Summary
Este protocolo determina a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão de não-equilíbrio para portadores de peptídeos cationicos na cartilagem. A caracterização das propriedades de transporte é fundamental para garantir uma resposta biológica eficaz. Esses métodos podem ser aplicados para projetar um portador de drogas com carga ideal para direcionar tecidos carregados negativamente.
Abstract
Vários tecidos carregados negativamente no corpo, como a cartilagem, apresentam uma barreira para o fornecimento de medicamentos direcionados devido à sua alta densidade de aggrecans carregados negativamente e, portanto, requerem métodos de mira melhorados para aumentar sua resposta terapêutica. Como a cartilagem tem uma alta densidade de carga fixa negativa, as drogas podem ser modificadas com portadores de drogas positivamente carregados para tirar proveito das interações eletrostáticas, permitindo um maior transporte de drogas intra-cartilagem. Estudar o transporte de transportadores de drogas é, portanto, crucial para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta biológica. Mostramos o desenho de três experimentos que podem quantificar a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio de portadores de peptídeos cationicos em explantas de cartilagem. Os experimentos de absorção de equilíbrio fornecem uma medida da concentração de soluto dentro da cartilagem em comparação com seu banho circundante, o que é útil para prever o potencial de um portador de drogas no aumento da concentração terapêutica de drogas na cartilagem. Estudos de profundidade de penetração utilizando microscopia confocal permitem a representação visual da difusão soluto 1D da zona superficial para profunda da cartilagem, o que é importante para avaliar se os solutos atingem seus locais de destino matriz e celular. Estudos de taxa de difusão não-equilíbrio utilizando uma câmara de transporte personalizada permitem medir a força das interações de ligação com a matriz tecidual caracterizando as taxas de difusão de solutos fluorescentes rotulados através do tecido; isso é benéfico para projetar portadores de força de ligação ideal com cartilagem. Juntos, os resultados obtidos a partir dos três experimentos de transporte fornecem uma diretriz para projetar portadores de medicamentos com carga ideal que se aproveitam de interações de carga fracas e reversíveis para aplicações de entrega de medicamentos. Estes métodos experimentais também podem ser aplicados para avaliar o transporte de drogas e conjugados portadores de drogas. Além disso, esses métodos podem ser adaptados para uso na segmentação de outros tecidos carregados negativamente, como menisco, córnea e humor vítreo.
Introduction
A entrega de drogas para tecidos carregados negativamente no corpo continua sendo um desafio devido à incapacidade de as drogas penetrarem profundamente no tecido para alcançar os locais-alvo das células e matrizes1. Vários desses tecidos são compostos por aggrecans densamente embalados e carregados negativamente que criam uma alta densidade de carga fixa negativa (FCD)2 dentro do tecido e agem como uma barreira para a entrega da maioria das macromoléculas3,,4. No entanto, com a ajuda de portadores de medicamentos carregados positivamente, essa barreira tecidual carregada negativamente pode ser convertida em um depósito de drogas através de interações de carga eletrostática para entrega sustentada de medicamentos1,,5,,6,7(Figura 1).
Figura 1: Entrega intra cartilagem baseada em carga de CPCs. Injeção intra-articular de CPCs no espaço articular do joelho. Interações eletrostáticas entre CPCs carregados positivamente e grupos aggrecanos carregados negativamente permitem penetração rápida e completa de profundidade através da cartilagem. Este número foi modificado de Vedadghavami et al4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Recentemente, os portadores de peptídeos cáticos de curto comprimento (CPCs) foram projetados com o objetivo de criar pequenos domínios cônicos capazes de realizar terapêuticas de tamanho maior para entrega à cartilagem4carregada negativamente . Para o fornecimento eficaz de medicamentos à cartilagem para o tratamento de doenças prevalentes8,,9 e degenerativas como a osteoartrite (OA)10, é fundamental que as concentrações terapêuticas de drogas penetrem profundamente dentro do tecido, onde a maioria das células de cartilagem (condrócitos)residem 11. Embora existam vários medicamentos potenciais modificados por doenças disponíveis, nenhum deles obteve a aprovação da FDA porque estes são incapazes de atingir efetivamente a cartilagem12,13. Portanto, a avaliação das propriedades de transporte dos transportadores de drogas é necessária para prever a eficácia dos medicamentos na indução de uma resposta terapêutica. Aqui, projetamos três experimentos separados que podem ser utilizados para avaliar a captação de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio dos CPCs4.
Para garantir que haja uma concentração suficiente de medicamentos dentro da cartilagem que possa fornecer uma resposta terapêutica ideal, os experimentos de absorção foram projetados para quantificar a concentração de CPC de equilíbrio na cartilagem4. Neste desenho, seguindo um equilíbrio entre a cartilagem e seu banho circundante, a quantidade total de soluto dentro da cartilagem (vinculada à matriz ou livre) pode ser determinada usando uma razão de absorção. Essa razão é calculada pela normalização da concentração de solutos dentro da cartilagem ao do banho de equilíbrio. Em princípio, solutos neutros, cuja difusão através da cartilagem não é assistida por interações de carga, teriam uma razão de absorção inferior a 1. Por outro lado, solutos cáticos, cujo transporte é aprimorado através de interações eletrostáticas, mostram uma razão de absorção maior que 1. No entanto, como mostrado com os CPCs, o uso de uma carga positiva ideal pode resultar em taxas de absorção muito maiores (superiores a 300)4.
