Summary
Этот протокол определяет равновесное поглощение, глубину проникновения и не равновесную скорость диффузии для катионных носителей пептида в хряще. Характеристика транспортных свойств имеет решающее значение для обеспечения эффективного биологического реагирования. Эти методы могут быть применены для разработки оптимально заряженных носителей наркотиков для ориентации отрицательно заряженных тканей.
Abstract
Несколько отрицательно заряженных тканей в организме, как хрящ, представляют вроде барьера для целевой доставки лекарств из-за их высокой плотности отрицательно заряженных аггреканов и, следовательно, требуют усовершенствованных методов таргетинга для увеличения их терапевтической реакции. Поскольку хрящ имеет высокую отрицательную плотность фиксированного заряда, препараты могут быть изменены с положительно заряженных носителей наркотиков, чтобы воспользоваться электростатических взаимодействий, что позволяет для повышения внутри хряща наркотиков транспорта. Поэтому изучение транспортировки носителей наркотиков имеет решающее значение для прогнозирования эффективности лекарственных средств для индуцирования биологической реакции. Мы показываем дизайн трех экспериментов, которые могут количественно равновесного поглощения, глубины проникновения и не равновесной скорости диффузии катионных пептидных носителей в хряще explants. Эксперименты по поглощению равновесия обеспечивают меру концентрации раствора в хряще по сравнению с окружающей его ванной, что полезно для прогнозирования потенциала носителя препарата в повышении терапевтической концентрации наркотиков в хрящевой ткани. Глубина исследования проникновения с использованием конфокальные микроскопии позволяют визуальное представление 1D растворимой диффузии от поверхностной до глубокой зоны хряща, что важно для оценки того, растворы достигают их матрицы и клеточных целевых участков. Не равновесные исследования скорости диффузии с использованием специально разработанной транспортной камеры позволяет измерять прочность связывающих взаимодействий с матрицей тканей, характеризовав скорость диффузии флуоресцентно помеченных растворов по всей ткани; это полезно для проектирования носителей оптимальной прочности связывания с хрящом. В совокупности результаты трех транспортных экспериментов дают руководство по разработке оптимально заряженных носителей наркотиков, которые используют слабые и обратимые взаимодействия с зарядами для применения лекарственных средств. Эти экспериментальные методы также могут быть применены для оценки транспортировки наркотиков и спряжения носителей наркотиков. Кроме того, эти методы могут быть адаптированы для использования в ориентации других отрицательно заряженных тканей, таких как мениск, роговица и стекловидного юмора.
Introduction
Доставка лекарств в отрицательно заряженные ткани в организме остается проблемой из-за неспособности препаратов проникать глубоко в ткани, чтобы достичь клеток и матрицы целевыхучастков 1. Некоторые из этих тканей состоят из плотно упакованных, отрицательно заряженных аггреканов, которые создают высокую отрицательную плотность фиксированного заряда (FCD)2 в тканях и выступают в качестве барьера для доставки большинства макромолекул3,4. Однако, с помощью положительно заряженных носителей наркотиков, этот отрицательно заряженный барьер ткани действительно может быть преобразован в депо наркотиков через электростатические взаимодействия заряда для устойчивойдоставки наркотиков 1,5,6,7(Рисунок 1).
Рисунок 1: Зарядка на основе внутри хрящевой доставки КПК. Внутрисумаскулярная инъекция КПК в пространство коленного сустава. Электростатическое взаимодействие между положительно заряженными КЦК и отрицательно заряженными аггреканическими группами обеспечивает быстрое и полное проникновение через хрящ. Эта цифра была изменена из Vedadghavami идр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Недавно, короткой длины катиотических носителей пептида (CPCs) были разработаны с целью создания небольших катиотических доменов, способных нести больших размеров терапии для доставки в отрицательно заряженныйхрящ 4. Для эффективной доставки препарата в хрящ длялечения распространенных 8,9 и дегенеративных заболеваний, таких как остеоартрит (ОА)10, очень важно, чтобы терапевтические концентрации наркотиков проникают глубоко в ткани, где большинство клеток хряща (хондроциты)лежат 11. Хотя Есть несколько потенциальных заболеваний изменения лекарств, ни один из них получили одобрение FDA, потому что они не в состоянии эффективноцелевой хрящ 12,13. Поэтому оценка транспортных свойств носителей наркотиков необходима для прогнозирования эффективности препаратов при индуцировании терапевтического ответа. Здесь мы разработали три отдельных эксперимента, которые могут быть использованы для оценки равновесного поглощения, глубины проникновения и не равновесной скорости диффузииКПК 4.
Для обеспечения достаточной концентрации препарата в хряще, который может обеспечить оптимальный терапевтический ответ, эксперименты поглощения были разработаны для количественной оценки равновесной концентрации КТК вхряще 4. В этой конструкции, следуя равновесию между хрящом и окружающей его ванной, общее количество раствора внутри хряща (либо привязанного к матрице, либо свободного) может быть определено с помощью коэффициента поглощения. Это соотношение рассчитывается путем нормализации концентрации растворим внутри хряща к концентрации равновесия в ванне. В принципе, нейтральные растворы, диффузии которых через хрящ не помогает заряда взаимодействия, будет иметь коэффициент поглощения менее 1. И наоборот, катиотические растворы, транспортировка которых усиливается с помощью электростатических взаимодействий, показывают коэффициент поглощения, более 1. Однако, как показано с CPCs, использование оптимального положительного заряда может привести к гораздо более высоким коэффициентам поглощения (больше, чем 300)4.
