Summary
يحدد هذا البروتوكول امتصاص التوازن وعمق الاختراق ومعدل الانتشار غير المتوازن لحاملي الببتيد الموجب في الغضاريف. توصيف خصائص النقل أمر حاسم لضمان استجابة بيولوجية فعالة. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتصميم ناقلات المخدرات مشحونة على النحو الأمثل لاستهداف الأنسجة المشحونة سلبا.
Abstract
العديد من الأنسجة المشحونة سلبا في الجسم، مثل الغضاريف، تشكل حاجزا أمام تسليم المخدرات المستهدفة بسبب كثافة عالية من aggrecans مشحونة سلبا، وبالتالي، تتطلب أساليب استهداف محسنة لزيادة استجابتها العلاجية. لأن الغضاريف لديها كثافة عالية تهمة ثابتة سلبية، يمكن تعديل الأدوية مع ناقلات المخدرات مشحونة بشكل إيجابي للاستفادة من التفاعلات الكهروستاتيكية، مما يسمح لتعزيز نقل المخدرات داخل الغضاريف. ولذلك، فإن دراسة نقل ناقلي المخدرات أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بفعالية العقاقير في الحث على الاستجابة البيولوجية. نعرض تصميم ثلاث تجارب التي يمكن أن تحدد كمية امتصاص التوازن, عمق الاختراق وعدم التوازن معدل الانتشار من حاملات الببتيد الموجبة في explants الغضروف. توفر تجارب امتصاص التوازن مقياسًا لتركيز المذاب داخل الغضاريف مقارنة بالحمام المحيط به ، وهو مفيد للتنبؤ بإمكانات حامل الدواء في تعزيز التركيز العلاجي للأدوية في الغضاريف. عمق دراسات الاختراق باستخدام المجهر confocal تسمح للتمثيل البصري للانتشار 1D من منطقة سطحية إلى منطقة عميقة من الغضاريف، وهو أمر مهم لتقييم ما إذا كانت السولات تصل إلى المصفوفة ومواقعها المستهدفة الخلوية. دراسات معدل الانتشار غير المتوازن باستخدام غرفة نقل مصممة خصيصاً تمكن من قياس قوة التفاعلات الملزمة مع مصفوفة الأنسجة من خلال توصيف معدلات انتشار الفلورسنتات المسماة عبر الأنسجة؛ وهذا مفيد لتصميم الناقلين من قوة الربط الأمثل مع الغضاريف. وتوفر النتائج التي تم الحصول عليها معا من تجارب النقل الثلاث مبادئ توجيهية لتصميم ناقلات المخدرات المشحونة على النحو الأمثل التي تستفيد من تفاعلات الشحن الضعيفة والقابلة للعكس لتطبيقات توصيل المخدرات. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطرائق التجريبية لتقييم نقل المخدرات والاقترانات بين ناقلي المخدرات. علاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الأساليب للاستخدام في استهداف الأنسجة الأخرى المشحونة سلبا مثل الغضروف المفصلي والقرنية والفكاهة الزجاجي.
Introduction
لا يزال تسليم المخدرات للأنسجة المشحونة سلبا في الجسم تحديا بسبب عدم قدرة المخدرات على اختراق عمق الأنسجة للوصول إلى الخلايا والمصفوفة المواقع المستهدفة1. العديد من هذه الأنسجة تتألف من كثيفة معبأة، واتهم سلبا aggrecans التي تخلق كثافة عالية تهمة ثابتة سالبة (FCD)2 داخل الأنسجة وتعمل كحاجز لتسليم معظم الجزيئاتالكبيرة 3،4. ومع ذلك، بمساعدة من حاملي المخدرات المشحونة إيجابيا، يمكن تحويل هذا الحاجز الأنسجة المشحونة سلبا في الواقع إلى مستودع للمخدرات عن طريق تفاعلات شحنة الكهربائية الساكنة للتسليم المستمر للمخدرات1،5،6،7( الشكل1).
الشكل 1: الشحن القائم على التسليم داخل الغضاريف من CPCs. الحقن داخل المفصل من CPCs في مساحة مفصل الركبة. التفاعلات الكهروستاتيكية بين CPCs مشحونة بشكل إيجابي ومجموعات aggrecan المشحونة بشكل سلبي تمكن من اختراق العمق السريع والكامل من خلال الغضاريف. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami وآخرون4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الآونة الأخيرة، قصير طول الببتيد حاملات (CPCs) تم تصميمها بهدف خلق مجالات الموجبة الصغيرة قادرة على حمل علاجات أكبر الحجم لتسليم الغضروف المشحونة سلبا4. للتسليم الفعال للأدوية إلى الغضروف لعلاج انتشار8,9 والأمراض التنكسية مثل هشاشة العظام (OA)10, فمن الأهمية بمكان أن تتغلغل التركيزات العلاجية للأدوية عميقا داخل الأنسجة, حيث غالبية خلايا الغضاريف (chondrocytes) تكمن11. على الرغم من أن هناك العديد من الأمراض المحتملة تعديل الأدوية المتاحة, لم يحصل أي موافقة ادارة الاغذية والعقاقير لأن هذه غير قادرة على استهداف الغضروف بشكل فعال12,13. ولذلك، فإن تقييم خصائص نقل ناقلي المخدرات ضروري للتنبؤ بفعالية الأدوية في الحث على الاستجابة العلاجية. هنا، قمنا بتصميم ثلاث تجارب منفصلة يمكن استخدامها لتقييم امتصاص التوازن، وعمق الاختراق، ومعدل الانتشار غير المتوازن لCSCS4.
لضمان وجود تركيز كاف من المخدرات داخل الغضاريف التي يمكن أن توفر استجابة علاجية مثلى، تم تصميم تجارب الامتصاص لتحديد التوازن تركيز CPC في الغضاريف4. في هذا التصميم، وبعد التوازن بين الغضروف والحمام المحيطة بها، يمكن تحديد المبلغ الإجمالي من المذاب داخل الغضروف (إما ملزمة إلى المصفوفة أو الحرة) باستخدام نسبة امتصاص. وتحسب هذه النسبة عن طريق تطبيع تركيز solutes داخل الغضاريف إلى أن من حمام التوازن. من حيث المبدأ، فإن السونات المحايدة، التي لا يساعدها التفاعلات الشحنية في انتشارها عبر الغضاريف، سيكون لها نسبة امتصاص أقل من 1. وعلى العكس من ذلك، فإن الوبلوتات الموجبة، التي يتم تعزيز نقلها عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية، تظهر نسبة امتصاص أكبر من 1. ومع ذلك ، كما هو مبين مع CPCs ، يمكن أن يؤدي استخدام الشحنة الإيجابية المثلى إلى نسب امتصاص أعلى بكثير (أكبر من 300)4.