Embora a alta concentração de medicamentos dentro da cartilagem seja importante para alcançar o benefício terapêutico, também é fundamental que as drogas difundam através da espessura total da cartilagem. Portanto, estudos mostrando a profundidade da penetração são necessários para garantir que os medicamentos cheguem fundo dentro da cartilagem para que os locais de matriz e destino celular possam ser alcançados, proporcionando assim uma terapia mais eficaz. Este experimento foi projetado para avaliar a difusão unidirecional de solutos através da cartilagem, simulando a difusão de drogas em cartilagem após injeção intra-articular in vivo. A imagem de fluorescência usando microscopia confocal permite a avaliação da profundidade de penetração na cartilagem. A carga de partículas líquidas desempenha um papel fundamental na moderação de como drogas profundas podem difundir através da matriz. Uma carga líquida ideal baseada em um tecido FCD é necessária para permitir interações de ligação fraca-reversíveis entre partículas cônicas e a matriz tecidual. Isso implica que qualquer interação é fraca o suficiente para que as partículas possam se desassociar da matriz, mas reversível na natureza para que possa se ligar a outro local de ligação de matriz mais profunda dentro do tecido4. Por outro lado, a carga líquida positiva excessiva de uma partícula pode ser prejudicial para a difusão, uma vez que a ligação matricial muito forte impede o descolamento de partículas do local de ligação inicial na zona superficial da cartilagem. Isso resultaria em uma resposta biológica insuficiente, pois a maioria dos locais alvos está profundamente dentro do tecido11.
Para quantificar ainda mais a força das interações de ligação, a análise das taxas de difusão de medicamentos através da cartilagem é vantajosa. Estudos de difusão de não equilíbrio permitem a comparação das taxas de difusão em tempo real entre diferentes solutos. À medida que as drogas se difundem através das zonas superficiais, médias e profundas da cartilagem, a presença de interações de ligação pode alterar muito as taxas de difusão. Quando as interações de ligação estão presentes entre as drogas e a matriz da cartilagem, ela é definida como a difusividade efetiva(D EFF). Neste caso, uma vez ocupados todos os locais vinculantes, a taxa de difusão de medicamentos é regida pela difusão de estado estável(SS). A comparação entre oEFF D de solute diferente determina a força relativa de ligação dos solutos com a matriz. Para um determinado soluto, se o DEFF e dSS estão dentro da mesma ordem de magnitude, implica que há uma ligação mínima presente entre a droga e a matriz durante a difusão. No entanto, seo D EFF for maior que o DSS,existe uma ligação substancial de partículas à matriz.
Os experimentos projetados individualmente permitem a caracterização do transporte soluto através da cartilagem, no entanto, uma análise holística inclusiva de todos os resultados é necessária para projetar um portador de medicamentos com carga ideal. A natureza fraca e reversível das interações de carga controla a taxa de difusão de partículas e permite uma alta absorção de equilíbrio e rápida penetração de profundidade total através da cartilagem. Através de experimentos de captação de equilíbrio, devemos procurar portadores que apresentem alta absorção como resultado de interações de carga que podem ser verificadas por meio de estudos de taxa de difusão de não equilíbrio. No entanto, essas interações de ligação devem ser fracas e reversíveis na natureza para permitir a penetração da espessura total do soluto através da cartilagem. Um portador de drogas ideal possui uma carga ideal que permite uma ligação forte o suficiente para absorção e altas concentrações de drogas intra-cartilagem, mas não muito forte a ponto de impedir a difusão de espessura total4. Os experimentos apresentados auxiliarão nas características de design para os portadores de medicamentos baseados em carga. Esses protocolos foram utilizados para caracterizar o transporte de CPC através da cartilagem4,porém, estes também podem ser aplicados a uma variedade de medicamentos e portadores de drogas através de cartilagem e outros tecidos carregados negativamente.
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Protocol
Foram obtidas aprovações universitárias para a realização dos experimentos com tecidos mortos. As juntas bovinas foram obtidas comercialmente a partir de um matadouro.
1. Extração de explante de cartilagem
- Utilizando um bisturi (#10 lâmina), corte e remova gordura, músculos, ligamentos, tendões e todos os outros tecidos conjuntivos para expor a cartilagem do sulco femoropatelar das articulações do joelho bovino.
- Usando socos dérmicos de 3 mm e 6 mm, faça socos perpendiculares na cartilagem para extrair plugues cilíndricos. Coloque imediatamente os plugues em poços individuais de uma placa de 48 poços contendo 500 μL de 1x de salina tamponada de fosfato (PBS) suplementada com 1% v/v antibiótico-antimíctico.
- Coloque o lado superficial de um plugue de cartilagem voltado para baixo em um poço na luminária de corte(Figura 2). Usando uma lâmina de barbear, corte o plugue ao longo da superfície do aparelho de corte para obter uma explanta de cartilagem de 1 mm de espessura que é inclusiva da zona superficial. Repita para cada tampão de cartilagem.