Хотя высокая концентрация наркотиков в хряще имеет важное значение для достижения терапевтической пользы, также важно, чтобы препараты рассеиваются через полную толщину хряща. Таким образом, исследования, показывающие глубину проникновения необходимы для обеспечения того, чтобы наркотики достигают глубоко внутри хряща, так что матрицы и клеточных целевых сайтов могут быть достигнуты, тем самым обеспечивая более эффективную терапию. Этот эксперимент был разработан для оценки одной из способов диффузии растворим через хрящ, имитируя диффузию наркотиков в хрящ после внутрисумочковой инъекции in vivo. Флуоресценция изображения с помощью конфокальные микроскопии позволяет для оценки глубины проникновения в хрящ. Чистый заряд частиц играет ключевую роль в модерации, как глубокие наркотики могут распространяться через матрицу. Оптимальный чистый заряд, основанный на ткани FCD, необходим для того, чтобы обеспечить слабо обратимое связывающее взаимодействие между катическими частицами и матрицей анионых тканей. Это означает, что любое взаимодействие достаточно слабо, так что частицы могут отмежеваться от матрицы, но обратимы в природе, так что он может связываться с другой матрицы связывания сайта глубже вткани 4. И наоборот, чрезмерный положительный чистый заряд частицы может быть пагубным по отношению к диффузии, так как слишком сильная матричная привязка предотвращает отслоение частиц от первоначального места связывания в поверхностной зоне хряща. Это приведет к недостаточной биологической реакции, как большинство целевых участков лежат глубоко в ткани11.
Для дальнейшей количественной оценки прочности связывающих взаимодействий, анализ наркотиков диффузии ставки через хрящ является выгодным. Не равновесные исследования диффузии позволяют сравнивать показатели диффузии в режиме реального времени между различными растворами. Поскольку препараты рассеиваются через поверхностные, средние и глубокие зоны хряща, наличие связывающих взаимодействий может значительно изменить скорость диффузии. При взаимодействии между препаратами и матрицей хряща, он определяется как эффективная диффузивность (DEFF). В этом случае, как только все связывающие сайты были заняты, уровень диффузии наркотиков регулируется устойчивым состоянием диффузии (DSS). Сравнение DEFF различных растворов определяет относительную связывающую прочность растворов с матрицей. Для данного раствора,если D EFF и DSS находятся в пределах одного порядка величины, это означает, что существует минимальное связывание настоящее время между препаратом и матрицы во время диффузии. Однако,если D EFF больше, чем DSS, существенное связывание частиц с матрицей существует.
Разработанные эксперименты индивидуально позволяют характеристику растворимого транспорта через хрящ, однако, целостный анализ с включением всех результатов требуется для разработки оптимально заряженных наркотиков перевозчика. Слабый и обратимый характер взаимодействия заряда контролирует скорость диффузии частиц и обеспечивает высокое равновесное поглощение и быстрое полное проникновение глубины через хрящ. Через эксперименты по равновесному поглощению, мы должны искать носителей, которые показывают высокое поглощение в результате взаимодействия заряда, которые могут быть проверены с помощью не равновесных исследований скорости диффузии. Тем не менее, эти связывающие взаимодействия должны быть слабыми и обратимыми по своему характеру, чтобы обеспечить полно толщину проникновения раствора через хрящ. Идеальный препарат перевозчик будет обладать оптимальным зарядом, который позволяет достаточно сильным связывания для поглощения и высокой концентрации внутри хряща наркотиков, но не слишком сильны, чтобы препятствовать полной толщиныдиффузии 4. Представленные эксперименты помогут в разработке характеристик для на основе заряда ткани ориентации носителей наркотиков. Эти протоколы были использованы для характеристики транспортировки КПКчерез хрящ 4, однако, они также могут быть применены к различным препаратам и носителей наркотиков через хрящ и другие отрицательно заряженные ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Университет получил разрешение на проведение экспериментов с мертвыми тканями. Бычьи суставы были получены на коммерческой основе с скотобойни.
1. Извлечение хряща explant
- Использование скальпеля (#10 лезвия), вырезать и удалить жир, мышцы, связки, сухожилия и все другие соединительной ткани подвергать хрящ из бедренной канавки суставов коленного сустава.
- Используя 3 мм и 6 мм кожные удары, сделать перпендикулярные удары в хрящ для извлечения цилиндрических пробок. Немедленно поместите пробки в отдельных скважинах 48-хорошо пластины, содержащей 500 МКЛ 1x фосфат буферного солевого раствора (PBS) дополняется 1% V / V антибиотик-антимикотический.
- Поместите поверхностную сторону хряща штепсельная вилка лицом вниз в колодец в нарезке приспособление (Рисунок 2). Используя лезвие бритвы, нарежьте штепсельную вилку вдоль поверхности нарезки приспособления, чтобы получить 1 мм толщиной хряща explant, который находится включительно поверхностной зоны. Повторите для каждого хряща штепсельной вилки.