على الرغم من أن تركيز المخدرات العالية داخل الغضروف مهم لتحقيق فائدة علاجية ، إلا أنه من المهم أيضًا أن تنتشر الأدوية من خلال السماكة الكاملة للغضاريف. ولذلك، هناك حاجة إلى دراسات تبين عمق الاختراق لضمان وصول الأدوية إلى عمق الغضاريف حتى يمكن الوصول إلى مواقع المصفوفة والخلايا المستهدفة، وبالتالي توفير علاج أكثر فعالية. وقد صُممت هذه التجربة لتقييم انتشار الوبات في اتجاه واحد من خلال الغضاريف، محاكياً انتشار المخدرات في الغضاريف بعد الحقن داخل المفصلي في الجسم الحي. يسمح التصوير الفلوري باستخدام المجهر الناسخ بتقييم عمق الاختراق في الغضاريف. صافي الجسيمات تهمة تلعب دورا رئيسيا في الاعتدال كيف المخدرات العميقة يمكن أن تنتشر من خلال المصفوفة. مطلوب الشحن الصافي الأمثل على أساس FCD الأنسجة للسماح لتفاعلات الربط ضعيفة قابلة للعكس بين الجسيمات الموجبة ومصفوفة الأنسجة anionic. وهذا يعني أن أي تفاعل ضعيف بما فيه الكفاية بحيث يمكن للجسيمات أن تنأى عن المصفوفة ولكن يمكن عكسها في الطبيعة بحيث يمكن ربطها بموقع ملزم آخر داخل النسيج4. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تكون الشحنة الصافية الموجبة المفرطة للجسيمات ضارة نحو الانتشار، حيث أن ربط المصفوفة القوي جداً يمنع انفصال الجسيمات عن موقع الربط الأولي في المنطقة السطحية للغضاريف. وهذا من شأنه أن يؤدي إلى استجابة بيولوجية غير كافية لأن غالبية المواقع المستهدفة تقع في عمق الأنسجة11.
لمزيد من التحديد الكمي لقوة التفاعلات الملزمة ، فإن تحليل معدلات انتشار المخدرات من خلال الغضاريف مفيد. دراسات الانتشار غير المتوازن تسمح بمقارنة معدلات الانتشار في الوقت الحقيقي بين مختلف العاهرات. كما تنتشر المخدرات من خلال المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف، وجود التفاعلات ملزمة يمكن أن تغير إلى حد كبير معدلات الانتشار. عندما تكون التفاعلات الملزمة موجودة بين الأدوية ومصفوفة الغضاريف ، يتم تعريفها على أنها الناشرة الفعالة (DEFF). في هذه الحالة، مرة واحدة وقد تم شغل جميع المواقع ملزمة، ويخضع معدل انتشار المخدرات من قبل انتشار ثابت الدولة (DSS). المقارنة بين DEFF من مذاب مختلفة يحدد قوة الربط النسبية من solutes مع المصفوفة. بالنسبة لملذاب معين، إذا كان DEFF وDSS ضمن نفس الترتيب من الحجم، فإنه يعني أن هناك الحد الأدنى من الربط الحالي بين المخدرات والمصفوفة أثناء الانتشار. ومع ذلك، إذا كان DEFF أكبر من DSS، فإن الربط الكبير للجسيمات إلى المصفوفة موجود.
التجارب المصممة تسمح بشكل فردي لتوصيف النقل المذاب من خلال الغضاريف ، ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحليل شامل شامل لجميع النتائج لتصميم ناقل مخدرات مشحون على النحو الأمثل. تتحكم الطبيعة الضعيفة والقابلة للعكس في تفاعلات الشحن في معدل انتشار الجسيمات وتسمح باستخلاص توازن عالي واختراق العمق الكامل السريع من خلال الغضاريف. ومن خلال تجارب امتصاص التوازن، ينبغي أن نبحث عن حاملات تظهر درجة عالية من الإقبال نتيجة لتفاعلات الشحن التي يمكن التحقق منها باستخدام دراسات معدل الانتشار غير المتوازن. ومع ذلك، ينبغي أن تكون هذه التفاعلات ملزمة ضعيفة وعكسها في الطبيعة للسماح لاختراق كامل سمك من المنقلب من خلال الغضاريف. الناقل المثالي للمخدرات تمتلك تهمة الأمثل الذي يتيح قوية بما فيه الكفاية ملزمة لامتصاص وارتفاع داخل الغضاريف المخدرات التركيزات، ولكن ليس قوية جدا لعرقلة نشر كامل سمك4. وستساعد التجارب المعروضة في خصائص تصميم الأنسجة القائمة على الرسوم التي تستهدف حاملي المخدرات. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لتميز نقل الحزب الشيوعى الصينى من خلالالغضروف 4، ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه على مجموعة متنوعة من المخدرات وحاملي المخدرات من خلال الغضاريف وغيرها من الأنسجة المشحونة سلبا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقات الجامعة لإجراء التجارب على الأنسجة الميتة. تم الحصول على مفاصل الأبقار تجاريا من المسلخ.
1- استخراج الغضاريف
- باستخدام مشرط (#10 شفرة)، وقطع وإزالة الدهون والعضلات والأربطة والأوتار وجميع الأنسجة الضامة الأخرى لفضح الغضروف من الأخدود فيموروباتيلار من مفاصل الركبة البقرية.
- باستخدام 3 مم و 6 ملم اللكمات الجلدية، وجعل اللكمات عمودي في الغضاريف لاستخراج المقابس أسطواني. ضع على الفور المقابس في الآبار الفردية من لوحة 48 بئرًا تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الفوسفات الاحتياطي 1x (PBS) المكملة بنسبة 1٪ v/v مضاد للمضادات الحيوية.