- Armazene explanagens de cartilagem individualmente em tubos de polipropileno contendo 500 μL de 1x PBS complementados com inibidores de protease (PBS-PI, 1 pi mini-tablet por 50 mL 1x PBS) a -20 °C.
- Antes de realizar cada um dos seguintes experimentos de transporte, descongele os frascos contendo explant por 30 minutos em um banho de água de 37 °C.
Figura 2: Luminária de corte projetada sob medida. Parâmetros de projeto de luminária de corte de aço inoxidável utilizada para cortar explanações de cartilagem de 3 e 6 mm de diâmetro. Inserções plásticas de espessura variada foram colocadas dentro de poços para ajustar a espessura das explantas fatiadas. Pino cilíndrico de aço inoxidável de <1 mm de diâmetro foi usado para empurrar a explanta para fora da fixação. Todos os valores numéricos são apresentados em mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Captação de equilíbrio de CPCs na cartilagem
- Explantas de cartilagem suavemente dab (3 mm dia. X 1 mm de espessura.) com uma delicada limpeza de tarefa para remover o excesso de 1x PBS da superfície da explant. Usando um equilíbrio, registe rapidamente o peso úmido de cada explanta e, em seguida, coloque imediatamente em um banho pbs 1x para evitar a desidratação.
- Prepare 30 soluções μM (300 μL por explant) de CPCs rotulados fluorescentemente em 1x PBS-PI. Use tubos de polipropileno sem RNase para reconstituição.
- Em uma placa de 96 poços, pipeta 300 μL de cada solução CPC de 30 μM em poços separados. Evite usar poços perto da borda da placa para evitar a evaporação. Usando uma espátula, transfira cada explanta para a solução que contém poços.
- Encha os poços circundantes com 300 μL de 1x PBS e cubra a placa do poço com tampa. Sele as bordas da placa com filme flexível para minimizar a evaporação.
- Dentro de uma incubadora de 37 °C, coloque a placa em um agitador de placas para limitar a sedimentação da partícula. Incubar por 24 horas sob rotação suave (50 rpm com órbita de 15 mm) para permitir a absorção de equilíbrio de CPCs na cartilagem(Figura 3).
- Gerar uma curva padrão para correlação de fluorescência à concentração de CPC
- Prepare diluições seriais de soluções CPC a partir de 30 μM – 0 μM (diluições de 10 vezes) em 1x PBS-PI em tubos de polipropileno. Certifique-se de que pelo menos 500 μL de cada diluição esteja presente.
- Adicione 200 μL de cada diluição a poços consecutivos em uma placa preta de 96 poços. Duplicar em outra linha para aumentar o tamanho da amostra.
- Obtenha leituras de fluorescência de cada amostra usando um leitor de placas nos comprimentos de onda de excitação e emissão do rótulo fluorescente usando um leitor de placas.
- Plote a leitura da fluorescência vs. concentração de CPC e deriva uma equação para a porção linear da curva.
NOTA: Para limitar a variabilidade nas leituras de fluorescência, incubar a solução de estoque CPC nas mesmas condições da placa de amostra antes da geração da curva padrão.
- Após 24 h de incubação, colete o banho de equilíbrio de cada poço em tubos separados de polipropileno.
- Transfira 200 μL de cada solução em poços separados de uma placa preta de 96 poços. Obtenha leituras de fluorescência de cada amostra sob as mesmas configurações fluorescentes da curva padrão. Se necessário, dilui a amostra em 1x PBS-PI para garantir que as leituras fiquem dentro da porção linear da curva padrão.
Figura 3: Esquema de experimentos de captação de equilíbrio. Explantas de cartilagem (3 mm dia. x 1 mm de espessura) foram colocadas em poços individuais em uma placa de 96 poços contendo solução CPC marcada fluorescentemente. Após 24h, os CPCs foram tomados pela cartilagem, reduzindo assim a fluorescência do banho circundante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Profundidade de penetração de CPCs na cartilagem
- Prepare 30 soluções μM (300 μL por explant) de CPCs rotulados fluorescentemente em 1x PBS-PI. Use tubos de polipropileno sem RNase para reconstituição.
- Usando um bisturi, corte explants de cartilagem (6 mm de diâmetro x 1 mm de espessura) ao meio para fazer meio discos. Mantenha a explanta hidratada com uma camada de 1x PBS-PI durante o corte.
- Cole uma explanta de meio disco no meio de um poço da câmara de transporte 1-dimensional projetada sob medida usando um epóxi(Figura 4, Figura 5). Certifique-se de que o epóxi seja aplicado no lado circunferencial (curvo) da explant. Remova o excesso de cola do poço para evitar o contato com a superfície de difusão da cartilagem e anote o lado superficial da explanta.
- Adicione 80 μL de 1x PBS-PI aos dois lados da explanta. Pipetar o líquido para cima e para baixo de um lado da explanta para verificar se há vazamento para o outro lado. Se ocorrer vazamento, reajuste e aplique epóxi conforme necessário.