- Храните хрящ explants индивидуально в полипропилевых трубках, содержащих 500 МКЛ 1x PBS, дополненных ингибиторами протеазы (PBS-PI, 1 PI мини-таблетка на 50 мл 1x PBS) при -20 градусов по Цельсию.
- Перед проведением каждого из следующих транспортных экспериментов, оттепель эксплантсодержащих флаконов в течение 30 минут в водяной бане 37 градусов по Цельсию.
Рисунок 2: Специально разработанный нарезки приспособление. Параметры конструкции нарезающего прибора из нержавеющей стали, используемого для нарезки хряща explants диаметром 3 и 6 мм. Пластиковые вставки различной толщины были размещены внутри колодцев для регулировки толщины нарезанных эксплантов. Цилиндрическая булавка из нержавеющей стали диаметром 1 мм использовалась для выталкивать эксплант из арматуры. Все численные значения представлены в мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
2. Равновесное поглощение КПК в хрящевой ткани
- Аккуратно мазок хряща explants (3 мм диа. X 1 мм толщиной.) с деликатной задачей протрите, чтобы удалить избыток 1x PBS от explant поверхности. Используя баланс, быстро записывать мокрый вес каждого explant, а затем сразу же поместить в ванну 1x PBS для предотвращения обезвоживания.
- Подготовь 30 решений мкм (300 йл на эксплант) флуоресцентно помеченных КПК в 1x PBS-PI. Для восстановления используйте полипропиленые трубки без RNase.
- В пластине из 96 скважин пипетка 300 МКЛ каждого 30 КТК раствора в отдельные скважины. Избегайте использования скважин вблизи края пластины, чтобы предотвратить испарение. Используя шпатель, перенесите каждый эксплант в раствор, содержащий скважины.
- Заполните окружающие скважины 300 МКЛ 1x PBS и накройте плиту скважины крышкой. Печать края пластины с гибкой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение.
- Внутри инкубатора 37 градусов по Цельсию поместите пластину на шейкер пластины, чтобы ограничить осаждение частиц. Инкубация в течение 24 ч при мягком вращении (50 об/мин с орбитой 15 мм), чтобы обеспечить равновесное поглощение КФУ вхряще (рисунок 3).
- Создание стандартной кривой корреляции флуоресценции с концентрацией КТК
- Подготовка серийных разбавлений растворов КТК от 30 МКМ - 0 МКМ (10 2-кратного разбавления) в 1x PBS-PI в полипропилевых трубках. Убедитесь, что по крайней мере 500 йл каждого разбавления присутствует.
- Добавьте 200 мкл каждого разбавления к последовательным скважинам в черной пластине 96 скважин. Дублируйте в другом ряду, чтобы увеличить размер выборки.
- Получить показания флуоресценции каждого образца с помощью считывателя пластин на возбуждение и выброс длин волн флуоресцентной этикетки с помощью считывателя пластин.
- Участок флуоресценции чтения против концентрации КПК и получить уравнение для линейной части кривой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ограничить изменчивость показаний флуоресценции, инкубировать cpc фондовый раствор в тех же условиях, что и образец пластины до генерации стандартной кривой.
- После 24 ч инкубации, собирать равновесную ванну из каждой хорошо в отдельных полипропилевых труб.
- Перенесите 200 мкл каждого раствора в отдельные скважины из черной пластины из 96 скважин. Получение показаний флуоресценции каждого образца в тех же флуоресцентных настройках, что и для стандартной кривой. При необходимости разбавляйте образец в 1x PBS-PI, чтобы показания подпадают под линейную часть стандартной кривой.
Рисунок 3: Схема экспериментов по равновесному поглощению. Хрящ explants (3 мм диа. х 1 мм толщиной) были помещены в отдельных скважин в 96-хорошо пластины, содержащие флуоресцентно помечены раствор КТК. После 24 ч КПК были поглощены хрящом, тем самым уменьшая флуоресценцию окружающей ванны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
3. Глубина проникновения КПК в хрящ
- Подготовь 30 решений мкм (300 йл на эксплант) флуоресцентно помеченных КПК в 1x PBS-PI. Для восстановления используйте полипропиленые трубки без RNase.
- Используя скальпель, вырезать хрящ explants (6 мм диаметром х 1 мм толщиной) пополам, чтобы сделать половину дисков. Держите explant гидратированных с слоем 1x PBS-PI при резке.
- Клей половину диска explant в середине одного колодец специально разработанных 1-мерной транспортной камеры с использованием эпоксидной смолы (Рисунок 4, Рисунок 5). Убедитесь, что эпоксидная смола наносится на окружной (изогнутой) стороне экспланта. Удалить избыток клея из колодец, чтобы предотвратить контакт с областью поверхности диффузии хряща и сделать к сведению поверхностную сторону explant.
- Добавьте 80 МКЛ 1x PBS-PI к обеим сторонам экспланта. Pipette жидкости вверх и вниз с одной стороны explant, чтобы проверить на утечку на другую сторону. Если утечка происходит, скорректировать explant и применять эпоксидной смолы по мере необходимости.