- وضع الجانب السطحي من المكونات الغضروف التي تواجهها إلى أسفل إلى بئر في لاعبا اساسيا تشريح (الشكل 2). باستخدام شفرة حلاقة، شريحة المكونات على طول سطح لاعبا اساسيا تقطيع للحصول على explant غضروف سميكة 1 مم التي تشمل المنطقة السطحية. كرر كل غضروف المكونات.
- غضروف التخزين explants بشكل فردي في أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 1X PBS تكملها مثبطات البروتياز (PBS-PI, 1 PI مصغرة قرص لكل 50 مل 1X PBS) في -20 درجة مئوية.
- قبل إجراء كل من تجارب النقل التالية، اذيب القنينات التي تحتوي على explant لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
الشكل 2: مصممة خصيصا fixture تقطيع. المعلمات تصميم الفولاذ المقاوم للصدأ تشريح لاعبا اساسيا تستخدم لتشريح explants الغضروف من 3 و 6 ملم القطر. تم وضع إدراجات بلاستيكية ذات سمك متفاوت داخل الآبار لضبط سمك explants شرائح. تم استخدام دبوس أسطواني الفولاذ المقاوم للصدأ من < 1 مم القطر لدفع explant للخروج من لاعبا اساسيا. يتم عرض جميع القيم العددية في مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2- اتقم توازن انكماش الانبعاثات الكيميائية في الغضاريف
- الداب بلطف explantage (3 مم dia. X 1 مم سميكة.) مع مسح مهمة حساسة لإزالة برنامج تلفزيوني 1X الزائدة من سطح explant. باستخدام التوازن، سجل بسرعة الوزن الرطب لكل explant ثم وضع على الفور في حمام برنامج تلفزيوني 1x لمنع الجفاف.
- إعداد 30 μM الحلول (300 ميكرولتر لكل explant) من الفلورسنت المسمى CPCs في 1x PBS-PI. استخدام أنابيب البولي بروبلين الخالية من RNase لإعادة تشكيلها.
- في لوحة 96-well، ماصة 300 ميكرولتر من كل 30 ميكرومتر الحل في آبار منفصلة. تجنب استخدام الآبار بالقرب من حافة الصفيحة لمنع التبخر. باستخدام ملعقة، نقل كل explant إلى الحل الذي يحتوي على الآبار.
- املأ الآبار المحيطة بـ 300 ميكرولتر من 1x PBS واغطي لوحة البئر بالغطاء. ختم حواف لوحة مع فيلم مرنة للحد من التبخر.
- داخل حاضنة 37 درجة مئوية، ضع اللوحة على لوحة شاكر للحد من ترسيب الجسيمات. احتضان لمدة 24 ساعة تحت تناوب لطيف (50 دورة في الدقيقة مع مدار 15 ملم) للسماح باستيعاب التوازن من CPCs في الغضاريف(الشكل 3).
- إنشاء منحنى قياسي للارتباط من الفلوريسكين لتركيز CPC
- إعداد التخفيفات التسلسلية من حلول CPC من 30 ميكرومتر – 0 μM (10 2 أضعاف التخفيف) في 1x PBS-PI في أنابيب البولي بروبلين. تأكد من وجود ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من كل تخفيف.
- أضف 200 ميكرولتر من كل تخفيف إلى آبار متتالية في لوحة سوداء 96 بئرًا. مكررة في صف آخر لزيادة حجم العينة.
- الحصول على قراءات الفلوريسنس لكل عينة باستخدام قارئ لوحة في الإثارة والطول الموجي للانبعاثات من التسمية الفلورية باستخدام قارئ لوحة.
- رسم قراءة الفلوريسين مقابل تركيز CPC واستمد معادلة للجزء الخطي من المنحنى.
ملاحظة: للحد من التغير في قراءات الفلوريسين، احتضان حل الأسهم CPC في ظل نفس الظروف مثل لوحة العينة قبل توليد المنحنى القياسي.
- بعد 24 ساعة من الحضانة، وجمع حمام التوازن من كل بئر في أنابيب البولي بروبلين منفصلة.
- نقل 200 ميكرولتر من كل حل إلى آبار منفصلة من لوحة سوداء 96-جيدا. الحصول على قراءات الفلوريسنس لكل عينة تحت نفس إعدادات الفلورسنت كما هو الحال بالنسبة للمنحنى القياسي. إذا لزم الأمر، قم بتخفيف العينة في 1x PBS-PI لضمان أن القراءات تقع ضمن الجزء الخطي من المنحنى القياسي.
الشكل 3: التخطيطي لتجارب امتصاص التوازن. وضعت explants الغضاريف (3 مم dia. x 1 مم) في آبار الأفراد في لوحة 96-well تحتوي على حل CPC الموسومة بالفلورسنت. بعد 24 تم upence ح تم upence بواسطة الغضاريف، وبالتالي تقليل الفلورس من الحمام المحيطة بها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. عمق اختراق CPCs في الغضاريف
- إعداد 30 μM الحلول (300 ميكرولتر لكل explant) من الفلورسنت المسمى CPCs في 1x PBS-PI. استخدام أنابيب البولي بروبلين الخالية من RNase لإعادة تشكيلها.
- باستخدام مشرط، وقطع explants الغضروف (6 مم قطرها × 1 مم سمك) في النصف لجعل نصف الأقراص. حافظ على رطوبة explant مع طبقة من 1x PBS-PI أثناء القطع.
- الغراء explant نصف القرص في منتصف بئر واحدة من غرفة النقل 1-الأبعاد المصممة خصيصا باستخدام الايبوكسي(الشكل 4، الشكل 5). ضمان تطبيق الايبوكسي على الجانب المحيطي (المنحني) من explant. إزالة الغراء الزائد من البئر لمنع الاتصال مع منطقة سطح الانتشار للغضاريف وتقديم مذكرة من الجانب السطحي من explant.
- إضافة 80 ميكرولتر من 1X PBS-PI إلى كلا الجانبين من explant. الماصات السائل صعودا وهبوطا من جانب واحد من explant للتحقق من تسرب إلى الجانب الآخر. إذا حدث تسرب، إعادة تعديل explant وتطبيق الايبوكسي حسب الحاجة.