- Substitua o PBS-PI 1x do lado voltado para a superfície superficial da cartilagem (upstream) por 80 μL de solução CPC de 30 μM. Mantenha 80 μL de 1x PBS-PI na lateral voltada para a zona profunda da cartilagem (rio abaixo).
- Coloque cuidadosamente a câmara de transporte em um recipiente de cobertura. Cubra a base do recipiente com uma camada 1x PBS para evitar a evaporação de soluções. Certifique-se de que não há contato direto entre soluções de câmaras a montante e rio abaixo.
- Coloque o recipiente coberto em um agitador de placas para limitar a sedimentação de partículas. Incubar por 4 ou 24 horas em temperatura ambiente sob rotação suave (50 rpm com uma órbita de 15 mm).
- Após a incubação, remova a explanta da câmara e corte ~100 μm fatia do centro da explanta.
NOTA: Esta seção transversal é inclusiva das zonas superficiais, médias e profundas da cartilagem. - Coloque a fatia entre um escorregador de vidro e uma mancha de cobertura. Hidrate a fatia com uma camada de 1x PBS-PI.
- Em 10x de ampliação, imagem através da espessura total da fatia para obter z-stack de imagens fluorescentes usando um microscópio confocal.
- Usando ImageJ projete a intensidade média das imagens dentro da pilha z para determinar a profundidade de penetração dos CPCs na cartilagem.
- Abra a pilha de imagens clicando em Arquivo | Aberto.
- Clique em 'Imagem' na barra de tarefas e clique em Imagem | Pilhas | Projeto Z do menu suspenso.
- Números de fatia de entrada de 1 para a fatia final. Selecione'Intensidade média' em tipo de projeção. Clique em 'OK.'
Figura 4: Câmara de transporte 1D projetada sob medida. Parâmetros de projeto da câmara de transporte PMMA 1D com 6 poços individuais. Todos os valores numéricos são apresentados em mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esquema de profundidade de estudos de penetração. As explantas de cartilagem (6 mm de diâmetro x 1 mm de espessura) foram cortadas ao meio e fixadas ao centro de poços de transporte difusivos 1D. A solução CPC com etiqueta fluorescente foi adicionada ao lado do poço em contato com a zona superficial (SZ) da cartilagem. 1x PBS-PI foi adicionado ao lado do poço em contato com a zona profunda (DZ) da cartilagem. Após a difusão, uma seção transversal da cartilagem (3 mm x 1 mm) foi imageda por meio de microscopia confocal. Este valor foi modificado de Vedadghavami et al.4 e Bajpayee et al.3Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Taxa de difusão não-equilíbrio de CPCs na cartilagem
- Reúna as duas metades da câmara de transporte personalizada(Figura 6)para montar e fechar a câmara. Use arruelas, porcas e parafusos para fechar firmemente a câmara com uma chave inglesa.
NOTA: A câmara de transporte deve ser translúcida para não interferir com leituras fluorescentes. As câmaras de transporte utilizadas neste protocolo são feitas de polimetilmetato (PMMA). - Cubra o espaço interno da câmara com solução de leite bovino não gordo de 0,5% em 1x PBS (2 mL para cada câmara) por 15 min para evitar a vinculação não específica de CPCs às paredes da câmara. Em seguida, enxágue a câmara com 1x PBS (2 mL para cada câmara).
- Usando a luminária de corte personalizada(Figura 2) e uma lâmina de barbear, corte uma explanta de cartilagem de 6 mm de diâmetro (plano transversal) até uma espessura de 500-800 μm, incluindo a zona superficial. Mantenha a explant hidratada com 1x PBS.
- Usando socos dérmicos e perfurados dérmicos, crie juntas a partir de folhas de borracha, como mostrado na Figura 7.
- Monte cada meia câmara de transporte para incluir 1 junta de borracha grande, 1 inserção PMMA e 1 pequena junta de borracha cada. Coloque a explanta nos poços da pastilha plástica, com a zona superficial voltada para a câmara rio acima. Sanduíche as duas metades juntas para completar o conjunto e parafuso firmemente usando uma chave inglesa(Figura 7).
- Encha a câmara upstream com 2 mL de 1x PBS-PI e observe a câmara a jusante para vazamento de fluido da câmara a montante. Se houver vazamento, remonte a câmara, ajustando a posição da junta e o aperto dos parafusos. Se não houver vazamento, encha a câmara a jusante com 2 mL 1x PBS-PI também.
- Adicione uma mini-barra de mexida em câmaras para cima e para baixo e coloque a câmara em uma placa de agitação. Alinhe a câmara para que o laser do espectotômetro esteja focado no centro da câmara a jusante. Coloque a porção do receptor de sinal do espectrofotômetro atrás da câmara a jusante(Figura 8).
NOTA: O laser e o receptor do espectotômetro devem ser equipados com os filtros apropriados para excitar, emitir e transmitir sinais da proteína fluorescentemente rotulada. Proteja a câmara de transporte da luz usando uma caixa preta durante a experimentação para evitar interferências no sinal de fluorescência. É melhor a prática selar as aberturas em cima da câmara com filme flexível para evitar a evaporação. - Colete leituras de emissão de fluorescência a jusante em tempo real e garanta um sinal estável por pelo menos 5 minutos.