- Замените 1x PBS-PI сбоку, обращенной к поверхности хряща (вверх по течению) с 80 йл 30 КТК раствора. Поддерживайте 80 мкл 1x PBS-PI на стороне, обращенной к глубокой зоне хряща (вниз по течению).
- Аккуратно поместите транспортную камеру в покрываемый контейнер. Накройте основание контейнера слоем 1x PBS, чтобы избежать испарения растворов. Убедитесь, что нет прямого контакта между решениями из камер вверх по течению и вниз по течению.
- Поместите крытый контейнер на шейкер тарелки, чтобы ограничить осаждение частиц. Инкубация для 4 или 24 ч при комнатной температуре при мягком вращении (50 об/мин с орбитой 15 мм).
- После инкубации снимите эксплант из камеры и вырежьте ломтик 100 мкм из центра экспланта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это сечение включено в поверхностные, средние и глубокие зоны хряща. - Поместите ломтик между стеклянной горкой и крышкой. Гидрат ломтик слоем 1x PBS-PI.
- При увеличении в 10 раз, изображение через полную толщину ломтика, чтобы получить z-стек флуоресцентных изображений с помощью конфокального микроскопа.
- С помощью ImageJ проецируйте среднюю интенсивность изображений в z-стеке, чтобы определить глубину проникновения КПК в хрящ.
- Откройте стек изображений, нажав на файл Открыто.
- Нажмите на' Изображение' на планку задач и нажмите изображение Стеки Проект из меню высадки.
- Ввод среза номера от 1 до окончательного ломтика. Выберите'Средняя интенсивность'под типом проекции. Нажмите'OK.'
Рисунок 4: Специально разработанная 1-D транспортная камера. Параметры проектирования транспортной камеры PMMA 1D с 6 отдельными скважинами. Все численные значения представлены в мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Схема глубины исследований проникновения. Хрящи explants (6 мм диаметром х 1 мм толщиной) были разрезаны пополам и закреплены в центре 1-D диффузных транспортных скважин. Флуоресцентно помеченный раствор КТК был добавлен в сторону колодеца в контакте с поверхностной зоной (СЗ) хряща. 1x PBS-PI был добавлен в сторону хорошо в контакте с глубокой зоной (D) хряща. После диффузии поперечное сечение хряща (3 мм х 1 мм) было изображено с помощью конфокальные микроскопии. Эта цифра была изменена с Vedadghavami et al.4 и Bajpayee et al.3 Пожалуйста, нажмите здесь,чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
4. Не равновесный уровень диффузии КПК в хряще
- Принесите две половинки специально разработанной транспортной камеры(рисунок 6) вместе, чтобы собрать и закрыть камеру. Используйте шайбы, гайки и болты, чтобы плотно закрыть камеру гаечным ключом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортная камера должна быть полупрозрачной, чтобы не вмешиваться в флуоресцентные показания. Транспортные камеры, используемые в этом протоколе, изготовлены из полиметилметакрилата (PMMA). - Пальто внутреннее пространство камеры с 0,5% ж / в обезжиренное бычье молоко раствор в 1x PBS (2 мл для каждой камеры) в течение 15 минут, чтобы предотвратить неспецифическое связывание CPCs к стенкам камеры. Затем промойте камеру 1x PBS (2 мл для каждой камеры).
- Используя специально разработанный нарезки приспособление (Рисунок 2) и лезвие бритвы, ломтик 6 мм диаметром хряща explant (поперечная плоскость) до толщины 500-800 мкм, включая поверхностную зону. Держите explant гидратированных с 1x PBS.
- Используя управляемые молотком и кожные удары, создавайте прокладки из резиновых листов, как показано на рисунке 7.
- Соберите каждую половину транспортной камеры, чтобы включить 1 большую резиновую прокладку, 1 вставку PMMA и 1 небольшую резиновую прокладку каждый. Поместите explant в колодцы пластиковой вставки, с поверхностной зоной, обращенной к камере вверх по течению. Сэндвич две половинки вместе, чтобы завершить сборку и винт плотно с помощью гаечного ключа (Рисунок 7).
- Заполните вверх по течению камеры с 2 мл 1x PBS-PI и наблюдать вниз по течению камеры для утечки жидкости из вверх по течению камеры. При необходимости утечки собери камеру, регулируя положение прокладки и герметичность винтов. Если нет утечки, заполните вниз по течению камеры с 2 мл 1x PBS-PI, а также.
- Добавьте мини-бар как вверх, так и вниз по течению камеры и поместите камеру на тарелку перемешать. Выровняйте камеру так, чтобы лазер из спектрофотометра был направлен к центру камеры ниже по течению. Поместите часть приемника сигнала спектрофотометра за камерой вниз по течению(рисунок 8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер и приемник спектрофотометра должны быть оснащены соответствующими фильтрами для возбуждения, испускают и передают сигналы от флуоресцентно помеченного белка. Защитите транспортную камеру от света с помощью черного ящика во время экспериментов, чтобы избежать вмешательства в сигнал флуоресценции. Это лучшая практика, чтобы запечатать отверстия на верхней части камеры с гибкой пленкой, чтобы избежать испарения. - Соберите в режиме реального времени вниз по течению показания выбросов флуоресценции и обеспечить стабильный сигнал, по крайней мере 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquots из камеры вниз по течению могут быть получены и оценены для флуоресценции с помощью считывателя пластин, если специально разработанный спектрофотометр или полупрозрачная транспортная камера не доступна. - Pipette предварительно рассчитанный объем запасного раствора флуоресцентно помеченных КПК в камеру вверх по течению, чтобы обеспечить окончательную концентрацию 3 МКМ внутри камеры вверх по течению. Наблюдайте сигнал флуоресценции вниз по течению и позвольте растворить транспорт для достижения устойчивого увеличения наклона.