- استبدل 1x PBS-PI من الجانب الذي يواجه السطح السطحي للغضاريف (المنبع) بـ 80 ميكرولتر من محلول CPC 30 ميكرومتر. الحفاظ على 80 ميكرولتر من 1x PBS-PI على الجانب الذي يواجه المنطقة العميقة من الغضاريف (المصب).
- ضع غرفة النقل بعناية في حاوية قابلة للغطاء. تغطية قاعدة من الحاوية مع طبقة 1X برنامج تلفزيوني لتجنب تبخر الحلول. تأكد من عدم وجود اتصال مباشر بين الحلول من غرف المنبع والمصب.
- ضع الحاوية المغطاة على لوحة شاكر للحد من ترسيب الجسيمات. احتضان إما 4 أو 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت تناوب لطيف (50 دورة في الدقيقة مع مدار 15 ملم).
- بعد الحضانة، وإزالة explant من الغرفة وقطع ~ 100 μm شريحة من وسط explant.
ملاحظة: هذا المقطع عرضية شاملة من المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف. - ضع الشريحة بين شريحة زجاجية وأغطية. هيدرات شريحة مع طبقة من 1x PBS-PI.
- في التكبير 10x، صورة من خلال سمك كامل من شريحة للحصول على z-كومة من الصور الفلورية باستخدام المجهر confocal.
- باستخدام مشروع ImageJ متوسط كثافة الصور داخل المكدس z لتحديد عمق اختراق CPCs في الغضاريف.
- فتح كومة الصورة عن طريق النقر على ملف | مفتوح.
- انقر على 'صورة' على شريط المهام وانقر على صورة | مداخن | Z المشروع من القائمة المنسدلة.
- إدخال أرقام شريحة من 1 إلى الشريحة النهائية. حدد'متوسط الكثافة'ضمن نوع العرض. انقر على'موافق.'
الشكل 4: غرفة النقل 1-D المصممة خصيصًا. المعلمات تصميم من غرفة النقل PMMA 1D مع 6 آبار فردية. يتم عرض جميع القيم العددية في مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التخطيطي لعمق دراسات الاختراق. تم قطع explants الغضاريف (6 مم قطر × 1 ملم سمك) في النصف وثابتة في مركز 1-D آبار النقل الناشر. تم إضافة حل CPC الموسومة بفلورسنتلي إلى جانب البئر على اتصال بالمنطقة السطحية (SZ) من الغضاريف. 1x PBS-PI تمت إضافتها إلى جانب البئر على اتصال مع المنطقة العميقة (DZ) من الغضاريف. وبعد الانتشار، تم تصوير مقطع عريض من الغضاريف (3 مم × 1 مم) باستخدام المجهر الناثق. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami etal. 4 و Bajpayee etal. 3،يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4- معدل انتشار الانبعاثات غير المتوازنة من اصنـاء الـ CPCs في الغضاريف
- جلب نصفي غرفة النقل المصممة خصيصا (الشكل 6) معا لتجميع وإغلاق الغرفة. استخدام غسالات، والمكسرات والبراغي لإغلاق بإحكام الغرفة مع وجع.
ملاحظة: يجب أن تكون غرفة النقل شفافة لعدم التعارض مع القراءات الفلورية. غرف النقل المستخدمة في هذا البروتوكول مصنوعة من بولي ميثيلميتهاكريلات (PMMA). - معطف المساحة الداخلية للغرفة مع 0.5٪ ث / V حل الحليب البقري غير الدهني في 1X PBS (2 مل لكل غرفة) لمدة 15 دقيقة لمنع ربط غير محددة من CPCs إلى جدران الغرفة. ثم شطف الغرفة مع 1X PBS (2 مل لكل غرفة).
- باستخدام لاعبا اساسيا التقطيع المصممة خصيصا (الشكل 2) وشفرة الحلاقة ، شريحة explant غضروف قطر 6 مم (الطائرة العرضية) إلى سمك 500-800 μm ، بما في ذلك المنطقة السطحية. حافظ على explant رطب مع 1x PBS.
- باستخدام اللكمات التي تحركها المطرقة والجلد، وخلق الحشيات من صفائح مطاطية كما هو مبين في الشكل 7.
- تجميع كل غرفة نصف النقل لتشمل 1 طوقا مطاطيا كبيرا، 1 PMMA إدراج و 1 طوقا مطاطي صغير لكل من. وضع explant في آبار إدراج البلاستيك، مع منطقة سطحية تواجه غرفة المنبع. ساندويتش نصفين معا لإكمال الجمعية والمسمار بإحكام باستخدام وجع (الشكل 7).
- ملء غرفة المنبع مع 2 مل من 1X PBS-PI ومراقبة غرفة المصب لتسرب السوائل من غرفة المنبع. إذا كان التسرب موجودًا ، إعادة تجميع الغرفة ، وتعديل موضع طوقاً وضيق البراغي. إذا لم يكن تسرب، ملء غرفة المصب مع 2 مل 1X PBS-PI كذلك.
- يُضاف بار صغير إلى غرف أعلى وهاب النهر وضع الغرفة على لوحة مقلّد. محاذاة الغرفة بحيث يتم تركيز الليزر من مقياس الطيف الضوئي نحو مركز غرفة المصب. ضع جزء مستقبل الإشارة من مقياس الطيف الضوئي خلف غرفة المصب(الشكل 8).
ملاحظة: يجب أن يكون الليزر والمستلم من مقياس الطيف مجهزة المرشحات المناسبة لإثارة، وتنبعث منها ونقل الإشارات من البروتين المسمى الفلورسنت. حماية غرفة النقل من الضوء باستخدام صندوق أسود أثناء التجريب لتجنب التداخل في إشارة الفلوريسنس. ومن أفضل الممارسات لختم فتحات على رأس الغرفة مع فيلم مرنة لتجنب التبخر. - جمع في الوقت الحقيقي قراءات الانبعاثات الفلورية المصبّيّة وضمان إشارة مستقرة لمدة 5 دقائق على الأقل.