NOTA: As alíquotas da câmara a jusante podem ser obtidas e avaliadas para fluorescência usando um leitor de placas se um espectrômetro personalizado ou câmara de transporte translúcida não estiver disponível. - Pipeta um volume pré-calculado de solução de estoque de CPCs fluorescentes marcados na câmara upstream para garantir uma concentração final de 3 μM dentro da câmara upstream. Observe o sinal de fluorescência a jusante e permita que o transporte soluto atinja um aumento constante na inclinação.
NOTA: Uma explanta de cartilagem mais espessa exigirá mais tempo para atingir o estado estável. - Uma vez alcançado o estado estável, pegue 20 μL da câmara upstream e adicione à câmara a jusante ("teste de espigão").
NOTA: Será observado um pico na fluorescência a jusante. Isso permitirá correlação entre leituras de fluorescência e concentração de CPC. - Coletar leituras de fluorescência a jusante em tempo real.
Figura 6: Câmara de transporte de difusão não-equilíbrio projetada sob medida. Parâmetros de projeto da câmara de transporte de difusão de não equilíbrio PMMA. A câmara deve ser translúcida para não interferir nas leituras de fluorescência. A câmara de transporte completa consistia de duas metades idênticas da luminária mostrada. Dois pinos cilíndricos de aço inoxidável (~2,94 mm de diâmetro, ~18 mm de comprimento) foram necessários para garantir o alinhamento e o fechamento completo das metades da câmara. Quatro ranhuras idênticas para parafusos de rosca de 6-32 foram feitas em cada canto da câmara para montagem apertada do parafuso. Todos os valores numéricos são apresentados em milímetros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Montagem da câmara de transporte de difusão de não equilíbrio. Parâmetros de design de (A) pastilhas PMMA pretas e(B) juntas de borracha grandes e pequenas. A espessura das juntas de borracha foi ajustada para garantir o fechamento apertado da câmara. Todos os valores numéricos são apresentados em mm. (C) Esquema mostrando a ordem de montagem para duas metades da câmara de transporte com explanta de cartilagem colocada no centro. SZ indica zona superficial de cartilagem que estava voltada para a câmara rio acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Esquema de experimentos de difusão de não-equilíbrio. Explantas de cartilagem (6 mm de diâmetro x 1 mm de espessura) foram colocadas no centro da câmara de transporte com a superfície superficial voltada para a câmara a montante. Os lados para cima e para baixo da câmara foram preenchidos com 1x PBS-PI e misturados usando uma mini barra de mex. Com um laser apontado para a câmara a jusante para coletar leituras fluorescentes, a solução CPC marcada fluorescentemente foi adicionada à câmara upstream. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Após a absorção de equilíbrio de CPCs por cartilagem, a fluorescência do banho diminui quando o soluto é tomado pelo tecido. No entanto, se o valor da fluorescência do banho final permanecer semelhante ao inicial, indica que não há absorção soluto mínima/mínima. Outra confirmação da absorção de soluto é se o tecido mudou visivelmente de cor para a cor do corante fluorescente. A absorção quantitativa de solutos na cartilagem foi determinada utilizando-se a razão de absorção (RU) após os valores de fluorescência serem convertidos em concentração utilizando a curva padrão. Utilizando-se a concentração inicial do banho (CBath,i) e a concentração de banho de equilíbrio (CBath),a concentração de soluto dentro da cartilagem(C Cartilagem) foi calculada da seguinte forma onde VBath=300 μL:
UtilizandoC Cartilagem eC Bath,a razão de absorção foi determinada utilizando a equação abaixo.
Os valores >>1 indicam uma captação aprimorada devido às interações de carga, enquanto os valores <1 indicam baixa absorção. Por exemplo, solutos maiores e neutros como a Neutravidin (60 kDa, pI 7) mostraram RU<1 devido à dificultação estérica com a matriz de cartilagem1, enquanto solutos menores e neutros são esperados para mostrar RU~1, pois eles são capazes de difundir na cartilagem, atingindo o equilíbrio. Em contraste, Avidin (pI 10.5), a contrapartida positivamente carregada de Neutravidin, mostrou um RU~180 na cartilagem1. Além disso, cpcs de pequeno porte (~2,5-4 kDa) mostram um RU até 4004. Como mostrado pela Figura 9,as razões de absorção mostraram uma resposta dependente da carga4.
Figura 9: Resultados representativos da captação de equilíbrio dos CPCs na cartilagem. CpCs de carga líquida variada (+8, +14 e +20) e suas respectivas razões de absorção na cartilagem revelaram que a absorção não aumenta monotonicamente com o aumento da carga. Esta figura foi modificada de Vedadghavami et al.4Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Caso a fluorescência do banho tenha aumentado após atingir o equilíbrio, isso indicaria que a concentração inicial do banho do soluto fluorescente era muito alta. Isso faria com que a emissão ficasse presa dentro da solução após a excitação via leitor de placas. Para resolver esse problema, diminua a concentração inicial do banho.