ПРИМЕЧАНИЕ: толще хряща explant потребуется больше времени, чтобы достичь стабильного состояния. - Как только устойчивое состояние будет достигнуто, возьмите 20 МКЛ из камеры вверх по течению и добавьте в камеру вниз по течению ("тест шипа").
ПРИМЕЧАНИЕ: Будет наблюдаться всплеск флуоресценции ниже по течению. Это позволит обеспечить корреляцию между показаниями флуоресценции и концентрацией КПК. - Сбор в режиме реального времени вниз по течению флуоресценции показания.
Рисунок 6: Специально разработанная не равновесная транспортная камера диффузии. Параметры проектирования транспортной камеры PMMA, не равновесной диффузии. Камера должна быть полупрозрачной, чтобы не вмешиваться в показания флуоресценции. Полная транспортная камера состояла из двух одинаковых половинок показанного прибора. Для обеспечения выравнивания и полного закрытия половинок камеры требовалось два цилиндрических штыря из нержавеющей стали диаметром 2,94 мм, длиной 18 мм. Четыре одинаковых слота для 6-32 нитей винты были сделаны в каждом углу камеры для винта жесткой сборки. Все численные значения представлены в миллиметрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Ассамблея не равновесной диффузионные транспортные камеры. Параметры конструкции (A ) черныевставки PMMA и ( B )большиеи малые резиновые прокладки. Толщина резиновых прокладок была скорректирована, чтобы обеспечить плотное закрытие камеры. Все численные значения представлены в мм.(C) Схема,показывающая порядок сборки для двух половинок транспортной камеры с хрящевым эксплантом, помещенным в центр. СЗ указывает на поверхностную зону хряща, которая обращена к камере вверх по течению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Схема не равновесных экспериментов по диффузии. В центре транспортной камеры были размещены экспланты хряща (6 мм диаметром х 1 мм толщиной) с поверхностной поверхностью, обращенной к камере вверх по течению. Оба вверх и вниз по течению стороны камеры были заполнены 1x PBS-PI и смешанные с помощью мини-бар перемешать. С лазером указал на камеру вниз по течению для сбора флуоресцентных показаний, флуоресцентно помечены решение КТК был добавлен в вверх по течению камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После равновесного поглощения КФУ хрящом, флуоресценция ванны уменьшается, когда раствор был поглощен тканью. Однако, если значение флуоресценции конечной ванны остается похожим на начальное, это указывает на отсутствие/минимального раствора поглощения. Еще одним подтверждением solute поглощения, если ткань заметно изменил цвет цвета флуоресцентного красителя. Количественное поглощение растворимых растворов в хряще было определено с использованием коэффициента поглощения (RU)после того, как значения флуоресценции были преобразованы в концентрацию с использованием стандартной кривой. Используя начальную концентрацию ванны (CBath,i)и равновесную концентрацию ванны (CBath), растворимая концентрация внутри хряща (CХрящ) была рассчитана следующим образом, где VВаннаNo 300 йл:
Использование Cхряща и Cванны, коэффициент поглощения был определен с помощью уравнения ниже.
Значения «gt;gt;1» указывают на повышенное поглощение за счет взаимодействия зарядов, в то время как значения lt;1 указывают на низкое поглощение. Например, более крупные, нейтральные растворы, такие как Neutravidin (60 kDa, pI 7) показали RU lt;1из-за стериций, препятствующиххрящевой матрице 1, в то время как меньшие, нейтральные растворы, как ожидается, покажут RUNo1, так как они способны распространяться в хрящ, достигая равновесия. В отличие от этого, Avidin (pI 10.5), положительно заряженный аналог Neutravidin, показал RU180 вхряще 1. Кроме того, малоразмерные КПК (2,5-4 кДа) показывают RU до 4004. Как показано на рисунке 9, коэффициенты поглощения показали заряд зависимых ответ4.
Рисунок 9: Репрезентативные результаты равновесного поглощения КПК в хряще. CPCs различной чистой зарядки (No 8, No 14 и No 20) и их соответствующие коэффициенты поглощения в хряще показали, что поглощение не увеличивается монотонно с увеличением заряда. Эта цифра была изменена из Vedadghavami и др.4 Пожалуйста,нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
В случае, если флуоресценция ванны увеличилась после достижения равновесия, это будет означать, что начальная концентрация ванны флуоресцентно помечены раствор был слишком высок. Это приведет к выбросу в ловушке в растворе после возбуждения через считыватель пластин. Чтобы решить эту проблему, снизить начальную концентрацию ванны.