ملاحظة: يمكن الحصول على Aliquots من غرفة المصب وتقييمها لفلوريسنس باستخدام قارئ لوحة إذا لم يتوفر مقياس الطيف أو غرفة النقل الشفافة المصممة خصيصًا. - Pipette حجم محتسب مسبقا من محلول المخزون من الفلورسنت الموسومة CPCs في غرفة المنبع لضمان تركيز نهائي من 3 μM داخل غرفة المنبع. مراقبة إشارة المصب fluorescence والسماح للنقل المذاب للوصول إلى زيادة مطردة في المنحدر.
ملاحظة: سوف explant الغضروف سمكا تتطلب وقتا أطول للوصول إلى حالة ثابتة. - بمجرد أن يتم الوصول إلى حالة ثابتة، خذ 20 ميكرولتر من غرفة المنبع وأضيف إلى غرفة المصب ("اختبار الارتفاع").
ملاحظة: سيتم ملاحظة ارتفاع في الفلورس المصب. وهذا سيسمح للارتباط بين قراءات الفلوريسنس وتركيزات الـ CPC. - جمع قراءات الفلورانس في الوقت الحقيقي.
الشكل 6: غرفة نقل غير متوازنة مصممة خصيصاً. المعلمات تصميم من PMMA غير التوازن في نقل غرفة. يجب أن تكون الغرفة شفافة لعدم التدخل في قراءات الفلوريسنس. وتألفت غرفة النقل كاملة من نصفين متطابقة من لاعبا اساسيا هو مبين. وكان هناك حاجة إلى اثنين من دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ أسطواني (~ 2.94 ملم قطر، ~ 18 مم طويلة) لضمان المحاذاة والإغلاق الكامل لنصفي الغرفة. وأدلت أربع فتحات متطابقة ل6-32 مسامير الموضوع في كل ركن من أركان الغرفة لتجميع ضيق المسمار. يتم عرض جميع القيم العددية في ملليمتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: غرفة نقل غير اتزانية غير مُزَوّرة. المعلمات تصميم (A) إدراج PMMA أسود و (B) حشيات مطاطية كبيرة وصغيرة. تم تعديل سمك الحشيات المطاطية لضمان الإغلاق المحكم للغرفة. يتم عرض جميع القيم العددية في mm. (C) التخطيطي تبين ترتيب التجمع لاثنين من نصفي غرفة النقل مع extilage وضعت في المركز. يشير SZ إلى منطقة سطحية من الغضاريف التي كانت تواجه غرفة المنبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التخطيط لتجارب الانتشار غير المتوازن. وضعت explants الغضروف (6 مم قطر × 1 مم سمك) في وسط غرفة النقل مع سطح سطحية تواجه غرفة المنبع. تم ملء كلا الجانبين صعودا وهبوطا من الغرفة مع 1x PBS-PI ومختلطة باستخدام شريط ضجة مصغرة. مع ليزر وأشار نحو غرفة المصب لجمع قراءات الفلورسنت، تم إضافة حل CPC الموسومة الفلورية إلى غرفة المنبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد امتصاص التوازن من CPCs عن طريق الغضاريف، وفلورية الحمام يقلل عندما تم upute upute من الأنسجة. ومع ذلك، إذا كانت قيمة الفلوريسنس من الحمام النهائي لا تزال مماثلة للاولى، فإنه يشير إلى أنه لا يوجد أي /الحد الأدنى من امتصاص المذاب. تأكيد آخر من امتصاص مذاب هو إذا كان النسيج قد تغير اللون بشكل واضح إلى لون الصبغة الفلورية. تم تحديد الامتصاص الكمي للسولات في الغضاريف باستخدام نسبة الامتصاص (RU)بعد تحويل قيم الفلورس إلى تركيز باستخدام المنحنى القياسي. باستخدام تركيز الحمام الأولي (CBath,i)وتركيز حمام التوازن (CBath)،تم حساب تركيز المذاب داخل الغضاريف (Cالغضاريف)على النحو التالي حيث VBath= 300 ميكرولتر:
باستخدامC الغضاريف وCBath، تم تحديد نسبة الامتصاص باستخدام المعادلة أدناه.
تشير القيم >>1 إلى زيادة الإقبال بسبب تفاعلات الشحن، بينما تشير القيم <1 إلى انخفاض الإقبال. على سبيل المثال، أظهرت النوبات الكبيرة المحايدة مثل نيوترافيدين (60 كيلو Da، pI 7) RU< 1 بسبب إعاقة الغضاريف معمصفوفة الغضاريف 1، في حين يتوقع أن تظهر النوبات الصغيرة المحايدة RU~1 ، لأنها قادرة على الانتشار في الغضاريف ، والوصول إلى التوازن. في المقابل، وقد أظهرت Avidin (PI 10.5)، النظير المشحون إيجابيا من نيوترافيدين، Rيو~ 180 في الغضاريف1. علاوة على ذلك، صغيرة الحجم CPCs (~ 2.5-4 كيلوDa) تظهر RU تصل إلى 4004. وكما هو مبين في الشكل 9،أظهرت نسب الاستيعاب استجابة تعتمد على الشحن4.
الشكل 9: النتائج التمثيلية لتوازن امتصاص اِمتصاصات ا لCPCs في الغضاريف. كشفت CPCs من الشحن الصافي المتغيّر (+8 و+14 و+20) ونسب امتصاصها في الغضاريف أن الامتصاص لا يزيد بشكل رتّب مع زيادة الشحن. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami et al.4الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في حالة الفلوريسنس من الحمام قد زادت بعد التوصل إلى التوازن, وهذا من شأنه أن يشير إلى أن تركيز الحمام الأولي من المذاب الموسومة الفلورسنت كان مرتفعا جدا. وهذا من شأنه أن يسبب الانبعاثات لتكون محاصرة داخل الحل بعد الإثارة عن طريق قارئ لوحة. لحل هذه المشكلة، خفض تركيز الحمام الأولي.