Após a imagem confocal, uma pilha de imagens foi produzida com cada imagem mostrando a profundidade de penetração de CPCs fluorescentes marcados em diferentes camadas de cartilagem. A imagem obtida do centro da explanta da cartilagem mostrou a maior profundidade de penetração em comparação com qualquer outra imagem ao longo da espessura da explanta. Usando um software como imagej, a pilha de imagens foi sobreposta para produzir uma imagem exibindo a intensidade média da penetração do CPC. Estas imagens sobrepostas forneceram a melhor comparação da profundidade geral de penetração entre os transportadores de drogas com várias cargas. Observou-se resposta dependente de carga para CPCs dentro do tecido(Figura 10). Grandes transportadores carregados de forma neutra (por exemplo, Neutravidin) não penetrarão muito mais longe do que a zona superficial, pois não têm a capacidade de usar interações de carga para induzir a ligação com a matriz1. Da mesma forma, uma carga positiva muito alta será limitada à zona superficial (como mostrado pelo CPC+20 mesmo após 24 h)4, no entanto, isso é resultado de o portador estar fortemente ligado à matriz; eles são incapazes de desvincular de seu alvo inicial. Um portador de medicamentos com a carga ideal, no entanto, seria capaz de penetrar através das zonas profundas da cartilagem, pois pode tirar proveito da natureza fraca e reversível das interações eletrostáticas (como mostrado pelo CPC+14)4. Isso permite que o portador se ligue ao seu alvo inicial, desvinculado para se mover mais fundo através da matriz, e, em seguida, ligar novamente a alvos mais dentro do tecido. Por exemplo, Avidin (~7 nm de diâmetro, 66 kDa, pI 10.5) vinculante com glicosaminoglycans de matriz carregados negativamente (GAGs) tem uma constante de dissociação (KD) de 150 μM, que foi considerada fraca o suficiente para permitir a ligação reversível necessária para a penetração da espessura total1. Apesar da ligação fraca, a Avidin apresentou alta retenção e absorção na cartilagem devido à presença de alta densidade de GAGs carregados negativamente (Densidade de ligação NT = 2900 μM)1. Além disso, como mostrado pelo CPC+8, a penetração de espessura total era visível dentro de 4h, enquanto o CPC+14 exigia 24h para atingir a profundidade total4. Assim, vários pontos de tempo devem ser escolhidos para comparar efetivamente a taxa de solutos diferentes na espessura do tecido penetrante. Para uma compreensão mais quantitativa da profundidade da penetração, as intensidades relativas dos solutos ao longo da espessura do tecido podem ser obtidas utilizando ImageJ.
Figura 10: Resultado representativo de estudos de profundidade de penetração na cartilagem. CpCs de carga líquida variada (+8, +14 e +20) e sua respectiva profundidade de penetração através da cartilagem revelaram ligação fraca-reversível, como visto pelo CPC+8 e CPC+14 é fundamental para a penetração total da profundidade. No entanto, a ligação muito forte, como visto para o CPC+20, impediu a penetração da espessura total. Esta figura foi modificada de Vedadghavami et al.4Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Se nenhum sinal fluorescente tiver sido observado dentro da cartilagem durante a imagem, dois problemas podem estar presentes; ou a área de superfície para difusão foi bloqueada pelo epóxi, ou a concentração inicial do banho era muito baixa para produzir um sinal fluorescente. Para corrigir esses problemas, remova o excesso de epóxi das superfícies da cartilagem e aumente a concentração de soluto.
Experimentos de transporte de difusão de não equilíbrio resultaram em uma curva como mostrado na Figura 11. A parte inicial da curva representa a difusão soluto através da cartilagem à medida que ocorrem interações de ligação soluto-matriz. Com o aumento da carga da transportadora, ocorreu uma ligação matricial mais forte, o que resultará em um tempo maior para solutos chegarem à câmara a jusante. Uma vez que solutos penetraram através da profundidade da cartilagem e atingiram a câmara a jusante, um aumento na inclinação da curva foi observado à medida que a leitura da fluorescência aumentava ao longo do tempo. Esta segunda parte da curva atingiu uma inclinação constante, representando difusão de estado estável. Uma linha tangencial foi desenhada na encosta de estado estável para determinar o tempo necessário para alcançar a difusão de estado estável (τLag),marcada pelo x-intercept. A difusividade efetiva (DEFF), a taxa de difusão dos CPCs enquanto há interações vinculantes presentes na cartilagem, foi calculada utilizando-se a espessura do lage explant (L) da seguinte forma:
Após a transferência de 20 μL de solução da câmara rio acima para a jusante, observou-se um pico de fluorescência; a intensidade de fluorescência estabilizada resultante foi utilizada para correlação com a concentração. A concentração de CPCs a jusante (CD) normalizada à concentração a montante (CU) foi então plotada contra o tempo. A inclinação desta curva foi utilizada para estimar a taxa de difusão de estado estável quando todos os locais de ligação na cartilagem são ocupados (DSS),como mostrado abaixo. Esse valor foi incluído no coeficiente de particionamento. Aqui, φ, VD e A representam porosidade de cartilagem (~0,8), volume de câmara a jusante (2 mL) e área transversal da cartilagem (0,1257 cm2), respectivamente. Os valores representativosde EFF eD SS calculados a partir de experimentos de transporte sem equilíbrio para CPCs podem ser encontrados na Tabela 1.