После конфокальных изображений, стопка изображений была произведена с каждым изображением, показывающим глубину проникновения флуоресцентно помеченных CPCs в разных слоях хряща. Изображение, полученное из центра хряща explant показал самую дальнюю глубину проникновения по сравнению с любым другим изображением по всей толщине explant. Используя программное обеспечение, как ImageJ, стек изображений был наложен на производство одного изображения, отображающих среднюю интенсивность проникновения КПК. Эти наложенные изображения обеспечили наилучшее сравнение общей глубины проникновения между различными заряженными носителями наркотиков. Реакция, зависящая от заряда, наблюдалась для КПЦ в тканях(рисунок 10). Крупные нейтрально заряженные носители (например, Neutravidin) не будут проникать гораздо дальше, чем поверхностная зона, поскольку они не имеют возможности использовать взаимодействия заряда, чтобы вызвать связывание сматрицей 1. Аналогичным образом, слишком высокий положительный заряд будет ограничен поверхностной зоной (как показано на CPC-20 даже после 24 ч)4,однако, это результат того, что перевозчик слишком сильно привязан к матрице; они не могут отсоедить от своей первоначальной цели. Оптимально заряженный перевозчик наркотиков, однако, сможет проникнуть в глубокие зоны хряща, поскольку он может воспользоваться слабым и обратимым характером электростатических взаимодействий (как показано на CPC-14)4. Это позволяет перевозчику связываться со своей первоначальной целью, unbind двигаться глубже через матрицу, а затем снова связываться с целями дальше внутри ткани. Например, Avidin (диаметр 7 нм, 66 кДа, pI 10.5) связывание с отрицательно заряженной матрицей гликозаминогликанов (GAGs) имеет разобщенную константу (KD) 150 МКМ, которая считалась достаточно слабой, чтобы обеспечить реверсивное связывание, необходимое дляпроникновения полной толщины 1. Несмотря на слабую привязку, Avidin показал высокую задержку и поглощение хряща из-за наличия высокой плотности отрицательно заряженных ГАГ (связывающая плотность NT и 2900 МКМ)1. Кроме того, как показано на CPC-8, полное проникновение толщины было видно в пределах 4 ч, в то время как CPC-14 требовало 24 ч, чтобы достичь полнойглубины 4. Таким образом, несколько точек времени должны быть выбраны для эффективного сравнения скорости различных растворов при проникновении толщины тканей. Для более количественного понимания глубины проникновения, относительная итензивности растворов по толщине ткани могут быть получены с помощью ImageJ.
Рисунок 10: Репрезентативные результаты из глубины исследования проникновения в хрящ. КТК различной чистой зарядки (No8, No 14 и No20) и их соответствующая глубина проникновения через хрящ показали слабо обратимую привязку, как видно из CPC-8 и CPC-14, что является ключом к полному проникновению глубины. Однако слишком сильная привязка, как это видно на CPC-20, препятствовала проникновению полной толщины. Эта цифра была изменена из Vedadghavami и др.4 Пожалуйста,нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Если во время визуализации внутри хряща не наблюдалось флуоресцентного сигнала, могут присутствовать две проблемы; либо площадь поверхности для диффузии была заблокирована эпоксидной смолой, либо начальная концентрация ванны была слишком низкой, чтобы произвести флуоресцентный сигнал. Чтобы исправить эти проблемы, удалить избыток эпоксидной смолы с поверхностей хряща и увеличить растворимую концентрацию.
Не равновесные транспортные эксперименты диффузии привели к кривой, как показано на рисунке 11. Начальная часть кривой представляет собой растворимое диффузию через хрящ, как solute-матрицы связывания взаимодействия происходят. С увеличенным зарядом несущей, более сильное связывание матрицы произошло которое приведет к в более длиннем времени для solutes достигнуть вниз по течению камеру. После того, как растворы проникли через глубину хряща и достигли вниз по течению камеры, увеличение склона кривой наблюдалось, как флуоресценция чтения увеличилось с течением времени. Вторая часть кривой достигла устойчивого наклона, что представляет собой диффузию стабильного состояния. На склоне стабильного состояния была нарисована касательная линия для определения времени,Lagнеобходимого для достижения диффузии стабильного состояния (ЛАГ), отмеченной x-перехватом. Эффективная диффузивность (DEFF), скорость диффузии КФУ при одновременном связывании взаимодействий, присутствующих в хряще, была рассчитана с использованием лаг и толщина экспланта (L) следующим образом:Lag
После переноса 20 МКЛ раствора из выше по течению в камеру ниже по течению наблюдался всплеск флуоресценции; полученная стабилизированная интенсивность флуоресценции использовалась для корреляции с концентрацией. Концентрация КФУ в нижнем течении (CD) нормализовалась до концентрации вверх по течению (CU) затем была построена со временем. Наклон этой кривой был использован для оценки скорости диффузии стабильного состояния, когда все связывающие участки хряща заняты (DSS), как показано ниже. Это значение было включено в коэффициент секционирования. Здесь φ, VD и A представляют пористость хряща (0,8), объем камеры вниз по течению (2 мл) и поперечную область хряща (0,1257см 2), соответственно. Значения представителя DEFF и DSS, рассчитанные на основе не равновесных транспортных экспериментов для КПК, можно найти в таблице 1.