بعد التصوير confocal، تم إنتاج كومة من الصور مع كل صورة تبين عمق اختراق CPCs الموسومة الفلورية في طبقات مختلفة من الغضاريف. وأظهرت الصورة التي تم الحصول عليها من وسط explant الغضاريف عمق أبعد من الاختراق مقارنة مع أي صورة أخرى في جميع أنحاء سمك explant. باستخدام برنامج مثل ImageJ ، تم تراكب كومة من الصور لإنتاج صورة واحدة تعرض متوسط كثافة اختراق CPC. وقدمت هذه الصور المتراكبة أفضل مقارنة للعمق العام للاختراق بين ناقلات المخدرات المشحونة بشكل مختلف. ولوحظت استجابة تعتمد على الشحنة بالنسبة لـ CPCs داخل الأنسجة(الشكل 10). لن تخترق شركات النقل الكبيرة المشحونة بشكل محايد (على سبيل المثال، نيوترافيدين) أبعد بكثير من المنطقة السطحية لأنها تفتقر إلى القدرة على استخدام تفاعلات الشحن للحث على الربط مع المصفوفة1. وبالمثل، فإن الشحنة الموجبة المرتفعة جداً ستقتصر على المنطقة السطحية (كما يظهر في التصنيف المركزي للمنتجات +20 حتى بعد 24 ساعة)4،إلا أن هذا نتيجة لأن الناقل مقيد بقوة كبيرة بالمصفوفة؛ هم غير قادرين على إلغاء ربط من هدفهم الأولي. غير أن الناقلة للمخدرات المشحونة على النحو الأمثل ستكون قادرة على اختراق المناطق العميقة من الغضاريف لأنها يمكن أن تستفيد من الطبيعة الضعيفة وعكسها من التفاعلات الكهروستاتيكية (كما هو مبين من قبل CPC +14)4. وهذا يسمح للناقل بربط هدفه الأولي، غير ملزم للتحرك أعمق من خلال المصفوفة، ومن ثم ربط مرة أخرى إلى أهداف أخرى داخل الأنسجة. على سبيل المثال، Avidin (~ 7 نانومتر قطر، 66 كيلو Da، PI 10.5) ملزمة مع المصفوفة المشحونة سلبا غليكوسومينوغلوليكانس (GAGs) لديها ثابت تفكك (KD)من 150 μM، والتي كانت تعتبر ضعيفة بما فيه الكفاية لتمكين الربط عكس اللازمة لاختراق سمك كامل1. على الرغم من ضعف الربط، أظهر Avidin احتباساً وامتصاصاً عالياً في الغضاريف بسبب وجود كثافة عالية من الـ GAGs المشحونة بشكل سلبي (كثافة الربط NT = 2900 ميكرومتر)1. علاوة على ذلك ، كما هو موضح في CPC + 8 ، كان اختراق السمك الكامل مرئيًا في غضون 4 ساعات ، في حين أن CPC + 14 يتطلب 24 ساعة للوصول إلى العمق الكامل4. وهكذا، ينبغي اختيار نقاط زمنية متعددة لمقارنة فعالة معدل solutes مختلفة في اختراق سماكة الأنسجة. للحصول على فهم أكثر كميا لعمق الاختراق، يمكن الحصول على الكثافة النسبية لل solutes على طول سمك الأنسجة باستخدام ImageJ.
الشكل 10: نتائج تمثيلية من عمق دراسات الاختراق في الغضاريف. CPCs من تهمة صافي متفاوتة (+8، +14 و +20) وعمق كل منهما من الاختراق من خلال الغضاريف كشفت ضعف عكس ملزمة كما رأينا من قبل CPC + 8 وCP + 14 هو المفتاح لاختراق العمق الكامل. ومع ذلك، فإن الربط القوي للغاية كما هو مُرى بالنسبة لـ CPC+20 أعاق اختراق السمك الكامل. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami et al.4الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
إذا لم تلاحظ إشارة الفلورسنت داخل الغضروف أثناء التصوير، يمكن وجود مسألتين؛ إما أن المنطقة السطحية للنشر قد سدت بواسطة الايبوكسي، أو أن تركيز الاستحمام الأولي كان منخفضاً جداً بحيث لا يمكن إنتاج إشارة فلورية. لإصلاح هذه القضايا، إزالة الايبوكسي الزائدة من أسطح الغضاريف وزيادة تركيز المنهمك.
وأسفرت تجارب النقل غير المتوازنة عن منحنى كما هو مبين في الشكل 11. يمثل الجزء الأولي من المنحنى الانتشار المذاب من خلال الغضاريف حيث يتم إجراء تفاعلات ملزمة للمصفوفة المذابة. مع زيادة الشحن من الناقل، وقعت أقوى مصفوفة ملزمة التي سوف تؤدي إلى وقت أطول ل solutes للوصول إلى غرفة المصب. مرة واحدة solutes اختراق من خلال عمق الغضروف ووصلت إلى غرفة المصب، لوحظ زيادة في منحدر المنحنى كما زادت قراءة الفلوريس مع مرور الوقت. هذا الجزء الثاني من المنحنى وصل إلى منحدر ثابت ، يمثل انتشار ثابت الحالة. تم رسم خط عرضي عند المنحدر الثابت لتحديد الوقت الذي يستغرقه الوصول إلى الانتشار الثابت (τlag)، الذي يتميز بتقاطع x. تم حساب الانتشار الفعال (DEFF)، ومعدل انتشار CPCs أثناء وجود تفاعلات ملزمة موجودة في الغضاريف ، باستخدامτ lag وسمك explant (L) على النحو التالي:
وبعد نقل 20 ميكرولتر من المحلول من غرفة المنبع إلى غرفة المصب، لوحظ ارتفاع في الفلوريسكين؛ واستخدمت شدة الفلورس المستقرة الناتجة عن ذلك للارتباط بالتركيز. ثم تم رسم تركيز ا لCPCs في المصب (CD)تطبيع إلى تركيز المنبع (CU)ضد الزمن. تم استخدام منحدر هذا المنحنى لتقدير معدل الانتشار الثابت عند شغل جميع مواقع الربط في الغضاريف (DSS)كما هو موضح أدناه. هذه القيمة شاملة معامل التقسيم. هنا, VD و A تمثل المسامية الغضروف (~0.8), حجم غرفة المصب (2 مل) ومنطقة المقطعية العرضية للغضاريف (0.1257 سم2),على التوالي. ويمكن الاطلاع على قيم الممثل DEFF وDSS المحسوبة من تجارب النقل غير المتوازنة للبلدان الناطقة بالتكييف في الجدول 1.