Figura 11: Resultados representativos de estudos de difusão de não equilíbrio através da cartilagem. Curva de difusão CPC+8, traçada como a concentração a jusante (CD) normalizada para a concentração a montante (CU),contra o tempo. Uma linha tangencial desenhada na inclinação de estado estável (azul) cruza o eixo x em τLag, que foi usado para calcular DEFF. A inclinação da tangente foi usada para calcular DSS. O teste de espeto (cinza) representa a concentração estabilizada na câmara a jusante após a transferência da solução CPC de 20 μL de rio acima para rio abaixo, usada para normalizar a concentração a jusante. Esta figura foi modificada de Vedadghavami et al.4Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Se a fluorescência a jusante não se estabilizar antes da adição de peptídeo fluorescentemente marcado à câmara a montante, é provável que haja resíduos de soluto presos nas paredes de um experimento anterior. Neste caso, desmonte a câmara e lave com sabão e sonicato. Se houver um aumento da fluorescência a jusante imediatamente após a adição de peptídeo fluorescentemente marcado à câmara upstream, isso pode indicar que o vazamento está presente. Isso exigiria a remontagem da câmara de transporte e o reteste para vazamentos. Se o sinal de fluorescência a jusante atingir um platô em oposição a um aumento de estado estável, indica uma possível perda de concentração na câmara a montante, provavelmente causada por solutos grudados nas paredes da câmara. A adição de 0,005% w/v de gambá bovino albumina (BSA) à câmara upstream pode ajudar a evitar a degola.
| Cpc | DEFF (cm2/s) | DSS (cm2/s) |
| CPC+8 | 1,7 ± 0,4 x 10-7 | 5,8 ± 0,0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9,8 ± 0,2 x 10-8 | 2,6 ± 1,2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4,7 ± 0,1 x 10-8 | 1,4 ± 0,9 x 10-5 |
Tabela 1: Valoresrepresentativos D EFF e DSS para o transporte do CPC através da cartilagem. Esta tabela foi modificada de Vedadghavami et al.4
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Discussion
Os métodos e protocolos descritos aqui são significativos para o campo da entrega de medicamentos direcionados para tecidos carregados negativamente. Devido à alta densidade de aggrecans carregados negativamente presentes nesses tecidos, cria-se uma barreira, impedindo assim que as drogas atinjam seus locais de destino celular que estão no fundo da matriz. Para enfrentar este desafio pendente, os medicamentos podem ser modificados para incorporar portadores de medicamentos carregados positivamente que podem aumentar a taxa de transporte, absorção e vinculação de medicamentos dentro do tecido1,,3,4,14,,15,,16,,17,18,19. Como mostrado aqui com os métodos desenvolvidos, o transporte de transportadores de drogas carregados positivamente pode ser caracterizado para determinar a absorção de equilíbrio, profundidade de penetração e taxa de difusão não-equilíbrio. Projetamos com sucesso três configurações experimentais separadas que podem ser utilizadas para avaliar o transporte através de explants de cartilagem.
Para a caracterização bem sucedida do transporte, é preciso seguir etapas críticas no procedimento. O uso de inibidores de protease (IES) em todas as soluções é fundamental para caracterizar com precisão o transporte intra-cartilagem de CPCs através da cartilagem, pois funcionam para prevenir a digestão enzimática de proteínas no tecido20. Portanto, se não for utilizado, componentes da matriz da cartilagem, como aggrecans e colágeno, podem começar a se degradar e se segregar no banho circundante durante a experimentação. Isso pode diminuir muito o FCD da cartilagem, reduzindo o número de locais de ligação baseados em carga na matriz de cartilagem. O tecido resultante não seria mais representativo da cartilagem saudável. Por outro lado, os experimentos apresentados também podem ser utilizados para avaliar o transporte de CPCs através de cartilagem artrítmicamente onde o teor aggrecano é muito menor como visto em OA20. Utilizando trippsina ou Chondroitinase ABC para digerir explantes de cartilagem, a densidade aggrecana pode ser controlada, permitindo assim a avaliação do transporte e do fornecimento de medicamentos em estado doente. Neste caso, a ligação baseada em carga pode ser comprometida, enquanto outros tipos de interações, como ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas, aumentam sinérgicamente a ligação e retenção intra-cartilagem4.
Manter a hidratação da explanta da cartilagem é a chave durante a preparação e experimentação da amostra. A desidratação via exposição ao ar por mais de 6 minutos tem sido demonstrada para induzir danos irreversíveis à cartilagem articular21. Como resultado, podem ocorrer mudanças inesperadas no transporte de CPCs. Da mesma forma, a evaporação dos banhos de CPC pode resultar em desidratação explant; isso pode ser evitado selando com um filme flexível. No entanto, a evaporação do banho pode não só causar desidratação explant, mas também pode causar uma mudança na concentração de banho do CPC, resultando em falsas leituras fluorescentes. Além disso, é importante notar que a profundidade dos estudos de penetração requerem finas seções transversais (~100 μM) de cartilagem a serem imagens. Esta é uma técnica que requer prática para que fatias de espessura uniforme possam ser obtidas. Também é fundamental para experimentos de difusão de não-equilíbrio, que a câmara de transporte seja translúcida para que medidas de fluorescência em tempo real possam ser obtidas com o espectrômetro projetado sob medida. No entanto, como alternativa, alíquotas da câmara a jusante podem ser obtidas e avaliadas para fluorescência usando um leitor de placas ou outro leitor espectrofotométrico.
