förekommer mellan läkemedel och broskmatrisen definieras den som den effektiva diffusiviteten (D_EFF). I detta fall, när alla bindningsställen har ockuperats, styrs diffusionshastigheten av droger av den stadiga-statliga diffusionen (D_SS). Jämförelse mellan D_{EFF av} olika solute bestämmer den relativa bindningsstyrkan för solutes med matrisen. För en given solute, om D_EFF och D_SS är inom samma storleksordning, innebär det att det finns minimal bindning närvarande mellan läkemedlet och matrisen under diffusion. Men om D_{EFF är} större än D_SS, betydande bindning av partiklar till matris finns.

De utformade experimenten möjliggör individuellt karakterisering av solute transport genom brosket, men en holistisk analys inklusive alla resultat krävs för att utforma en optimalt laddad drogbärare. Den svaga och reversibla karaktären av laddningsinteraktioner styr partikeldifningshastigheten och möjliggör hög jämviktsupptag och snabb fulldjupspenetration genom brosk. Genom jämviktsupptagsexperiment bör vi leta efter bärare som visar högt upptag som ett resultat av laddningsinteraktioner som kan verifieras med hjälp av icke-jämviktsdiffusionshastighetsstudier. Dessa bindande interaktioner bör dock vara svaga och reversibla i naturen för att möjliggöra full-tjocklek penetration av solute genom brosk. En idealisk läkemedelsbärare skulle ha en optimal laddning som möjliggör tillräckligt stark bindning för upptag och höga intrabrosk läkemedelskoncentrationer, men inte för stark för att hindra full-tjocklek diffusion⁴. De presenterade experimenten kommer att bistå i konstruktionsegenskaperna för laddningsbaserad vävnad som riktar sig mot läkemedelsbärare. Dessa protokoll användes för att karakterisera CPC transport genom brosk⁴, men dessa kan också tillämpas på en mängd olika läkemedel och bärare läkemedel genom brosk och andra negativt laddade vävnader.

Protocol

Universitetsgodkännanden erhölls för att utföra experimenten med döda vävnader. Fogar för nötkreatur erhölls kommersiellt från ett slakteri. 1. Utsug av explant av brosk Med hjälp av en skalpell (#10 blad), klippa och ta bort fett, muskler, ligament, senor och alla andra bindväv för att exponera brosket från femoropatellar spåret av nötkreatur knäleder. Använd 3 mm och 6 mm dermal stansar, gör vinkelräta stansar i brosket för att extrahera cylindriska p…

Representative Results

Efter jämvikt absorption av CPCs genom brosk, badet fluorescens minskar när solute har tagits upp av vävnaden. Om det slutliga badet fluorescensvärde förblir likt initialen, tyder det dock på att det inte finns något/minimalt upptag av utskänk. En annan bekräftelse på solute upptag är om vävnaden har synligt bytt färg till färgen på fluorescerande färgämnet. Det kvantitativa upptaget av solutes i brosk bestämdes med hjälp av upptagningsförhållandet (RU) efter att fluorescensvärdena omvand…

Discussion

De metoder och protokoll som beskrivs här är betydande för området riktade drug delivery till negativt laddade vävnader. På grund av den höga tätheten av negativt laddade aggrecans som finns i dessa vävnader, skapas en barriär, vilket förhindrar droger från att nå sina cellulära målplatser som ligger djupt inom matrisen. För att ta itu med denna enastående utmaning, läkemedel kan ändras för att införliva positivt laddade narkotikabärare som kan förbättra transporthastigheten, upptag och bindning a…

Materials

316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18×18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7×2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long