الشكل 11: نتائج تمثيلية من دراسات الانتشار غير المتوازنة عبر الغضاريف. CPC + 8 منحنى الانتشار، رسمها كما تركيز المصب (CD)تطبيع إلى تركيز المنبع (CU)،مع الزمن. خط عرضية مرسومة عند المنحدر ثابت الحالة (الأزرق) يعبر المحور x فيτ lag، والذي كان يستخدم لحساب DEFF. تم استخدام ميل المماس لحسابD SS. يمثل اختبار الارتفاع (الرمادي) التركيز المستقر في غرفة المصب بعد نقل محلول CPC 20 ميكرولتر من المنبع إلى المصب، المستخدم لتطبيع تركيز المصب. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami et al.4الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
إذا فشل الفلورس المصب في الاستقرار قبل إضافة الببتيد الفلورسنت الموسومة إلى غرفة المنبع، فمن المرجح أن هناك بقايا مذاب عالقة على الجدران من تجربة سابقة. في هذه الحالة، تفكيك الغرفة وغسل مع الصابون و sonicate. وإذا كانت هناك زيادة في الفلور المصب مباشرة بعد إضافة الببتيد الموسوم بالفلور إلى غرفة المنبع، فإن هذا يمكن أن يشير إلى وجود تسرب. وهذا يتطلب إعادة تجميع غرفة النقل وإعادة اختبار التسريبات. إذا وصلت إشارة الفلور المصب إلى هضبة بدلاً من زيادة ثابتة ، فإنها تشير إلى فقدان محتمل للتركيز في غرفة المنبع ، على الأرجح بسبب التمسك بالسولوتات على جدران الغرفة. إضافة 0.005٪ ث / الخامس الألبومين مصل البقر (BSA) إلى غرفة المنبع يمكن أن تساعد في منع الالتصاق.
| الحزب الشيوعي الصيني | DEFF (سم2/ s) | DSS (سم2/ ق) |
| CPC +8 | 1.7 ± 0.4 × 10-7 | 5.8 ± 0.0 × 10-5 |
| CPC +14 | 9.8 ± 0.2 × 10-8 | 2.6 ± 1.2 × 10-5 |
| CPC +20 | 4.7 ± 0.1 × 10-8 | 1.4 ± 0.9 × 10-5 |
الجدول 1: الممثل DEFF و DSS قيم لنقل CPC عبر الغضروف. تم تعديل هذا الجدول من Vedadghavami etal. 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
10- إن الأساليب والبروتوكولات المذكورة هنا هامة في مجال تسليم الأدوية المستهدفة للأنسجة المشحونة سلباً. بسبب الكثافة العالية لل aggrecans المشحونة سلبا الموجودة في هذه الأنسجة، يتم إنشاء حاجز، وبالتالي منع الأدوية من الوصول إلى مواقعها المستهدفة الخلوية التي تقع في عمق المصفوفة. للتصدي لهذا التحدي المعلق، يمكن تعديل الأدوية لدمج ناقلات المخدرات المشحونة بشكل إيجابي والتي يمكن أن تعزز معدل نقل، الامتصاص والتجليد من المخدرات داخل الأنسجة1،,3،,4،,14،,15،,16،,17،,18،,19. وكما هو مبين هنا مع الأساليب المتقدمة، يمكن أن يوصف نقل حاملي المخدرات المشحونين بشكل إيجابي بأنه يحدد مدى الامتصاص بالتوازن وعمق الاختراق ومعدل الانتشار غير المتوازن. لقد قمنا بتصميم بنجاح ثلاثة الاجهزة التجريبية منفصلة التي يمكن استخدامها لتقييم النقل من خلال explants الغضاريف.
10- وفيما يتعلق بالتوصيف الناجح للنقل، يلزم اتباع خطوات حاسمة في هذا الإجراء. استخدام مثبطات البروتياز (PIs) في جميع الحلول أمر بالغ الأهمية لصف بدقة داخل الغضاريف نقل من غضروف من خلال الغضروف لأنها تعمل على منع الهضم الأنزيمي للبروتينات في الأنسجة20. لذلك، إذا لم تستخدم، يمكن أن تبدأ مكونات مصفوفة الغضاريف مثل aggrecans والكولاجين في التحلل وافرز في الحمام المحيط أثناء التجريب. وهذا يمكن أن يقلل كثيرا من FCD من الغضاريف, تقليل عدد مواقع الربط القائم على رسوم في مصفوفة الغضاريف. لن يكون النسيج الناتج ممثلًا للغضاريف السليمة. وعلى العكس من ذلك، يمكن أيضا أن التجارب المقدمة يمكن استخدامها لتقييم نقل CPCs من خلال الغضروف المفصلي حيث محتوى aggrecan هو أقل بكثير كما رأينا فيOA 20. باستخدام التربسين أو Chondroitinase ABC لهضم explants الغضروف، يمكن السيطرة على كثافة aggrecan، مما يسمح لتقييم النقل وتسليم الأدوية في حالة المرض. في هذه الحالة، قد يتعرض الربط القائم على الشحن للخطر، في حين أن أنواع أخرى من التفاعلات مثل روابط الهيدروجين والتفاعلات المائية تعزز بشكل تعاوني ربط داخل الغضاريف والاحتفاظبها 4.
الحفاظ على ترطيب الغضاريف هو المفتاح أثناء إعداد العينة والتجريب. وقد تبين الجفاف عن طريق التعرض للهواء لأكثر من 6 دقائق للحث على ضرر لا رجعة فيه للغضاريف المفصلية21. ونتيجة لذلك، قد تحدث تغييرات غير متوقعة في نقل CPCs. وبالمثل، يمكن أن يؤدي تبخر حمامات CPC إلى جفاف الاكزاب؛ هذا يستطيع كنت منعت بختم مع فيلم مرن. ومع ذلك، يمكن أن التبخر حمام لا يسبب فقط الجفاف explant، ولكن يمكن أن يسبب أيضا تغيير في تركيز حمام CPC، مما أدى إلى قراءات الفلورسنت كاذبة. وعلاوة على ذلك من المهم أن نلاحظ أن عمق دراسات الاختراق تتطلب مقاطع عرضية رقيقة (~ 100 μM) من الغضاريف ليتم تصويرها. هذه هي تقنية التي تتطلب ممارسة بحيث يمكن الحصول على شرائح من سمك موحد. ومن الأهمية بمكان أيضا بالنسبة لتجارب الانتشار غير المتوازن أن تكون غرفة النقل شفافة بحيث يمكن الحصول على قياسات الفلورية في الوقت الحقيقي باستخدام مقياس الطيفي المصمم حسب الطلب. ومع ذلك ، كبديل ، يمكن الحصول على aliquots من غرفة المصب وتقييمها لفلوريسنس باستخدام قارئ لوحة أو قارئ الطيفي الأخرى.