Рисунок 11: Репрезентативные результаты не равновесных исследований диффузии через хрящ. Кривая диффузии КТК-8, построенная как нисходящая концентрация (CD),нормализуется до концентрации вверх по течению (CU),со временем. Тангенциальная линия, нарисованная на наклоне устойчивого состояния (синий), пересекает х-ось в йЛаге,которая использовалась для расчета DEFF. Склон касательной был использован для расчета DSS. Тест шипа (серый) представляет собой стабилизированную концентрацию в камере ниже по течению после переноса раствора КТК 20 КЛ из вверх по течению вниз по течению, используемого для нормализации концентрации вниз по течению. Эта цифра была изменена из Vedadghavami и др.4 Пожалуйста,нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Если флуоресценция вниз по течению не стабилизируется до добавления флуоресцентно помеченного пептида в камеру вверх по течению, вполне вероятно, что есть растворимый остаток застрял на стенах от предыдущего эксперимента. В этом случае, разобрать камеру и мыть с мылом и sonicate. Если есть увеличение флуоресценции вниз по течению сразу же после добавления флуоресцентно помечены пептид в камеру вверх по течению, это может означать, что утечка присутствует. Это потребует повторной сборки транспортной камеры и повторного тестирования на утечки. Если сигнал флуоресценции вниз по течению достигает плато, в отличие от постоянного увеличения состояния, это указывает на возможную потерю концентрации в камере вверх по течению, вероятно, вызванную растворами, прилипащими к стенам камеры. Добавление 0,005% ж / V бычьей сыворотки альбумин (BSA) в камеру вверх по течению может помочь предотвратить прилипание.
| Cpc | DEFF (см2/с) | DSS (см2/с) |
| КТК-8 | 1,7 х 0,4 х 10-7 | 5,8 х 0,0 х 10-5 |
| КТК No14 | 9.8 й 0.2 x 10-8 | 2,6 х 1,2 х 10-5 |
| КТК-20 | 4,7 х 0,1 х 10-8 | 1,4 х 0,9 х 10-5 |
Таблица 1: Представитель DEFF и DSS значения для перевозки КТК через хрящ. Эта таблица была изменена из Vedadghavami и др.4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь методы и протоколы имеют важное значение для области целевой доставки лекарств в отрицательно заряженные ткани. Из-за высокой плотности отрицательно заряженных аггреканов, присутствующих в этих тканях, создается барьер, тем самым предотвращая наркотики от достижения их клеточных целевых участков, которые лежат глубоко в матрице. Для решения этой неоплаченной задачи, препараты могут быть изменены, чтобы включить положительно заряженных носителей наркотиков, которые могут повысить скорость транспортировки, поглощения исвязывания препаратов в тканях 1,,3,,4,,14, 15,,14,16,,17,,18,19. Как показано здесь с помощью разработанных методов, транспортировка положительно заряженных носителей наркотиков может быть охарактеризована для определения равновесного поглощения, глубины проникновения и не равновесной скорости диффузии. Мы успешно разработали три отдельные экспериментальные установки, которые могут быть использованы для оценки транспорта через хрящи explants.
Для успешной характеристики транспорта необходимо предпринять важные шаги в этой процедуре. Использование ингибиторов протеазы (ИП) во всех решениях имеет решающее значение для точной характеристики внутри хрящевой транспортировки КЦП через хрящ, поскольку они функционируют для предотвращения ферментативного переваривания белков втканях 20. Поэтому, если не использовать, хрящ матричные компоненты, такие как аггреканы и коллаген может начать деградировать и выделяется в окружающую ванну во время экспериментов. Это может значительно снизить FCD хряща, уменьшая количество заряда основе связывания сайтов в матрице хряща. Полученная ткань больше не будет репрезентативной для здорового хряща. И наоборот, эксперименты, представленные также могут быть использованы для оценки транспортировки КПК через артрит хряща, где содержание аггрекан гораздо ниже, как видно изОА 20. Используя трипсин или хондроитиназы ABC для переваривания хряща explants, аггрекан плотность может контролироваться, тем самым позволяя для оценки транспорта и доставки наркотиков в больном состоянии. В этом случае привязка на основе заряда может быть нарушена, в то время как другие типы взаимодействий, такие как водородные связи и гидрофобные взаимодействия синергетически усиливают внутри хрящевую привязку иудержание 4.
Поддержание гидратации хряща explant является ключевым во время подготовки образца и экспериментов. Обезвоживание через воздействие воздуха в течение более 6 минут было показано, чтобы вызвать необратимые повреждения суставного хряща21. В результате могут произойти неожиданные изменения в транспортировке КПК. Аналогичным образом, испарение ванн КТК может привести к обезвоживанию растений; это можно предотвратить путем запечатывания с гибкой пленкой. Тем не менее, испарение ванны может не только вызвать обезвоживание explant, но это также может привести к изменению концентрации ванны КПК, что приводит к ложным флуоресцентным показаниям. Кроме того, важно отметить, что глубина исследований проникновения требует тонких поперечных сечений (100 МКМ) хряща, которые должны быть изображены. Это метод, который требует практики, так что ломтики равномерной толщины могут быть получены. Это также имеет решающее значение для не равновесных диффузионных экспериментов, что транспортная камера будет полупрозрачной, так что в режиме реального времени флуоресценции измерения могут быть получены с помощью специально разработанного спектрофотометра. Однако в качестве альтернативы можно получить и оценить алициты из камеры ниже по течению для флуоресценции с помощью считывателя пластин или другого спектрофотометрического считывателя.