Os métodos aqui apresentados são de grande importância, pois fornecem um método de escala de bancada para caracterizar o transporte de portadores de drogas através da cartilagem, a fim de melhor prever a retenção de medicamentos in vivo e a eficácia biológica a longo prazo. Recentemente, foi implementada uma estrutura de elementos finitos para a dinâmica dos fluidos computacionais para medir o transporte de soluto através da mídia porosa22. Arbabi et al. utilizaram análise de elementos finitos em combinação com dados experimentais obtidos a partir de imagens microcibidas para medir as taxas de difusão de agente de contraste carregado negativamente, ioxaglate na cartilagem23,24. Além disso, utilizando-se um modelo multi-zona, multifasico, os coeficientes de difusão de ioxaglate em diferentes zonas de cartilagem foram medidos juntamente com o FCD de cada zona. Embora a imagem micro-CT só possa ser usada com agentes de contraste, nossa configuração experimental permite a caracterização do transporte de todas as drogas e portadores de drogas que podem ser rotulados fluorescentemente. No entanto, a modelagem avançada de computação utilizada por Arbabi et al. fornece uma análise mais abrangente do comportamento do transporte soluto e pode ser aplicada aos nossos métodos experimentais13,24.
Uma limitação do método apresentado é que a configuração experimental para cada experimento de transporte solute não abrange totalmente o ambiente in vivo. Respostas biológicas e forças mecânicas e dinâmicas que ocorrem dentro da articulação natural não são simuladas aqui. Para incorporar essas forças, a câmara de transporte pode ser modificada com um pistão para simular padrões de fluxo convectivo que ocorrem durante as atividades como caminhada e corrida. No entanto, enquanto o fluxo convectivo pode aumentar a absorção em 2 vezes, a absorção devido a interações eletrostáticas pode aumentar 100-400x. Assim, as configurações experimentais aqui apresentadas fornecem uma boa estimativa para o transporte baseado em carga e captação25. Além disso, uma vez que a articulação do joelho contém naturalmente fluido sinovial, pode ser usado nas soluções de banho para experimentos de transporte em vez de 1x PBS-PI. Estima-se que a absorção de portadores cationic na cartilagem diminuiria em fluido sinovial em comparação com em 1x PBS devido à presença de correntes de hialunos com grupos de carboxílados carregados negativamente em fluido sinovial. É possível que os portadores cationic se liguem competitivamente com as cadeias de hialuuronan do fluido sinovial, além dos GAGs da cartilagem. No entanto, a densidade de grupos carregados negativamente é significativamente maior na cartilagem em comparação com o fluido sinovial, devido à presença de ambas as cadeias de hialuronan carboxiladas carregadas negativamente e GAGs sulfatos na cartilagem15. Assim, embora a absorção na cartilagem na presença de fluido sinovial seja menor do que em 1x PBS, ainda é esperado manter alta absorção intra-cartilagem. In vivo, a Avidin mostrou alta absorção intra-cartilagem na cartilagem de ratos e coelhos na presença de fluido sinovial16,26. Além disso, a Avidin tem mostrado alta absorção e retenção na cartilagem até 2 semanas após a injeção intra-articular em um coelhinho anterior modelo de transsseção do ligamento cruzado27.
O uso da cartilagem bovina neste sistema permite uma representação mais precisa da penetração de drogas através da cartilagem devido às suas semelhanças com a cartilagem humana em termos de espessura (~1,5-2 mm)28,29. O transporte de solutos através da cartilagem pode variar de espessura; os portadores de drogas podem exigir menos interações vinculantes para penetrar totalmente através de camundongos ou cartilagem de rato que são muito mais finos, no entanto pode ser significativamente impedido de penetrar mais fundo em cartilagem humana mais espessa1. Além disso, embora esses experimentos tenham sido projetados para caracterizar o transporte soluto dentro da cartilagem, esses métodos podem ser modificados e aplicados a outros tecidos carregados negativamente, como menisco, córnea e humor vítreo do olho, e o núcleo pulposo dos discos intervertebrales. As metodologias de experimentos aqui projetadas são vantajosas, pois as dimensões das luminárias e câmaras de transporte podem ser adaptadas de acordo com o tamanho e espécies do tecido. O impacto desses métodos é generalizado, limitado não só aos portadores de drogas, mas também à avaliação do transporte de drogas e conjugados portadores de drogas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Defesa dos Estados Unidos através dos Programas de Pesquisa Médica Dirigidos pelo Congresso (CDMRP) sob o contrato W81XWH-17-1-0085, e o Instituto Nacional de Saúde R03 EB025903-1. A AV foi financiada pela Faculdade de Engenharia da Universidade do Nordeste.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
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