الطرق المعروضة هنا ذات أهمية كبيرة لأنها توفر طريقة على نطاق مقاعد البدلاء لتميز نقل الناقلين للمخدرات من خلال الغضروف من أجل التنبؤ بشكل أفضل في احتباس المخدرات الحية والفعالية البيولوجية على المدى الطويل. في الآونة الأخيرة، تم تنفيذ إطار عنصر محدود لديناميات السوائل الحاسوبية لقياس النقل المذاب من خلال وسائل الإعلام المسامية22. وقد استخدم Arbabi وآخرون تحليل العناصر المحدودة في تركيبة مع البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من التصوير المقطعي المجهري لقياس معدلات انتشار عامل التباين المشحونة سلبا، ioxaglate فيالغضاريف 23،24. وعلاوة على ذلك، وباستخدام نموذج متعدد المناطق ومتعدد المراحل، تم قياس معاملات انتشار الـ ioxaglate في مناطق مختلفة من الغضاريف مع قياس FCD لكل منطقة. في حين يمكن استخدام التصوير المقطعي المغناطيسي الدقيق فقط مع عوامل التباين ، فإن الإعداد التجريبي يسمح بتوصيف نقل جميع الأدوية وحاملي الأدوية التي يمكن تسميتها بفلورسنت. ومع ذلك، فإن النمذجة الحسابية المتقدمة التي يستخدمها Arbabi وآخرون يوفر تحليلا أكثر شمولا للسلوك النقل المذاب ويمكن تطبيقها على أساليبنا التجريبية13،24.
ومن القيود المفروضة على الطريقة المعروضة أن الإعداد التجريبي لكل تجربة نقل مذابة لا يشمل تماما بيئة vivo. لا تتم محاكاة الردود البيولوجية والقوى الميكانيكية والديناميكية التي تحدث داخل المفصل الطبيعي هنا. لدمج هذه القوى، يمكن تعديل غرفة النقل مع مكبس لمحاكاة أنماط التدفق الحملي التي تحدث أثناء الأنشطة كما المشي والجري. ومع ذلك، في حين يمكن أن يزيد تدفق الحملات الحملية امتصاص 2-أضعاف، امتصاص بسبب التفاعلات الكهربائية الساكنة يمكن أن تزيد 100-400x. وهكذا، فإن الاجهزة التجريبية المقدمة هنا توفر تقديرا جيدا للنقل القائم على الرسوم وامتصاص25. علاوة على ذلك، منذ أن يحتوي مفصل الركبة بشكل طبيعي على السائل الزليلي، يمكن استخدامه في حلول الحمام لتجارب النقل بدلاً من 1x PBS-PI. وتشير التقديرات إلى أن امتصاص الحاملين الموجبة في الغضاريف سينخفض في السائل الزليلي مقارنةً بالسائل الزليلي في 1x PBS بسبب وجود سلاسل الهيالونان مع مجموعات الكربوكسيل المشحونة سلبًا في السائل الزليلي. فمن الممكن أن الناقلين الموجبة ربط تنافسية مع سلاسل الهيالونة من السائل الزليلي بالإضافة إلى GAGs الغضروف. ومع ذلك ، فإن كثافة المجموعات المشحونة بشكل سلبي أعلى بكثير في الغضاريف مقارنة بالسائل الزليلي ، نظرًا لوجود سلاسل هيالونان كاربوكتيلية مشحونة سلبًا وGGs كبريت في الغضاريف15. وهكذا، على الرغم من أن امتصاص في الغضروف في وجود السائل الزليلي سيكون أقل مما كانت عليه في برنامج تلفزيوني 1x، فإنه لا يزال من المتوقع للحفاظ على امتصاص عالية داخل الغضاريف. في الجسم الحي، وقد أظهرت Avidin ارتفاع امتصاص داخل الغضروف في كل من الفئران والأرانب الغضروف في وجود السائل الزليلي16،26. وعلاوة على ذلك، وقد أظهرت Avidin امتصاص عالية والاحتفاظ في الغضاريف تصل إلى 2 أسابيع بعد الحقن داخل المفصل في أرنب الرباط الصليبي الأمامي نموذج27.
استخدام الغضروف البقري في هذا النظام يسمح لتمثيل أكثر دقة من تغلغل المخدرات من خلال الغضاريف نظرا لتشابهه مع الإنسان من حيث سمك (~ 1.5-2 مم)28،29. نقل solutes من خلال الغضاريف يمكن أن تختلف مع سمك; قد تتطلب ناقلات المخدرات تفاعلات أقل ملزمة لاختراق كامل من خلال الفئران أو غضروف الفئران التي هي أرق بكثير، ولكن يمكن أن يعوق بشكل كبير من اختراق أعمق في الغضروف البشري سمكا1. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن هذه التجارب كانت مصممة لتوصيف النقل المنهمك داخل الغضاريف، يمكن تعديل هذه الأساليب وتطبيقها على الأنسجة الأخرى المشحونة سلبا مثل الغضروف المفصلي والقرنية والفكاهة الزجاجية للعين، ونواة اللب من الأقراص الفقرية. منهجيات التجارب المصممة هنا مفيدة حيث يمكن تكييف أبعاد التجهيزات وغرف النقل وفقًا لحجم وأنواع الأنسجة. وتأثير هذه الأساليب واسع الانتشار، لا يقتصر على ناقلي المخدرات فحسب، بل أيضا على تقييم نقل المخدرات والاقترانات بين ناقلي المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع الأمريكية من خلال برامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس (CDMRP) بموجب العقد W81XWH-17-1-0085، والمعهد الوطني للصحة R03 EB025903-1. تم تمويل AV من قبل زمالة عميد كلية الهندسة في جامعة نورث إيسترن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J.
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A.
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