Методы, представленные здесь имеют большое значение, поскольку они обеспечивают скамейке масштаба метод для характеристики наркотиков перевозчика транспорта через хрящ, с тем чтобы лучше предсказать in vivo удержания наркотиков и долгосрочной биологической эффективности. Недавно была внедрена конечная элементная основа для динамики вычислительной жидкости для измерения растворимого транспорта с помощью пористыхсредств массовой информации 22. Arbabi et al. использовали анализ конечных элементов в сочетании с экспериментальными данными, полученными из микро-КТ-изображений, для измерения скорости диффузии отрицательно заряженного контрастного агента,иоксаглата в хряще 23,,24. Кроме того, с помощью многозонной, многофазной модели, коэффициенты диффузии иоксаглата в различных зонах хряща были измерены вместе с FCD каждой зоны. В то время как микро-КТ изображения могут быть использованы только с контрастными агентами, наша экспериментальная установка позволяет для характеристики транспортировки всех препаратов и носителей наркотиков, которые могут быть флуоресцентно помечены. Тем не менее, передовые вычислительные моделирования, используемые Arbabi и др. обеспечивает более всеобъемлющий анализ растворимого поведения транспорта и могут быть применены кнашим экспериментальным методам 13,24.
Ограничение представленного метода заключается в том, что экспериментальная установка для каждого растворимого транспортного эксперимента не в полной мере охватывает среду in vivo. Биологические реакции и механические и динамические силы, которые происходят в естественном суставе, не моделируются здесь. Чтобы включить эти силы, транспортная камера может быть изменена с поршнем для имитации конвективных моделей потока, которые происходят во время деятельности, как ходьба и бег. Однако, в то время как конвективный поток может увеличить поглощение в 2 раза, поглощение за счет электростатических взаимодействий может увеличиться в 100-400 раз. Таким образом, представленные здесь экспериментальные установки дают хорошую оценку на основе заряда транспорта и поглощения25. Кроме того, поскольку коленный сустав естественным образом содержит синовиаловую жидкость, его можно использовать в растворах ванны для транспортных экспериментов вместо 1x PBS-PI. Подсчитано, что поглощение катионных носителей в хрящах будет уменьшаться в синовиальной жидкости по сравнению с в 1x PBS из-за присутствия гиалуроновых цепей с отрицательно заряженными группами карбоксила в синовиальной жидкости. Вполне возможно, что катионные носители конкурентоспособно связываются с гиалуронными цепями синовиальной жидкости в дополнение к ГАГам хряща. Тем не менее, плотность отрицательно заряженных групп значительно выше в хрящевой по сравнению с синовиальной жидкости, из-за присутствия как отрицательно заряженных карбоксилированных гиалуронан цепи и сульфатных ГАГ вхряще 15. Таким образом, хотя поглощение в хряще в присутствии синовиальной жидкости будет ниже, чем в 1x PBS, он по-прежнему ожидается сохранить высокий внутри хрящевого поглощения. In vivo, Avidin показал высокое поглощение внутри хряща в обоих крыс и кролика хряща в присутствии синовиальнойжидкости 16,26. Кроме того, Avidin показал высокое поглощение и удержание в хряще до 2 недель после внутрисумочной инъекции в кролика передней крестообразной связки трансекциимодели 27.
Использование бычьего хряща в этой системе позволяет более точное представление проникновения препарата через хрящ из-за его сходства с человеческим хрящом с точки зрения толщины (1,5-2мм) 28,29. Транспортировка растворов через хрящ может варьироваться в зависимости от толщины; носители наркотиков может потребовать меньше связывающих взаимодействий, чтобы полностью проникнуть через мышей или крысиного хряща, которые гораздо тоньше, однако может быть значительно затруднено от проникновения глубже втолще человеческого хряща 1. Кроме того, хотя эти эксперименты были разработаны, чтобы охарактеризовать растворимый транспорт в хряще, эти методы могут быть изменены и применены к другим отрицательно заряженных тканей, таких как мениск, роговица и стекловидного тела юмора глаза, и ядро целлюлозы межпозвонковых дисков. Методики экспериментов, разработанных здесь, являются выгодными, поскольку размеры светильников и транспортных камер могут быть адаптированы в зависимости от размера и вида тканей. Воздействие этих методов широко распространено, ограничиваясь не только носителями наркотиков, но и оценкой транспортировки наркотиков и спряжений носителей наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Министерством обороны США в рамках программ медицинских исследований Конгресса (CDMRP) по контракту W81XWH-17-1-0085 и Национального института здравоохранения R03 EB025903-1. AV финансировался стипендией инженерного декана в Северо-Восточном университете.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
References
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238 (2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898 (2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T.
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J.
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125 (2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A.
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882 (2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683 (2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
